Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine In-vitro- Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, aus Fett gewonnene Stammzell- und Spinalganglien- oder DRG-Neuronen-Cokulturen für die Untersuchung der In-vitro-Nervenregeneration zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst undifferenzierte Fettstammzellen aus Rattenfettgewebe gewonnen werden. Im zweiten Schritt werden die Zellen mit Hilfe eines Cocktails aus Wachstumsfaktoren zu schwanähnlichen Zellen differenziert.

Als nächstes werden die DRG-Neuronen aus einem Rückenmark einer Ratte entnommen und im letzten Schritt assoziiert, die Neuronen werden auf die differenzierten Stammzellen gesetzt, um das In-vitro-Co-Kultursystem zu erzeugen. Letztendlich werden die Zellen auf neuronale und gliale Marker gefärbt, um das Neuritenwachstum und die Quantifizierung zu erleichtern, und mittels Rasterelektronenmikroskopie zur morphologischen Beurteilung abgebildet. Diese Methode kann helfen, verschiedene Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, z. B. wie die Fettzelle der richtigen Stammzelle mit den organischen Neuronen auf verschiedenen Biomaterialien interagiert.

Der Grund, warum die Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung ist, da es sich um Schritte handelt, die aufgrund der geringen Zugänglichkeit und der geringen Größe des Gewebes in einem biologischen Schrank schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, mit einer Schere und einer sterilen Rasierklinge das eingeweidete und leistende Fett von erwachsenen männlichen Sprossenratten fein zu hacken, bis es eine feine Konsistenz hat. Übertragen Sie anschließend die resultierende Fettaufschlämmung in ein Röhrchen mit 15 Millilitern frisch zubereitetem Filter, sterilisierter Kollagenase-Typ-1-Lösung und legen Sie ein Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad unter kontinuierlichem Rühren für 30 bis 60 Minuten.

Überwachen Sie die Verdauung genau und stoppen Sie, bevor das Gewebe vollständig dissoziiert ist, um die Lebensfähigkeit und Ausbeute der Zellen zu verbessern. Wenn das Taschentuch fertig ist, filtrieren Sie es durch ein 100-Mikron-Zellsieb. Eine gute Verdauung führt zu einer homogenen Fettkonsistenz, die mit sanftem Schwenken beige erscheint.

Neutralisieren Sie die Verdauungsenzyme mit 15 Millilitern 37 Grad Celsius Stammzellwachstumsmedium, ergänzt mit FBS. Schleudern Sie dann die Zellen ab, um die stromale Gefäßfraktion zu sammeln. Aspirieren Sie das Supinat ausgehend von der obersten Fettschicht.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter ISIS-Puffer der roten Blutkörperchen durch Pipettieren. Stoppen Sie die Lyse nach einer Minute, indem Sie 10 Milliliter frisches, mittleres und zentrifugierendes Protein zu den Zellen hinzufügen. Saugen Sie nun den S-Überstand vorsichtig an.

Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern Medium und säen Sie die Zellen in 75 Quadratzentimetern aus. Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Halten Sie die Zellen bis zur ersten oder zweiten Passage, bei der die Zellen für die Differenzierung in Schwan-ähnliche Zellen bereit sind, auf subkonfluenten Ebenen, indem Sie mit Beta-more-Cap-Ethanol und Retinsäure behandelt werden, um die DRG-Neuronen nach der Entnahme des Rückenmarks zu erhalten.

Beginnen Sie damit, alle dorsalen Teile zu entfernen, und verwenden Sie dann eine sterile und scharfe chirurgische Schere, um die Wirbelsäule entlang der Längsachse in zwei Hälften zu teilen und das Nabelschnurgewebe freizulegen. Schneiden Sie die Wirbelsäule unterhalb des Brustkorbs in zwei kleinere Segmente und entfernen Sie dann mit einer feinen Pinzette vorsichtig das gesamte Nabelschnurgewebe. Achten Sie darauf, die DRG-Wurzeln nicht zu ziehen und zu entfernen, die als weiße Fäden erscheinen, die direkt aus den Kanälen kommen.

Wenn das gesamte Kerngewebe entfernt wurde, ziehen Sie mit einer sehr feinen Pinzette die gesamte DRG-Wurzel tief in die vertretbaren Kanäle und achten Sie darauf, die Wurzeln der Ganglien nicht zu beschädigen. Geben Sie das DRG in eine 60 Quadratmillimeter große Tierbaumschale mit drei bis vier Millilitern Schinken F 12 Medium, zugesetzt mit Antibiotika. Verwenden Sie dann unter einem Präpariermikroskop eine sterile Pinzette und ein Skalpell, um überschüssige Nervenwurzeln, die die Ganglien umgeben, zu entfernen, um die Kontamination der Satellitenzellen zu reduzieren.

Als nächstes wird das DRG in eine 35 Quadratmillimeter große Petrischale mit 1,8 Millilitern frischem F 12-Medium umgefüllt und 200 Mikroliter Kollagenase hinzugefügt. Stammlösung vom Typ vier. Inkubieren Sie das DRG eine Stunde lang und aspirieren Sie das Medium dann vorsichtig mit einer Glaspipette.

Achten Sie darauf, das DRG nicht anzusaugen oder zu beschädigen. Wiederholen Sie den Kollagenase-Schritt und waschen Sie das DRG mit F 12 Medium. Nach der zweiten Wäsche geben Sie 1,8 Milliliter F 12 Medium und 200 Mikroliter Trypsin in die Zellen.

Entfernen des Trypsins und Hinzufügen von einem Milliliter Medium, ergänzt mit 500 Mikrolitern FBS, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Aspirieren Sie dann das Medium und waschen Sie das DRG dreimal vorsichtig mit F 12 Medium, um alle Spuren des Serums zu entfernen. Füttern Sie nun die Zellen mit zwei Millilitern frischem F 12 Medium und überführen Sie die Zellsuspension mit einer Glaspipette vorsichtig in ein 15 Milliliter Röhrchen.

Pipettieren Sie acht- bis zehnmal auf und ab, um die Neuronen sanft zu dissoziieren, und lassen Sie dann den Gaumen am Boden des Röhrchens ansammeln, wenn sich der Gaumen beruhigt hat. Übertragen Sie das Supinat in eine neue Tube und geben Sie zwei Milliliter frisches F 12 medium in den Gaumen. Durch die Wiederholung wird die mechanische Dissoziation und der Medientransfer in die Suspension homogen.

Dann wird die Zellsuspension drei- bis viermal neu bewertet, gefolgt von der Filtration der resultierenden homogenisierten Suspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen, während sie sich langsam drehen, frisch zubereitet. 15 % Rinderserumalbumin in die Innenseite einer 15-Milliliter-Tube, die in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um eine allmähliche Proteinspur zu erzeugen.

Verwenden Sie die Zahlen auf dem Röhrchen als Referenz für die Formspur, saugen Sie dann die Schlinge aus den Zellen ab, sparen Sie die letzten 500 Mikroliter für die Wiederbelebung, suspendieren Sie das Pellet und geben Sie die Zellen entlang der Proteinspur langsam in das neue Röhrchen ab. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter modifiziertem BS-Medium und säen Sie die Zellen in einem kleinen Volumen Medium aus. In einer 24-Well-Platte für zwei Stunden, wenn sich die Zellen anheftet haben, fügen Sie nach der Dissoziation frisches BS-Medium hinzu, das mit 15 Nanogramm pro Milliliter Nervenwachstumsfaktor ergänzt wird.

Die DRG-Zellen können auch für die Co-Kultur mit den Schwanenzell-ähnlichen Fettstammzellen verwendet werden, indem sie auf die Pre-Seed-Zellen ausgesät werden. Diese Bilder zeigen die Bedeutung von Schwan-Zell-ähnlichen Fettstammzellen für das Keimen von DRG-Neuriten in einem Co-Kulturmodell mit Polycaprolacton-Filmen als Substrate. Auf unbehandelten Oberflächen wurden in Abwesenheit von Schwanenzell-ähnlichen Fettstammzellen keine Neuriten beobachtet, während die Bildung der Neuriten im Co-Kultur-System deutlich verbessert war.

Im Durchschnitt steigt die Anzahl der Neuriten pro Zellkörper in Gegenwart von Stammzellen deutlich an. Wie diese Bilder zeigen, tritt die Fähigkeit von DRG-Neuronen, Neuronen zu sprießen, bevorzugt in Verbindung mit differenzierten Stammzellen auf, wie die gelben Pfeile zeigen. Nachdem ich mir dieses Video angesehen habe, sollte ich nun in der Lage sein, Stammzellen aus der Bibliothek zu gewinnen und DGen-Neuronen zu dissoziieren.

Sie sollten aber auch in der Lage sein, ein Modell einzurichten, um die periphere durchschnittliche Degeneration zu untersuchen.