Name: Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Ex-Utero-Elektroporation und organotypische Kultur für die Untersuchung der Hippocampus-Entwicklung bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Markierung und Modifikation einzelner Zellen im Gyrus dentatus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft an SB unterstützt (BR-2215; SFB 497/A9).

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Recht durchgeführt und wurden von den Regierungsstellen in Tübingen genehmigt. 1. Herstellung der Mikropipetten, Lösungen und Membranen <ol><li> Herstellung von Mikropipetten <ol><li> Ziehen Glasmikropipetten mit einer Mikropipette Abzieher mit folgendem Programm: Wärme: 540, Ziehen: 125, Geschwindigkeit: 20 und Delay: 140. Die Nadellänge beträgt 5,5 cm. </li><li> Kegel Nadeln mit einem microgrinder einen geeigneten Spitzengröße von 4 mm zu erhalten. Speichern die Nadeln in einer Box oder 15 cm Petrischale werden Beschädigungen an den Spitzen. </li></ol></li><li> Zubereitung der Lösungen <ol><li> Plasmid-DNA-Lösung <ol><li> Vorbereitung von Plasmid-DNA, die die gewünschte cDNA-Konstrukts unter Verwendung eines Endotoxin-freien Maxi-Prep-Kit nach Herstellerprotokoll. </li><li> Einzustellen Plasmid-DNA-Lösung auf eine Endkonzentration von 3 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l (ohne GFP Spike vector) oder 4 &amp; mgr; g /ul (mit 1 ug GFP Spike Vektor) in endotoxinfreiem Tris-EDTA-Puffer, der Fast Green (Endkonzentration 0,05%). </li></ol></li><li> Laminin Stammlösung <ol><li> Man löst 1 mg Laminin in sterilem Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 ml. Bereiten Sie 100 ul Aliquots und bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-L-Lysin-Stammlösung <ol><li> Man löst 50 mg Poly-L-Lysin in 50 ml sterilem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Bereiten Sie 1 ml Aliquots und lagern in -20 ° C. </li></ol></li><li> Füllen Hanks Balanced Salt Solution (Complete HBSS) <ol><li> Bereiten komplette HBSS durch Kombination von 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES-Puffer (pH 7,4), 30 ml 1 M D-Glucose, 10 ml 100 mM CaCl 2, 10 ml von 100 mM MgSO 4 und 4 ml 1 M NaHCO 3. In sterilem Wasser bis zu 1 l und bei 4 ° C. HINWEIS: Autoklav alle Lösungen erwarten, 1 M HEPES-Puffer und 1 M D-Glucose, die fil sindter sterilisiert. </li></ol></li><li> Slice-Kultur-Medium <ol><li> Bereiten Scheibe Kulturmedium durch Zugabe von 35 ml von Basal Medium Eagle, 12,9 ml komplettem HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-Glucose, 250 &amp; mgr; l von 200 mM L-Glutamin und 500 &amp; mgr; l Penicillin-Streptomycin erhalten ein Endvolumen von 50 ml. Hinzufügen Pferdeserum auf eine Endkonzentration von 5% und bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarosegel <ol><li> Vorbereiten einer 4% LMP Agarose-Lösung durch Zugabe von 2 g des LMP-Agarose auf 50 ml komplettem HBSS (1.2.4), gefolgt von Erhitzen in einer Mikrowelle für 1-2 min bei hoher Leistung. Diese Lösung wird in einem Wasserbad bei 37 bis 39 ° C. Die Lösung ist bei 4 ° C und Wiederverwendung. </li></ol></li><li> Paraformaldehydlösung <ol><li> In einem Abzug bereiten eine 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd in 100 ml 1x PBS. Die Lösung wird auf 60 ° C und ein paar Tropfen 1 N NaOH, bis die Lösung cLear. </li></ol></li><li> Permeabilisierung Lösung <ol><li> Man löst 9 g BSA in 300 ml 1x PBS, enthaltend 0,3% Trition X-100 und bei 4 ° C. Zugabe von 10% Natriumazid für eine Langzeitspeicherung. </li></ol></li></ol></li><li> Beschichtung der Membraneinsätze <ol><li> Verdünne ein Aliquot von Laminin-Stammlösung (1.2.2) und ein Aliquot von Poly-L-Lysin-Stammlösung (1.2.3) in sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 12 ml. </li><li> Platzieren Membraneinsätze in Platten mit 6 Vertiefungen mit jeweils gut mit 2 ml sterilem Wasser. 1 ml der Beschichtungslösung auf die Oberseite der Membran und inkubieren O / N bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach Inkubation die Membraneinsätze dreimal mit 1 ml sterilem Wasser und trocken. Verwenden beschichteten Membran-Einsätze am selben Tag oder bei 4 ° C für bis zu vier Wochen in einem trockenen 6-Well-Platte. </li></ol></li></ol> 2. DNA-Injektion und Elektroporation von E15.5 und E18.5 Embryonen <ol><li&gt; Anesthetize eine Zeit gepaart weiblichen Maus, indem Sie es in eine betäubende Kammer mit 5% Isofluran gesättigten und einem Verdampfer verbunden. Zirkulieren Isofluran und Sauerstoff mit einer Rate von 1 L / min. Halten Sie das Tier in der Box für 2-4 Minuten oder bis zum Unbewussten, die durch Zusammendrücken zwischen den Pfoten der Maus getestet wird. </li><li> Euthanize den bewusstlosen Maus durch Genickbruch an embryonalen Tag (E) 15,5 oder 18,5. Präparieren Sie die Gebärmutter, die die Embryonen 13 und legen Sie sie in eine Petrischale mit 15 bis 20 ml kaltem komplette HBSS. HINWEIS: Von diesem Punkt an, halten Sie die Embryonen und Gewebe auf Eis. </li><li> Verwenden Sie eine Schere, um jeden Embryo aus dem Uterushorn und Ort in eine zweite Petrischale mit kaltem HBSS komplett zu trennen. </li><li> Unter einem Binokular, trennen die Uterusmuskulatur Wand und die Plazenta mit einer feinen Pinzette (# 55) und eine Schere. Vorsichtig lösen, den Embryo aus dem Dottersack. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Bonn Schere decapitate die Embryonen gerade oberhalb der Vorderbeine bei einem Winkel von 60º. Wenn das Experiment erfordert Genotypisierung der Embryonen, sammeln eine Gewebeprobe für die Isolierung genomischer DNA (ein kleines Stück Schwanz). </li><li> Übertragen Sie den Kopf, um eine saubere und trockene Petrischale. Da der Kopf war in einem Winkel von 60 ° enthauptet wurde, sollte der Kopf zur Seite neigen, wenn platziert dorsalen Seite nach oben. </li><li> Platzieren einer Nadel vorsichtig in der Mitte der Halbkugel in der Nähe der Bregma (1A, B). Injizieren etwa 2-3 &amp; mgr; l (bei 3 oder 4 ug / ul) DNA-Lösung, indem er auf das Pedal des Picospritzer III unter Verwendung von 30 Pfund Druck für die Dauer von 10-15 ms pro Impuls Aufbringen 5-8 Impulsen. Die Dauer und die Anzahl der Impulse ist abhängig vom Durchmesser des Nadelöffnung mit kleineren Öffnungen mehr Zeit erfordern. Der Abstand zwischen jedem Impuls beträgt 1 sec. </li><li> Vor dem Einsetzen der Elektroden, ein paar Tropfen von kompletten HBSS auf den Kopf des embryo. Die Elektroden werden in der Weise, daß die &quot;negative&quot; Klemme auf der gleichen Seite wie das injizierte Herzkammer und der &quot;positive&quot; Elektrode, die auf der gegenüberliegenden Seite des eingespritzten Ventrikel unter dem Ohr des Embryos Kopf (1C, D). Bewerben 5 Impulse von 50 V. <ol><li> Verwenden Sie 3 mm Elektroden für E 15.5 und 5 mm Elektroden für E 18.5. </li></ol></li></ol> 3. Präparation des Gehirns <ol><li> Nach der Elektroporation, beim Abziehen der Haut von dem Kopf mit Hilfe einer feinen Pinzette. Verwendung eines Paares von Feder Schere einen kleinen Einschnitt in der Mitte des Kleinhirns an der Mittellinie des Schädels. </li><li> Setzen Sie die Feder Schere in den Einschnitt und geschnitten längs entlang der Pfeilnaht. Ziehen Sie die Schädel und lösen das Gehirn aus dem Schädel durch die Verwendung einer feinen Pinzette. Übertragen Sie das gesamte Gehirn in 15-20 ml kaltem HBSS komplette Lösung. </li><li> Inzwischen pour 4% LMP-Agarose,bei 37-39 ° C in einem Wasserbad gehalten wird, in eine Abzieh-Form. </li><li> Nehmen Sie das Gehirn aus dem kompletten HBSS von einer kleinen Schaufel Spachtel und Abfluss über HBSS mit Hilfe feiner Seidenpapier oder Kimwipes. </li><li> Stellen Sie das gesamte Gehirn sanft in die Agarose und stellen Sie ihre Position mit einer feinen Nadel. Halten Sie die Form auf Eis, bis die Agarose verfestigte und der Block wird geschnitten (für Koronalschnitte die Riechkolben nach oben zeigen). </li></ol> 4. Vibratom Schnitte und Slice-Kultur- <ol><li> Schneiden Sie die LMP-Agarose-Blöcke und kleben sie auf dem Probentisch mit &quot;Superkleber&quot;. Nach der Kleber trocken Übertragung der Probentisch in die Pufferwanne des Vibratom und füllen mit eiskaltem HBSS abzuschließen, bis der Block in die Lösung eingetaucht. HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Instrumenten- und Geräteoberflächen mit 70% Ethanol vor dem Schneiden. </li><li> Bereiten 250 um dicken Vibratom Abschnitte mit einer neuen Klinge wie folgt. <ol><li> Schneiden Sie die Block with folgenden Einstellungen; Frequenz - 60 Hz, Amplitude - 0,7 um, Geschwindigkeit 16-18 mm / sek. Schneiden Sie die Abschnitte, die mit den obigen Einstellungen bei niedriger Geschwindigkeit (9 mm / s) das gewünschte Gewebe. Ab der Schnitt aus dem Hinterhirn, sammeln 5-7 Abschnitte aus dem Großhirn. </li><li> Übertragen Sie die Teile auf ein sauberes 6 Well-Kulturschale mit 5 ml eiskaltem HBSS mit Hilfe eines gebogenen Spatel zu vollenden und zu halten auf dem Eis, bis alle Abschnitte werden gesammelt (1E). </li></ol></li><li> Feuchten Sie die Membran in einem Quer Mode mit 100 ul HBSS komplette, bevor die Abschnitte auf der Membran, um die Ausrichtung der Abschnitte zu erleichtern. </li><li> Übertragen Sie die Abschnitte mit einem gebogenen Spatel auf die Membran (abholen eine Ecke des Abschnitts mit einer Pinzette und ziehen auf den Spatel und dann mit der Zange, um den Abschnitt auf die Membran zu drücken). Legen Sie bis zu fünf Abschnitte auf einer Membran und vereinbaren Sie mit einer Pinzette (1F). Nicht überlappen die Abschnitte miteinander. <ol><li> Nehmen Sie die überschüssigen HBSS von der Membran mit einer Pipette. Die spezifischen Membranen hier sind an einem Rahmen befestigt ist und in das Gewebekulturplatte, die das Gewebe in Kontakt zu sein, aber nicht durch das Mittel bedeckt ermöglicht eingefügt. </li></ol></li><li> Setzen Sie die Membraneinsätze in einen 6 Well-Platte mit 1,8 ml Stück Kulturmedium (1.2.5) (Abbildung 1 G, H). Inkubieren der Kulturschale bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 11 oder 14 DIV DIV. Ändern Sie die Hälfte des Mediums (0,9 ml) jeden zweiten Tag. HINWEIS: In diesem Stadium hinzu Reagenzien wie Bromdesoxyuridin (BrdU; 10 &amp; mgr; M Endkonzentration) für die Kennzeichnung von proliferierenden Zellen zu den Medien für die ersten 20 Stunden der Kulturzeit. </li></ol> 5. Fixierung der Sektionen durch Immunfluoreszenzfärbungen Gefolgt <ol><li> Verwenden Sie eine saubere und scharfe Skalpellklinge zu schneiden und trimmen die Membranen in Abhängigkeit von der Ausrichtung derdie Abschnitte. </li><li> Übertragen der Abschnitte zusammen mit der Membran auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die 1 ml 4% PFA (1.2.7). Inkubiere die Abschnitte für 1 h bei RT, gefolgt von 3 Waschungen mit 1x PBS für je 15 min. Inkubieren der Abschnitte O / N bei Permeabilisierung Lösung bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Am folgenden Tag, Inkubation der Schnitte mit geeigneten primären Antikörper, in Permeabilisierung Lösung verdünnt, O / N oder für 48 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> 3 Mal Waschen Sie die Teile für 15 min mit 1x PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C mit den entsprechenden Sekundärantikörper in Permeabilisierung Lösung verdünnt. </li><li> Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern, waschen Sie die Teile einmal mit 1x PBS für 15 min, gefolgt von DAPI-Färbung für 10 min. </li><li> 3 mal mit 1x PBS Waschen Sie die Teile für 15 min je und übertragen auf Objektträger. Fügen ImmunoMount und sanft legen Sie eine Deckglas Sektionen. Trocknen Sie die Dias O / N bei 4 ° C und seal mit Nagellack. HINWEIS: Halten Sie die Folien immer bei 4 ° C. <ol><li> Analysieren Sie die Schnittkulturen durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1E). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li>
<li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus%3A+what+we+are+learning+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li>
<li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li>
<li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19(2002).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li>
<li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li>
<li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin%3A+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li>
<li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants%3A+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der Hippocampus hat eine wichtige Funktion bei Lernen und Gedächtnis. Gyrus dentatus ist auch einer der beiden Hirnregionen, wo die Neurogenese tritt nicht nur während der Entwicklung, sondern auch im Erwachsenenalter. Die postnatale und adulte Neurogenese erfolgt in ähnlicher Weise mit vielen Gemeinsamkeiten. Definition der Regulierungsmechanismen dieser Faktoren wird sehr hilfreich für das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen, die wiederum zu neuen Therapien und präventive Maßnahmen zu führen. Um diese Informat...

Der Hippocampus spielt eine wichtige Rolle im Gedächtnis und Lernen sowie emotionales Verhalten. Eine Hauptfunktion besteht in der Konsolidierung des Kurzzeitgedächtnisses in das Langzeitgedächtnis, die hohe Plastizität des Nervensystems erfordert. Der Gyrus dentatus des Hippocampus wirkt als primäre Gateway für Eingabeinformation und ist auch einer der beiden Hirnregionen mit laufenden Neurogenese im Erwachsenenalter 1,2. Die Entwicklung der hippocampalen Struktur tritt während der späten Embryogenese und insbesondere während der ersten 3 bis 4 Wochen nach der Geburt 3. Während der frühen Entwicklung des Gyrus dentatus eine Stammzellpools hergestellt für postnatale erforderlich sowie adulte Neurogenese 4. Entwicklung von Nervenzellen durchlaufen verschiedene Stadien, von der Stammzelle über mehrere Stufen der Vorläuferzellen in die unreifen und schließlich reifen Neuronen während der postnatalen und adulten Neurogenese. In verschiedenen Stadien der Neurogenese die Expressionspezifische Gene erforderlich ist, um die Reifung und Integration neuer Neuronen in Hippocampus-Schaltung 5,6 erlauben. Verwendung Mausgenetik und Phänotypanalyse immunhistochemisch sowie molekulare Methoden erlaubt die Definition der Expressionsmuster und Funktion vieler dieser Gene. Neben Microarray-Analyse sowie Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) zur Verfügung gestellten Informationen über potenzielle direkte und indirekte Zielgene 7,8. Allerdings gibt es noch viele offene Fragen über die Regulierungsmechanismen der Hippocampus-Entwicklung, insbesondere die Entwicklung des Gyrus dentatus. Um einen tieferen Einblick, wie spezifische Gene reguliert ein System erforderlich erlaubt die Manipulation von einer kleinen Anzahl von Zellen durch Down- oder Hochregulierung des Gens von Interesse und / oder seinen Zielgenen und folgen ihr Schicksal während der Entwicklung zu erhalten. In utero Elektroporation von shRNAs, cDNA der Gene von Interesse oder Cre recombinase stellt ein solches Werkzeug. Um das Vorhandensein der gewünschten DNA oder kleine RNAs Expressionsplasmide sollte für die Elektroporation verwendet werden, zu gewährleisten. Dieser Ansatz ist erfolgreich bei der Untersuchung kortikalen Entwicklung 9,10 ein herausfordernder Ansatz Untersuchung der Entwicklung des Gyrus dentatus auf Grund der Position der hippocampalen Strukturen tiefer Gehirnschichten implementiert, aber ist. Ex utero Elektroporation gefolgt von organotypischen Kultur ist ein Ansatz, um dieses Problem zu umgehen 11,12. Im Gegensatz zu den in utero Elektroporation nicht den gesamten Embryo aber nur der Kopf verwendet ermöglicht es daher, die Elektroden in einer günstigeren Weise, die shRNA / DNA Richtung Hippocampus und Gyrus dentatus direkt auszulösen. Unsere Gruppe erfolgreich eingesetzt ex utero Elektroporation, um die Rolle des Transkriptionsfaktors BCL11B im Gyrus dentatus Entwicklung 8 studieren. BCL11B hat eine doppelte Funktion Gyrus dentatus Entwicklung regulating Vorläuferzellproliferation und Differenzierung wurde durch Immunhistochemie nachgewiesen. Um einen Mechanismus für BCL11B Einbindung in diesen Prozessen weiter zu definieren, wurden Protokolle des Polleux Gruppe 11,12 eingestellt, um den Gyrus dentatus, wie unten in dem Protokoll beschrieben untersuchen. In einem ersten Ansatz wurde die Frage angesprochen, ob BCL11B regelt neuronalen Zelldifferenzierung Zelle autonom. Ein zweiter Ansatz untersucht, ob Desmoplakin, Direkt Zielgen BCL11B, genügt, um die BCL11B Phänotyp retten.

<table><tbody><tr><td>Flaming/ Brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments Company (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Feinglaspipetten</td><td>Warner</td><td>Instruments G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschleifer</td><td>Narishige, Japan</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiehalterung</td><td>Harvard Apparat</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Vaporizer</td><td>Harvard Apparat</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac System</td><td>Harvard Apparat</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Harvard Apparat</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiekammer</td><td>Harvard Apparat</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette mit Scheibenelektroden</td><td>BEX Firma</td><td>LF650P3</td><td>3 mm Elektroden für E15.5</td></tr><tr><td>Pinzette mit Scheibenelektroden</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>5 mm Elektroden für E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Vibrationsklingenmikrotom, 230 V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Schale</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Dish-CELLSTAR</td><td></td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur-Einsätze</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>#L2020</tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technology</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Life Technology</td><td>Artikel-Nr.: 41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero elektroporation und organotypischen kultur der maus hippocampus-gewebe

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Die Mausgenetik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle bestimmter Gene während der Entwicklung zu bestimmen. Die Analyse der resultierenden Phänotypen mit immunhistochemischen und molekularen Methoden gibt Aufschluss über mögliche Zielgene und Signalwege. Um spezifische Regulationsmechanismen weiter aufzuklären, ist ein System erforderlich, das es ermöglicht, nur eine kleine Anzahl von Zellen eines bestimmten Gewebes entweder durch Überexpression, Ablation oder Wiedereinführung spezifischer Gene zu manipulieren und deren Schicksal während der Entwicklung zu verfolgen. Um dies ex utero zu erreichen, bietet die Elektroporation von Hippocampusstrukturen, insbesondere des Gyrus dentatus, gefolgt von einer organotypischen Schnittkultur, ein solches Werkzeug. Die Verwendung dieses Systems zur Generierung von Mosaik-Deletionen ermöglicht es, zu bestimmen, ob das interessierende Gen zellautonome Entwicklungsprozesse wie die Proliferation von Vorläuferzellen oder die neuronale Differenzierung reguliert. Darüber hinaus erleichtert es die Rettung von Phänotypen, indem es das deletierte Gen oder seine Zielgene wieder einführt. Im Gegensatz zur In-utero-Elektroporation verbessert der Ex-utero-Ansatz die Rate, tiefere Schichten des Gehirns, wie z. B. den Gyrus dentus, erfolgreich zu erreichen. Insgesamt bieten die Ex-utero-Elektroporation und die organotypische Schnittkultur ein wirksames Werkzeug zur Untersuchung von Regulationsmechanismen in einer semi-nativen Umgebung, die endogene Bedingungen widerspiegelt.

Ablation des Transkriptionsfaktors BCL11B verursacht die Beeinträchtigung der Vorläuferzellproliferation und neuronalen Differenzierung, was zu einer reduzierten Gyrus dentatus Größe und die Zellzahl. Darüber mutierten Neuronen nicht in die Hippocampus-Schaltung verursacht Lern- und Gedächtnisstörungen 8 zu integrieren. Um Fragen bezüglich der regulatorischen Mechanismus (n) des BCL11B in diesen Prozessen ex utero Elektroporation beschäftigt war zu beantworten. Antworten ...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Zellen des Gyrus dentatus zu markieren und zu modifizieren sowie deren Entwicklung zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA in die eine Hirnhemisphäre am embryonalen Tag 15,5 oder 18,5 injiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die injizierte DNA mittels Elektroporation in den sich entwickelnden Bereich des Gyrus dentatus einzubringen.Anschließend werden Gehirnschnitte mithilfe eines Vibratoms hergestellt, und die Gehirnschnitte werden bis zu 14 Tage lang in Kultur gehalten. Der letzte Schritt ist die immunfluoreszenzmarkierte Färbung der Gehirnschnitte mit geeigneten Antikörpern. Abschließend wird die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um Veränderungen der modifizierten Granulazellen des sich entwickelnden Gyrus dentatus darzustellen.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in der Neurobiologie beantworten, beispielsweise welche Rolle spezifische Gene bei der Entwicklung bestimmter neuronaler Zellen in verschiedenen Hirnarealen spielen. Im vorliegenden Fall: der Transkriptionsfaktor BC 11 B bei der Entwicklung des Gyrus. Beginnen Sie das Verfahren mit der Dissektion des Ute

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die...

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

Quelle: Keener, D. G., et al. Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Schnittkulturen von erregenden und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen des Hippocampus der Maus. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video zeigt den Prozess der Einzelzell-Elektroporation, um Plasmid-DNA in Neuronen in hippokampalen Schnittkulturen von Mäusen einzuführen. Das Verfahren umfasst eine präzise Pipettenpositionierung, Druckanpassungen und Elektroporationsimpulse, um die neuronale Membran...

Genexpression durch Einzelzell-Elektroporation in hippokampalen Schnittkulturen der Maus

Dieses Video zeigt das Protokoll für die Einzelzell-Elektroporation von Genen sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen in einer Reihe von in vitro hippokampalen Schnittkulturen. Die Technik ist nützlich, um spezifische molekulare und physiologische Funktionen von Neuronen zu untersuchen, einschließlich zellautonomer Mechanismen und transsynaptischer Proteininteraktionen.

Einzelzell-Elektroporation in organotypischen Hirnschnittkulturen: Eine In-vitro-Technik zur Verabreichung von Plasmiden in Zielneuronen in Hippocampus-Schnitten des Gehirns

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das...

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Erfahren Sie die Ex-Utero-Elektroporation und organotypische Kultur für die Untersuchung der Hippocampus-Entwicklung bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Markierung und Modifikation einzelner Zellen im Gyrus dentatus.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Weitere Videos entdecken