Name: Busulfan als myelosuppressiven Agenten zur Erwirtschaftung stabiler Hochrangige Knochenmark Chimärismus bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Busulfan eine nicht-irradiative Knochenmarktransplantation bei Mäusen durchführen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung hämatopoietischer Zellen im Zentralnervensystem.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (an KP) und ein Neuromuscular Research Partnership Program Stipendium von der CIHR, der ALS Society of Canada und Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) an CK und FMR. Zusätzliche Unterstützung wurde auch von der ALS Society of America (57969) geleistet. Wir möchten uns bei Dr. R. Keith Humphries vom Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Kanada, und den Mitarbeitern der Simon Fraser University Animal Care Unit bedanken.

HINWEIS: Ethikerklärung: Dieses Protokoll wurde überprüft und von der Animal Care Committee der Simon Fraser University zugelassen (UACC; erlauben Zahlen 1037K-12 und 1060K-03) und ist in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care, der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der EWG Richtlinie. 1. Spezielle Überlegungen HINWEIS: Busulfan ist zytotoxische. Behandeln und entsorgen Sie nach dem Sicherheitsdatenblatt und institutionellen Richtlinien. <ol><li> Führen Sie alle Techniken aseptisch in einer Sterilbank. </li><li> Sterilisieren von Instrumenten vor der durch Wickeln in einer geeigneten Verpackung, beispielsweise einer abziehbaren Verpackung und Autoklavieren zu verwenden. </li><li> Während das Risiko für eine Infektion mit niedriger Busulfan Anlage gegenüber Bestrahlung, Griff Tieren nur in einer laminaren Strömungshaube für die ersten 2 Wochen nach der Transplantation. </li></ol> 2. KonditionierungEmpfänger Mäuse <ol><li> Verdünne Busulfan bis 3 mg / ml mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ml. HINWEIS: Es ist wichtig, um eine frische Verdünnung von Busulfan kurz vor jeder Tag der Injektion verwendet werden. </li><li> Verwalten Sie 20 mg / kg des verwässerten Busulfan auf Empfängermäuse über IP-Injektion täglich. </li><li> Täglich wiederholen IP-Injektionen von 20 mg / kg Busulfan, bis zu einer Gesamtdosis von 60-100 mg / kg abgegeben wurde (dh für eine 80 mg / kg Gesamtdosis verabreichen 20 mg / kg Busulfan für 4 aufeinanderfolgende Tage). </li></ol> 3. Isolierung von Spenderknochenmarkzellen HINWEIS: Dieses Protokoll wurde erfolgreich zur Isolierung und Vorbereitung BM-Zellen von bis zu 5 Spendermäusen eingesetzt. Typischerweise wird die Zellausbeute pro Maus etwa 30 bis 40.000.000 BMDCs, die ausreicht, um 12 bis 16 Empfängermäuse verpflanzen ist. Wenn mehr Donormäusen benötigt das Protokoll müssen entsprechend angepasst werden. <ol><li> Nach dem letzten Tag der Busulfan Anlage EuthAL TEN ein GFP Spendermaus (1-6 Monate) mit CO 2 (oder von anderen Euthanasie-Verfahren bei Hochschule angenommen). Zur Vermeidung von Transplantat Komplikationen verwenden syngenen Spendern, die das gleiche Geschlecht wie die Empfänger sind. </li><li> Spray-Maus mit 70% Ethanol. Fahrstuhl Haut an den Bauch und mit chirurgische Scheren einen Einschnitt durch die Haut aus der Bauchhöhle bis das Bein auf die Knöchel. Halten Sie den Fuß fest ziehen Sie die Haut vom Knöchel zur Hüfte Freilegung der Beingewebe. </li><li> Schneiden Sie Muskel- und Fettgewebe aus dem Oberschenkelknochen, das Hüftgelenk aus. </li><li> Langsam nach unten auf den Fuß, das Bein zu verlängern, drücken Sie die Schere gegen das Hüftgelenk. Schneiden Sie gerade über dem Kopf des Oberschenkelknochens kümmert sich nicht um den Oberschenkelknochen selbst geschnitten. </li><li> Zur Aufrechterhaltung der Sterilität, halten Sie das Bein mit dem Fuß, und reinigen Sie alle verbleibenden Gewebe von den Knochen durch Reiben der Knochenoberfläche mit autoklaviert Gewebe. </li><li> Trennen Sie die Oberschenkel und Schienbein durch Schneiden durch das Kniegelenk undlegen Sie das Femur in einer Kulturschale mit steriler PBS. Auf Eis inkubieren. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie das Wadenbein, indem an den Stellen, wo das Wadenbein verbindet sich mit dem Schienbein. Legen Sie die Tibia in der Kulturschale mit dem Oberschenkelknochen und auf Eis inkubieren. </li><li> Die Schritte 3,2-3,7 für das andere Bein, und gegebenenfalls weitere Spendermäusen. Nach der Entfernung der Knochen, sterilisieren chirurgische Instrumente mit einem heißen Perle Sterilisator oder verwenden Sie eine neue Reihe von sterilen Instrumente für die weiteren Schritte. </li><li> Für den Oberschenkelknochen, halten Sie die Oberschenkel mit einer Pinzette und mit chirurgische Scheren sorgfältig &quot;Rasur&quot; die distalen Enden der Knochen. So wenig von den Knochen wie nötig, um die BM Höhle freizulegen. </li><li> Füllen Sie eine Spritze mit 3 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 23 G Nadel. Vorsichtig trug die Nadel in die BM Höhle und spülen Sie das BM in eine sterile Petrischale. Achten Sie darauf, die Markhöhle mit der Nadelspitze zu kratzen, um die Entfernung aller gewünschten Zellen zu gewährleisten. Nach der Extraktionsicherzustellen, dass der rote BM nicht mehr sichtbar ist und der Knochen wird jetzt weiß. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,9-3,10 für nachfolgende Oberschenkelknochen, die Bündelung all der BM in der gleichen Kulturschale. </li><li> Für die Schienbeine, halten Sie die Tibia mit einer Pinzette vorsichtig &quot;Rasur&quot; das Ende, wo das Schienbein bis zum Knie, um den BM Höhle aussetzen befestigt. Machen Sie einen zweiten Schnitt entlang der Knochen, wo die sichtbaren roten BM endet. </li><li> Füllen Sie eine Spritze mit 3 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 25 G Nadel. Schieben Sie die Nadel in die BM Hohlraum (vom Ende, die bis zu den Knien befestigt war) und spülen Sie das BM in der Kulturschale mit dem BM aus den Oberschenkelknochen. Kratzen die Wände des Hohlraums BM mit der Nadel, um alle Zellen zu entfernen. Nach der Extraktion zu gewährleisten, dass die rote BM nicht mehr sichtbar ist und der Knochen wird jetzt weiß. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 3,12 bis 3,13 für nachfolgende tibiae, die Bündelung all der BM in der gleichen Kulturschale. </li><li> Sanft verreiben die BM mit einer 1 ml Pipettenspitze, um die c distanzierenEllen. </li><li> Passieren die Zellsuspension durch ein 40 &amp; mgr; M Korbfilter in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Schale mit PBS, um alle verbleibenden Zellen und übertrage diese durch den Filter in dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in 3 ml Erythrozyten Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min. </li><li> Hinzufügen ~ 30 ml sterilem PBS, die Lysepuffer quenchen. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 1 ml sterilem PBS. Halten Sie auf dem Eis. </li><li> Nehmen ein kleines Aliquot des Zellhomogenats mit PBS verdünnt (1: 100 für 1 Maus, 1: 200 für die 2-Mäuse, etc.), um die Anzahl der Zellen zu quantifizieren, unter Verwendung eines Hämocytometers. </li><li> Verdünne die Zellsuspension auf 8 x 10 6 Zellen / ml und Inkubation auf Eis bis zur Injektion. </li></ol> 4. Knochenmarktransplantation <ol><li> Fill ein 0,5-ml-Spritze (mit einer 28 G Nadel Insulin) mit 300 ul verdünnten Zellsuspension für jede Maus injiziert werden. Seien Sie sicher, dass alle in der Spritze Luftblasen zu entfernen. </li><li> Platzieren Sie die Maus Käfig mit den konditionierten Empfängermäuse auf einem Heizkissen und lassen Sie die Schwanzvenen zu erweitern. </li><li> Nehmen Sie eine Empfängermaus und in die Rückhalteeinrichtung. Wischen Sie den Schwanz mit chirurgischen Gaze mit 70% Ethanol eingeweicht. </li><li> Halten Sie das Heck und mit der Fase nach oben, sanft die Nadel in eine der seitlichen Schwanzvenen und injizieren Sie die Zellsuspension. </li><li> Halten chirurgischer Gaze auf die Injektionsstelle, bis die Blutung aufhört vor dem Einführen der Maus in einen neuen sauberen Käfig. </li></ol> 5. Schätzung der Umfang der BM Chimärismus HINWEIS: Chimärismus Ebenen sind in der Regel variable im peripheren Blut nach 1 Woche nach der KMT, und als solche Chimärismus Ebenen werden in der Regel geschätzt mindestens 2 Wochen nach der KMT. Ebenen der chimerism sollte&gt; 80% GFP + Zellen im peripheren Blut in 3-4 Wochen erreichen nach der KMT. <ol><li> Bereiten FACS Puffer (2 mM EDTA + 2% fötalem Rinderserum in PBS). HINWEIS: FACS-Puffer bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einem Halterohr und rasieren Sie das Fell auf dem hinteren Bein, um die laterale Vena saphena aus. </li><li> Dünn Mantel das Bein mit Vaseline und durchbohren die Vena saphena mit einer 25 G-Nadel. </li><li> Sammeln etwa 50 ul Blut mit Heparin beschichteten Kapillarröhrchen. Füge das Blut in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml FACS-Puffer. Mischen Sie das Rohr durch Umdrehen und Lagerung auf Eis. </li><li> Halten chirurgischer Gaze auf die Injektionsstelle bis die Blutung aufhört, bevor er Maus wieder in den Käfig. </li><li> Zentrifugieren der Blutproben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in 500 ul Erythrocyten-Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min. </li><li> 1 ml FACS-Puffer, um die Lysepuffers quenchen. </li><li> Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Führen Sie eine zweite Lyseschritt in 500 ul Erythrozyten Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min. </li><li> 1 ml FACS-Puffer, um die Lysepuffers quenchen. </li><li> Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. Überprüfen Sie, ob das Pellet ist jetzt weiß. HINWEIS: Wenn das Pellet noch rot angezeigt wird, kann ein zusätzlicher Lyse, bevor Sie mit dem nächsten Schritt benötigt. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in 300 ul FACS-Puffer und Quantifizierung GFP + -Zellen mittels Durchflusscytometrie (ANMERKUNG: An diesem Punkt jede gewünschte Immunfärbung der Zellen kann durchgeführt werden unter Verwendung von Standardtechniken vor der Durchflusszytometrie-Analyse). </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Busulfan Anlage ermöglicht die Erzeugung von High-Level BM Chimärismus in Mäusen, die mit hämatopoetischen Zellen, die leicht nachweisbar sind. Diese Konditionierung kann ohne die Notwendigkeit für Bestrahlungsanlagen durchgeführt werden. Außerdem ist die Myelosuppression mit den Dosen von Busulfan in diesem Protokoll umrissen gut verträglich Minimierung toxischer Nebenwirkungen von myeloablativen Dosis der Bestrahlung verursacht werden, und somit kann eine weitere geeignete Technik zur BM Chimärismus in junge, alte ode...

In letzter Zeit gab es ein beträchtliches Interesse an der Rolle von Mikroglia und Knochenmarkzellen (BM) im zentralen Nervensystem (ZNS), sowohl während der Krankheit als auch bei normalem Altern. Es ist jetzt bekannt, dass sich Mikroglia, die residenten Immunzellen des ZNS, nach dem Eintritt primitiver myeloischer Vorläuferzellen während der Embryogenese im ZNS entwickeln1. Mikroglia behalten Aspekte ihrer myelomonozytären Abstammung bis weit ins Erwachsenenalter bei. Während es Hinweise darauf gibt, dass der Beitrag von BMDCs zum Mikroglia-Pool bei gesunden erwachsenen Tieren minimal ist1, bleibt die Rolle, die BMDCs beim Fortschreiten verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen spielen, unklar. Diese Unsicherheit wird durch die Tatsache verstärkt, dass es schwierig ist, BMDCs, die sich im ZNS ansammeln, von endogenen residenten Mikroglia zu unterscheiden, da kein allgemein akzeptierter diskriminierender immunhistochemischer Marker identifiziert wurde. Um BMDCs in vivo zu überwachen, verwenden wir ein BM-Transplantationsprotokoll (BMT), bei dem endogene BM-Zellen einer Empfängermaus durch diejenigen einer Spendermaus ersetzt werden, die ubiquitär grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, unter Kontrolle des β-Aktin-Promotors. Dieses Protokoll ermöglicht die Bestimmung sowohl der Lokalisation als auch der Morphologie von GFP+-BMDCs in der Empfängermaus mittels Immunhistochemie und ermöglicht die weitere Charakterisierung dieser Zellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) mit anschließenden biochemischen Assays. 
Für eine erfolgreiche BMT müssen Empfänger-BM-Zellen abgetragen werden (Myeloablation genannt), um Nischenraum innerhalb des Empfänger-BM zu schaffen, der eine Transplantation von Spenderzellen ermöglicht. Häufig wird die Myeloablation durch Ganzkörper-Gammabestrahlung erreicht, die Doppelstrangbrüche in der DNA induziert, die zum Zelltod führen, insbesondere in sich aktiv teilenden Zellen wie hämatopoetischen Vorläuferzellen2,3. Die Bestrahlungsprotokolle werden durchgeführt, um einen ausreichenden BM-Zelltod zu induzieren, so dass die Letalität des Tieres eintritt, wenn das Empfängertier keine angemessene Spenderzelltransplantation durch BMT erreicht (so genannte "letale Bestrahlung"). Die Bestrahlung erfordert jedoch eine spezielle Einrichtung und Ausrüstung sowie veterinärmedizinische und tierzüchterische Ressourcen, die den Forschern nicht an allen Institutionen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus kann die myeloablative Bestrahlung potenziell tödliche Schäden an anderen Geweben verursachen, und aufgrund der Immunsuppresion sind bestrahlte Tiere anfälliger für Sekundärinfektionen3. Aus diesem Grund wurden Konditionierungsschemata mit reduzierter Intensität (so genannte "RIC"-Protokolle) entwickelt, die darauf abzielen, potenziell toxische Nebenwirkungen des Konditionierungsprotokolls bei Patienten zu minimieren, insbesondere für den Einsatz in Risikogruppen wie Kindern und älteren Menschen4. 
Einige RIC-Protokolle verlassen sich auf Chemotherapeutika wie Busulfan, um das BM-Kompartiment zu konditionieren. Busulfan ist ein bifunktioneller DNA-Alkylierungsmittel, der klinisch häufig als Alternative zur Bestrahlung eingesetzt wird5,6. Insbesondere kann Busulfan Mäusen sicher durch intraperitoneale (IP) Injektion verabreicht werden und erfordert nicht die speziellen Einrichtungen und Geräte, die für die Bestrahlung von Mäusen erforderlich sind. Die Busulfan-Konditionierung wurde in unserem Laborausgiebig eingesetzt 7 sowie in mehreren anderen neueren Veröffentlichungen8–11. Bei Verwendung von Dosen von 60-100 mg/kg kann ein hohes Maß an stabilem Chimärismus (>80% GFP+-Zellen) im peripheren Blut und BM7 etabliert werden. Wichtig ist, dass die Myeloablation bei diesen Dosen nicht vollständig ist und Mäuse daher in der Lage sind, ohne Unterstützung durch BM-Zellen zu überleben (K. Peake, J. Manning, C. Lewis und C. Krieger, unveröffentlichte Beobachtungen). Darüber hinaus kommt es bei der myelosuppressiven Busulfan-Konditionierung zu einer schnellen Rekonstitution von myelomonozytären Zellen des peripheren Blutes durch Spenderzellen. Der Ersatz von Lymphozyten aus dem peripheren Blut durch Spenderzellen verläuft jedoch langsamer, was den Mangel an Immunsuppression unterstreicht, der bei Dosen von 60-100 mg/kg Busulfan im Vergleich zur Ganzkörperbestrahlung auftritt7. 
Wir haben erfolgreich Busulfan-induzierten Chimärismus verwendet, um BMDCs in Wildtyp-Mäusen sowie in Mausmodellen der neurodegenerativen Erkrankungen Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)7 und Alzheimer-Krankheit zu untersuchen. Es wurde beobachtet, dass sich unter bestimmten Bedingungen eine signifikante Anzahl von GFP+-BMDC im ZNS ansammelt7,12. Wichtig ist, dass die Busulfan-Konditionierung gefolgt von BMT wie die myeloablative Konditionierung mit Bestrahlung ausreicht, um eine GFP+ BMDC-Akkumulation im ZNS sowohl bei Wildtyp-Mäusen als auch bei Mäusen mit neurologischen Erkrankungenzu ermöglichen 7–11. Da ein Haupthindernis bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen die Fähigkeit ist, therapeutische Moleküle aus dem Blutkreislauf in das ZNS zu bringen, wo sie positive Wirkungen entfalten können, erhöht dies die Möglichkeit, dass BMDCs so verändert werden könnten, dass sie therapeutische Moleküle exprimieren, und anschließend als Vehikel verwendet werden könnten, um Therapeutika an das ZNS von Busulfan-konditionierten Empfängern zu liefern. Ein Mechanismus, den wir aktiv untersuchen. Obwohl wir festgestellt haben, dass die myeloablative Konditionierung mit Bestrahlung im Vergleich zur Busulfan-Konditionierung zu einer stärkeren Akkumulation von GFP+ BMDCs im ZNS führt7, kann die Bestrahlung bei Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen und in Mausmodellen der ZNS-Erkrankung eine erhebliche Toxizität aufweisen.
Obwohl wir und viele andere BMT-Modelle verwendet haben, um BMDCs bei neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, ist die Fähigkeit, das BM-Kompartiment einer Empfängermaus weitgehend durch eine eindeutig identifizierbare Population von BM-Zellen zu ersetzen, ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung verschiedener Aspekte des hämatopoetischen Systems. Dazu gehört ein breites Spektrum von Forschungsthemen wie die Entwicklung der hämatopoetischen Abstammung, Leukämie, Organtransplantation, Graft-versus-Host-Reaktion und Immunbiologie.

<table><tbody><tr><td>Busulfex</td><td>Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.</td><td>DIN 02240602</td><td>Busulfan kurz vor der Verwendung auf 3 mg/ml mit sterilem PBS verdünnen. Busulfan ist zytotoxisch. Behandeln und entsorgen Sie gemäß dem Sicherheitsdatenblatt und den institutionellen Richtlinien.</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>Andere Lysepuffer können ersetzt werden, aber die Inkubationszeiten müssen möglicherweise entsprechend angepasst werden Fetal</td></tr><tr><td>Bovine Serum</td><td>Life</td> Technologies <td>12483-020</td><td></td></tr></tbody></table>

busulfan als myelosuppressiven agenten zur erwirtschaftung stabiler hochrangige knochenmark chimärismus bei mäusen

Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

Knochenmarktransplantation (BMT) wird häufig verwendet, um das Knochenmarkkompartiment (BM) von Empfängermäusen durch BM-Zellen zu ersetzen, die einen eindeutigen Biomarker exprimieren, der aus Spendermäusen isoliert wurde. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung von hämatopoetischen Zellen aus Spendern in den Empfängermäusen und kann zur Isolierung und Charakterisierung von Spenderzellen mit verschiedenen biochemischen Techniken verwendet werden. Die BMT beruht in der Regel auf einer myeloablativen Konditionierung mit Ganzkörperbestrahlung, um innerhalb des BM-Kompartiments von Empfängermäusen einen Nischenraum für die Transplantation von Spenderzellen zu schaffen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet eine myelosuppressive Konditionierung mit dem Chemotherapeutikum Busulfan. Im Gegensatz zur Bestrahlung, die den Einsatz spezieller Einrichtungen erfordert, wird die Busulfankonditionierung mit intraperitonealen Injektionen von 20 mg/kg Busulfan durchgeführt, bis eine Gesamtdosis von 60-100 mg/kg verabreicht wurde. Darüber hinaus kann die myeloablative Bestrahlung toxische Nebenwirkungen haben und erfordert eine erfolgreiche Transplantation von Spenderzellen für das Überleben der Empfängermäuse. Im Gegensatz dazu wird die Busulfan-Konditionierung mit diesen Dosen im Allgemeinen gut vertragen und die Mäuse überleben ohne Unterstützung durch Spenderzellen. Spender-BM-Zellen werden aus den Femuren und Tibien von Mäusen isoliert, die ubiquitär grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, und in die laterale Schwanzvene konditionierter Empfängermäuse injiziert. Der BM-Chimärismus wird geschätzt, indem die Anzahl der GFP+-Zellen im peripheren Blut nach BMT quantifiziert wird. Chimärismuswerte von >80% werden in der Regel 3-4 Wochen nach der Transplantation im peripheren Blut beobachtet und bleiben mindestens 1 Jahr lang etabliert. Wie bei der Bestrahlung ermöglicht die Konditionierung mit Busulfan und BMT die Akkumulation von Spender-BM-abgeleiteten Zellen im Zentralnervensystem (ZNS), insbesondere in Mausmodellen der Neurodegeneration. Diese Busulfan-vermittelte ZNS-Akkumulation kann physiologischer sein als die Ganzkörperbestrahlung, da die Busulfan-Behandlung weniger toxisch ist und die ZNS-Entzündung weniger umfangreich zu sein scheint. Wir vermuten, dass diese Zellen gentechnisch verändert werden können, um Therapeutika an das ZNS zu liefern.

Die Verabreichung von 60-100 mg / kg Busulfan im allgemeinen gut von Mäusen gut vertragen. Doch in der Regel Tiere, Gewicht zu verlieren während der Konditionierungsphase (~ 5-10%) und damit die Nahrung muss unter Umständen mit Leckereien wie bestrahlt Sonnenblumenkerne zu essen zu fördern ergänzt werden. Ebenen der Chimärismus von&gt; 80% GFP + Zellen im peripheren Blut und BM konsequent erreichbar mit 60 bis 100 mg / kg Busulfan 7 sein. Unser Labor hat erfolgreich dieses Protokoll, mit dem über 100 chimären...

Wir beschreiben ein Protokoll, bei dem die Busulfan-Konditionierung es ermöglicht, das Knochenmark einer Empfängermaus durch Knochenmarkzellen von Spendermäusen zu ersetzen, die ubiquitär grün fluoreszierendes Protein exprimieren, ohne Bestrahlung. Diese Technik ist nützlich, um die Akkumulation von Knochenmarkzellen im Zentralnervensystem zu untersuchen.

Busulfan als myelosuppressiven Agenten zur Erwirtschaftung stabiler Hochrangige Knochenmark Chimärismus bei Mäusen

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Knochenmarkkompartiment von Empfängermäusen durch Knochenmarkzellen von Spendermäusen zu ersetzen, die ubiquitär das grün fluoreszierende Protein exprimieren, und zwar ohne Bestrahlung. Dies wird erreicht, indem die Empfängertiere zunächst durch serielle intraperitoneale Injektionen der myelosupprimierenden Substanz Busulfan konditioniert werden.Anschließend werden Knochenmarkzellen aus den Femora und Tibien einer Spendermaus, die ubiquitär das grün fluoreszierende Protein exprimiert, isoliert. Schließlich werden die Spender-Knochenmarkzellen mittels Injektion in die Schwanzvene in die vorbehandelte Empfängermaus transplantiert. Abschließend wird Blut von der transplantierten Maus entnommen und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um den Grad der Knochenmarkchimäre abzuschätzen.Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ganzkörperbestrahlung bestehen darin, dass ein hohes Maß an Knochenmark-Chimären erzielt werden kann, ohne die zytotoxischen Effekte einer Ganzkörperbestrahlung und ohne den Bedarf an speziellen Einrichtungen und Geräten. Diese Methode ermöglicht nicht nur Einblicke in die Ansammlung von Knochenmark-abstammenden Zellen im zentralen Nervensystem, sondern kann auch zur Untersuchung von Forschungsthemen wie der Entwicklung hämatopoetischer Linien, der Immunbiologie und der Leukämie verwendet werden. Zur Vorbereitung der Empfängermäuse verdünnen Sie Busulfan gemäß dem Textprotokoll und verabreichen 20 Milligramm pro Kilogramm mittels intraperitonealer Injektion täglich an die Empfängermäuse.Nach der Tötung der Mäuse gemäß den institutionellen Richtlinien sprühen Sie unter einer laminarer Luftströmung-Haube eine Maus mit 70 % Ethanol ein. Heben Sie die Haut am Bauch an und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere vom Bauchraum ausgehend entlang des Beins bis zum Knöchel, wobei Sie den Fuß halten. Ziehen Sie die Haut fest vom Knöchel in Richtung Hüfte, um das Bein-Gewebe freizulegen.Entfernen Sie das Muskel- und Fettgewebe vom Femur, um das Hüftgelenk freizulegen, während Sie vorsichtig am Fuß ziehen. Um das Bein zu strecken, drücken Sie die Schere gegen die Beckenknochen und schneiden Sie knapp oberhalb des Femurkopfes ab, wobei Sie darauf achten, den Femur selbst nicht zu verletzen. Um die Sterilität zu gewährleisten, halten Sie das Bein am Fuß fest und entfernen Sie mit der Schere jegliches verbleibende Gewebe vom Femur, wobei Sie das Knochengewebe mit sterilisierten Tüchern abreiben. Trennen Sie den Femur und die Tibia, indem Sie durch das Kniegelenk schneiden, und legen Sie den Femur in eine Kulturschale, die PBS enthält, und inkubieren Sie ihn auf Eis. Entfernen und entsorgen Sie anschließend die Fibula, indem Sie an den Stellen durchtrennen, an denen die Fibula mit der Tibia verbunden ist. Reinigen Sie dann die Tibia.Entfernen Sie den Fuß, indem Sie die Tibia dort durchtrennen, wo das rote Mark endet, und legen Sie die Tibia zusammen mit dem Femur in die Kulturschale. Inkubieren Sie die Probe auf Eis. Halten Sie den Femur mit einer Pinzette fest und schneiden Sie vorsichtig mit einer chirurgischen Schere die distalen Enden des Knochens ab. Entfernen Sie so wenig Knochenmaterial wie nötig, um die Markhöhle mit drei Millilitern steriler PBS freizulegen.Füllen Sie eine Spritze und befestigen Sie eine 23-Gauge-Nadel. Bohren Sie vorsichtig die Nadel in die Markhöhle und spülen Sie das Knochenmark in eine sterile Kulturschale. Verwenden Sie die Nadelspitze, um die Markhöhle abzukratzen, um nach der Extraktion die vollständige Entfernung aller gewünschten Zellen sicherzustellen.Stellen Sie sicher, dass das rote Knochenmark nicht mehr sichtbar ist und der Knochen nun weiß erscheint. Halten Sie mit einer Pinzette die Tibia fest und schaben Sie mit einer chirurgischen Schere vorsichtig das Ende ab, an dem die Tibia am Kniegelenk befestigt war. Um die Markhöhle freizulegen, füllen Sie eine Spritze mit drei Milliliter sterilem PBS und setzen eine Nadel mit 25 Gauge auf. Bohren Sie die Nadel vorsichtig in die Markhöhle und spülen Sie das Knochenmark in die Schale mit dem gesammelten Knochenmark aus den Femora. Lösen Sie das Knochenmark mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze vorsichtig auf, um die Zellen zu dissoziieren. Lassen Sie die Zellsuspension durch einen 40-Mikron-Filter in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen laufen.Spülen Sie die Petrischale mit PBS, um eventuell verbliebene Zellen zu gewinnen, und überführen Sie die Pufferlösung durch die Filtereinrichtung in das Zentrifugenröhrchen. Geben Sie PBS zum Röhrchen hinzu, sodass ein Endvolumen von 30 bis 40 Milliliter erreicht wird, und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 450 ×g und 4 °C. Anschließend wird der Überstand entfernt und verworfen.Suspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer und inkubieren Sie es 8,5 Minuten auf Eis. Geben Sie anschließend etwa 30 Milliliter sterile PBS zu, um den Lysepuffer zu stoppen, zentrifugieren Sie und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter steriler PBS und bewahren Sie es auf Eis auf.Mit PBS eine kleine Menge Zellhomogenat verdünnen und mit einem Hämozytometer die Zellen zählen. Die Zellsuspension auf 8 × 10⁶ Zellen pro Milliliter verdünnen und bis zur Injektion auf Eis lagern. Zur Durchführung der Knochenmarktransplantation 300 µl der verdünnten Zellsuspension in eine 0,5-ml-Spritze geben.Entfernen Sie für jede Maus, die injiziert werden soll, unbedingt alle Luftblasen. Stellen Sie den Käfig mit den vorbehandelten Empfängermäusen auf eine Heizplatte, um die seitlichen Schwanzvenen erweitern zu lassen. Setzen Sie eine Empfängertmaus in eine geeignete Fixiervorrichtung ein, wischen Sie den Schwanz mit chirurgischer Gaze ab, die mit 70 % Ethanol getränkt ist, halten Sie den Schwanz fest und führen Sie die Nadel mit der Schräge nach oben vorsichtig in eine der seitlichen Schwanzvenen ein, um die Zellsuspension zu injizieren.Chirurgische Gaze auf die Injektionsstelle legen, bis die Blutung stoppt. Vor dem Einsetzen der Maus in einen neuen, sauberen Käfig, ungefähr zwei bis drei Wochen nach der Knochenmarktransplantation, wird die Maus in ein Fixierrohr gelegt und das Fell am hinteren Bein abrasiert, um die laterale Safenvene freizulegen. Anschließend wird eine dünne Schicht Vaseline auf das Bein aufgetragen und mit einer 25-Gauge-Nadel die Safenvene mit einem mit Heparin beschichteten Kapillarrohr durchstochen.Sammeln Sie etwa 50 Mikroliter Blut und stoppen Sie die Blutung anschließend mit chirurgischem Mull. Sobald die Blutung gestoppt ist, bringen Sie die Maus zurück in den Käfig. Geben Sie das Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das ein Milliliter Faxpuffer enthält.Mischen Sie das Gefäß durch mehrmaliges Umstülpen und lagern Sie es auf Eis. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 900 ×g für fünf Minuten. Nach dem Entfernen und Verwerfen des Überstandes, resuspendieren Sie das Pellet mit 500 µL Erythrozyten-Lysepuffer und inkubieren Sie es 8,5 Minuten auf Eis. Geben Sie anschließend ein Milliliter Fax-Puffer zu, um den Lysepuffer zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie erneut bei 900 ×g für fünf Minuten.Nach dem erneuten Lysevorgang und Zentrifugation gemäß dem Textprotokoll überprüfen, ob der Pellet nun weiß ist. Falls er rot ist, den Lyse-Schritt ein drittes Mal wiederholen und resuspendieren. Den Pellet in Fax-Puffer suspendieren und mittels Durchflusszytometrie den Anteil der GFP-positiven Zellen quantifizieren.Dieses Diagramm zeigt die wöchentlich im peripheren Blut von Mäusen quantifizierten Chimerismus-Spiegel, die mit 100 Milligramm pro Kilogramm Busulfan behandelt wurden und eine erfolgreiche syngene Knochenmarktransplantation erhielten, sowie Mäuse, die mit 80 Milligramm pro Kilogramm Busulfan behandelt und eine erfolglose allogene Knochenmarktransplantation erhielten. Chimerismus-Spiegel über 80 % werden typischerweise innerhalb von drei bis vier Wochen nach der Knochenmarktransplantation erreicht. Hier dargestellt sind repräsentative Daten aus dem peripheren Blut, die drei Wochen nach der Knochenmarktransplantation einen erfolgreichen beziehungsweise erfolglosen Verlauf der Knochenmarktransplantation zeigen. Diese Durchflusszytometriedaten zeigen, dass ein hoher Grad an Chimerismus im Knochenmark mindestens ein Jahr lang aufrechterhalten bleibt, und dass die Behandlung mit dem Fahrzeugmittel (vehicle) nicht ausreicht, um einen Knochenmark-Chimerismus zu induzieren.Obwohl keine signifikanten Unterschiede in den im Knochenmark erzielten Chimärismen bei der Anwendung von Dosen von 60 bis 100 Milligramm Busulfan pro Kilogramm Körpergewicht bestehen, sammeln sich GFP-positive Zellen dosisabhängig im zentralen Nervensystem an. Diese Abbildung veranschaulicht die Anreicherung von GFP-positiven, aus dem Knochenmark stammenden Zellen in der Lendenregion des Rückenmarks bei einer Wildtyp-Maus und in größerem Ausmaß bei einem Mausmodell der neurodegenerativen Erkrankung amyotrophe Lateralsklerose. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, syngene Empfänger- und Spendermäuse des gleichen Geschlechts zu verwenden, um die Möglichkeit einer Transplantatabstoßung zu minimieren. Nach Durchführung dieses Verfahrens.Andere Methoden wie die Durchflusszytometrie und die Immunhistochemie können genutzt werden, um die Mechanismen zu untersuchen, über die markstammende Zellen in das zentrale Nervensystem eindringen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

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