Busulfan als myelosuppressiven Agenten zur Erwirtschaftung stabiler Hochrangige Knochenmark Chimärismus bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Knochenmarkkompartiment von Empfängermäusen durch Knochenmarkzellen von Spendermäusen zu ersetzen, die ubiquitär das grün fluoreszierende Protein exprimieren, und zwar ohne Bestrahlung. Dies wird erreicht, indem die Empfängertiere zunächst durch serielle intraperitoneale Injektionen der myelosupprimierenden Substanz Busulfan konditioniert werden.

Anschließend werden Knochenmarkzellen aus den Femora und Tibien einer Spendermaus, die ubiquitär das grün fluoreszierende Protein exprimiert, isoliert. Schließlich werden die Spender-Knochenmarkzellen mittels Injektion in die Schwanzvene in die vorbehandelte Empfängermaus transplantiert. Abschließend wird Blut von der transplantierten Maus entnommen und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um den Grad der Knochenmarkchimäre abzuschätzen.

Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ganzkörperbestrahlung bestehen darin, dass ein hohes Maß an Knochenmark-Chimären erzielt werden kann, ohne die zytotoxischen Effekte einer Ganzkörperbestrahlung und ohne den Bedarf an speziellen Einrichtungen und Geräten. Diese Methode ermöglicht nicht nur Einblicke in die Ansammlung von Knochenmark-abstammenden Zellen im zentralen Nervensystem, sondern kann auch zur Untersuchung von Forschungsthemen wie der Entwicklung hämatopoetischer Linien, der Immunbiologie und der Leukämie verwendet werden. Zur Vorbereitung der Empfängermäuse verdünnen Sie Busulfan gemäß dem Textprotokoll und verabreichen 20 Milligramm pro Kilogramm mittels intraperitonealer Injektion täglich an die Empfängermäuse.

Nach der Tötung der Mäuse gemäß den institutionellen Richtlinien sprühen Sie unter einer laminarer Luftströmung-Haube eine Maus mit 70 % Ethanol ein. Heben Sie die Haut am Bauch an und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere vom Bauchraum ausgehend entlang des Beins bis zum Knöchel, wobei Sie den Fuß halten. Ziehen Sie die Haut fest vom Knöchel in Richtung Hüfte, um das Bein-Gewebe freizulegen.

Entfernen Sie das Muskel- und Fettgewebe vom Femur, um das Hüftgelenk freizulegen, während Sie vorsichtig am Fuß ziehen. Um das Bein zu strecken, drücken Sie die Schere gegen die Beckenknochen und schneiden Sie knapp oberhalb des Femurkopfes ab, wobei Sie darauf achten, den Femur selbst nicht zu verletzen. Um die Sterilität zu gewährleisten, halten Sie das Bein am Fuß fest und entfernen Sie mit der Schere jegliches verbleibende Gewebe vom Femur, wobei Sie das Knochengewebe mit sterilisierten Tüchern abreiben.

Trennen Sie den Femur und die Tibia, indem Sie durch das Kniegelenk schneiden, und legen Sie den Femur in eine Kulturschale, die PBS enthält, und inkubieren Sie ihn auf Eis. Entfernen und entsorgen Sie anschließend die Fibula, indem Sie an den Stellen durchtrennen, an denen die Fibula mit der Tibia verbunden ist. Reinigen Sie dann die Tibia.

Entfernen Sie den Fuß, indem Sie die Tibia dort durchtrennen, wo das rote Mark endet, und legen Sie die Tibia zusammen mit dem Femur in die Kulturschale. Inkubieren Sie die Probe auf Eis. Halten Sie den Femur mit einer Pinzette fest und schneiden Sie vorsichtig mit einer chirurgischen Schere die distalen Enden des Knochens ab. Entfernen Sie so wenig Knochenmaterial wie nötig, um die Markhöhle mit drei Millilitern steriler PBS freizulegen.

Füllen Sie eine Spritze und befestigen Sie eine 23-Gauge-Nadel. Bohren Sie vorsichtig die Nadel in die Markhöhle und spülen Sie das Knochenmark in eine sterile Kulturschale. Verwenden Sie die Nadelspitze, um die Markhöhle abzukratzen, um nach der Extraktion die vollständige Entfernung aller gewünschten Zellen sicherzustellen.

Stellen Sie sicher, dass das rote Knochenmark nicht mehr sichtbar ist und der Knochen nun weiß erscheint. Halten Sie mit einer Pinzette die Tibia fest und schaben Sie mit einer chirurgischen Schere vorsichtig das Ende ab, an dem die Tibia am Kniegelenk befestigt war. Um die Markhöhle freizulegen, füllen Sie eine Spritze mit drei Milliliter sterilem PBS und setzen eine Nadel mit 25 Gauge auf.

Bohren Sie die Nadel vorsichtig in die Markhöhle und spülen Sie das Knochenmark in die Schale mit dem gesammelten Knochenmark aus den Femora. Lösen Sie das Knochenmark mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze vorsichtig auf, um die Zellen zu dissoziieren. Lassen Sie die Zellsuspension durch einen 40-Mikron-Filter in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen laufen.

Spülen Sie die Petrischale mit PBS, um eventuell verbliebene Zellen zu gewinnen, und überführen Sie die Pufferlösung durch die Filtereinrichtung in das Zentrifugenröhrchen. Geben Sie PBS zum Röhrchen hinzu, sodass ein Endvolumen von 30 bis 40 Milliliter erreicht wird, und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 450 ×g und 4 °C. Anschließend wird der Überstand entfernt und verworfen.

Suspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer und inkubieren Sie es 8,5 Minuten auf Eis. Geben Sie anschließend etwa 30 Milliliter sterile PBS zu, um den Lysepuffer zu stoppen, zentrifugieren Sie und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter steriler PBS und bewahren Sie es auf Eis auf.

Mit PBS eine kleine Menge Zellhomogenat verdünnen und mit einem Hämozytometer die Zellen zählen. Die Zellsuspension auf 8 × 10⁶ Zellen pro Milliliter verdünnen und bis zur Injektion auf Eis lagern. Zur Durchführung der Knochenmarktransplantation 300 µl der verdünnten Zellsuspension in eine 0,5-ml-Spritze geben.

Entfernen Sie für jede Maus, die injiziert werden soll, unbedingt alle Luftblasen. Stellen Sie den Käfig mit den vorbehandelten Empfängermäusen auf eine Heizplatte, um die seitlichen Schwanzvenen erweitern zu lassen. Setzen Sie eine Empfängertmaus in eine geeignete Fixiervorrichtung ein, wischen Sie den Schwanz mit chirurgischer Gaze ab, die mit 70 % Ethanol getränkt ist, halten Sie den Schwanz fest und führen Sie die Nadel mit der Schräge nach oben vorsichtig in eine der seitlichen Schwanzvenen ein, um die Zellsuspension zu injizieren.

Chirurgische Gaze auf die Injektionsstelle legen, bis die Blutung stoppt. Vor dem Einsetzen der Maus in einen neuen, sauberen Käfig, ungefähr zwei bis drei Wochen nach der Knochenmarktransplantation, wird die Maus in ein Fixierrohr gelegt und das Fell am hinteren Bein abrasiert, um die laterale Safenvene freizulegen. Anschließend wird eine dünne Schicht Vaseline auf das Bein aufgetragen und mit einer 25-Gauge-Nadel die Safenvene mit einem mit Heparin beschichteten Kapillarrohr durchstochen.

Sammeln Sie etwa 50 Mikroliter Blut und stoppen Sie die Blutung anschließend mit chirurgischem Mull. Sobald die Blutung gestoppt ist, bringen Sie die Maus zurück in den Käfig. Geben Sie das Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das ein Milliliter Faxpuffer enthält.

Mischen Sie das Gefäß durch mehrmaliges Umstülpen und lagern Sie es auf Eis. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 900 ×g für fünf Minuten. Nach dem Entfernen und Verwerfen des Überstandes, resuspendieren Sie das Pellet mit 500 µL Erythrozyten-Lysepuffer und inkubieren Sie es 8,5 Minuten auf Eis. Geben Sie anschließend ein Milliliter Fax-Puffer zu, um den Lysepuffer zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie erneut bei 900 ×g für fünf Minuten.

Nach dem erneuten Lysevorgang und Zentrifugation gemäß dem Textprotokoll überprüfen, ob der Pellet nun weiß ist. Falls er rot ist, den Lyse-Schritt ein drittes Mal wiederholen und resuspendieren. Den Pellet in Fax-Puffer suspendieren und mittels Durchflusszytometrie den Anteil der GFP-positiven Zellen quantifizieren.

Dieses Diagramm zeigt die wöchentlich im peripheren Blut von Mäusen quantifizierten Chimerismus-Spiegel, die mit 100 Milligramm pro Kilogramm Busulfan behandelt wurden und eine erfolgreiche syngene Knochenmarktransplantation erhielten, sowie Mäuse, die mit 80 Milligramm pro Kilogramm Busulfan behandelt und eine erfolglose allogene Knochenmarktransplantation erhielten. Chimerismus-Spiegel über 80 % werden typischerweise innerhalb von drei bis vier Wochen nach der Knochenmarktransplantation erreicht. Hier dargestellt sind repräsentative Daten aus dem peripheren Blut, die drei Wochen nach der Knochenmarktransplantation einen erfolgreichen beziehungsweise erfolglosen Verlauf der Knochenmarktransplantation zeigen. Diese Durchflusszytometriedaten zeigen, dass ein hoher Grad an Chimerismus im Knochenmark mindestens ein Jahr lang aufrechterhalten bleibt, und dass die Behandlung mit dem Fahrzeugmittel (vehicle) nicht ausreicht, um einen Knochenmark-Chimerismus zu induzieren.

Obwohl keine signifikanten Unterschiede in den im Knochenmark erzielten Chimärismen bei der Anwendung von Dosen von 60 bis 100 Milligramm Busulfan pro Kilogramm Körpergewicht bestehen, sammeln sich GFP-positive Zellen dosisabhängig im zentralen Nervensystem an. Diese Abbildung veranschaulicht die Anreicherung von GFP-positiven, aus dem Knochenmark stammenden Zellen in der Lendenregion des Rückenmarks bei einer Wildtyp-Maus und in größerem Ausmaß bei einem Mausmodell der neurodegenerativen Erkrankung amyotrophe Lateralsklerose. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, syngene Empfänger- und Spendermäuse des gleichen Geschlechts zu verwenden, um die Möglichkeit einer Transplantatabstoßung zu minimieren. Nach Durchführung dieses Verfahrens.

Andere Methoden wie die Durchflusszytometrie und die Immunhistochemie können genutzt werden, um die Mechanismen zu untersuchen, über die markstammende Zellen in das zentrale Nervensystem eindringen.