Name: Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren Toxoplasma gondii Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie Forward-Genetik genutzt wird, um Gene von Toxoplasma gondii zu identifizieren, die für die Immunevasion in Makrophagen entscheidend sind. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in Wirt-Pathogen-Interaktionen.

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Besonderer Dank geht an Dr. Peter Bradley für den Antikörper zum Nachweis der T. gondii-Mitochondrien. Die Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des National Institute of Health AI072028 und AI107431 an D.G.M und eine großzügige Spende an das New York Medical College für das Studium der Tropenmedizin.

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die beschriebenen Protokoll stellt eine nicht voreingenommen Ansatz, der die Aktivierung von Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen und zukunfts Genetik T. isolieren verwendet gondii-Mutanten mit Defekt in der Fähigkeit, die Aktivierung von infizierten Makrophagen zu überleben. Der Phänotyp der Mutanten nach Makrophagenaktivierung fällt in der Regel in eine von zwei Kategorien: 1) Die Parasiten scheinen intakt, aber nicht über den 1. Parasiten pro PV replizieren; 2) Die Parasiten erscheinen abgebaut u...

Toxoplasma gondii (T. gondii) ist ein obligat intrazelluläre, Protozoen-Erreger. Es ist der Erreger der Toxoplasmose, ein Gesundheitsrisiko bei immungeschwächten Individuen. Es ist auch das Modellsystem für andere apicomplexan Krankheitserreger, die Menschen, einschließlich Cryptosporidium und Cyclospora infizieren. Toxoplasmose ist am häufigsten durch den Verzehr von Nahrung oder Wasser mit dem bradyzoite oder Oozysten Stadium des Parasiten verunreinigt erworben. Nach der Einnahme konvertieren diese Stufen auf die Tachyzoiten Stadium des Parasiten, die in Wirtszellen repliziert und verbreitet systemisch. T-Zellen, IFN-γ und, in geringerem Maße, Stickstoffmonoxid 1-4, sind wichtig für die Kontrolle der Infektion jedoch nicht zur Eliminierung der Erkrankung, als Anteil der Tachyzoiten umwandeln zum bradyzoite Stufe, die innerhalb Gewebezysten geschützt was zu einem langlebigen chronischen Infektion. In der Tat gibt es keine wirksame Therapie gegen die chronische Zyste sTage der Erkrankung. Schwere Toxoplasmose ist meist durch die Reaktivierung der persistierenden Infektion mit dem bradyzoite Stadium des Parasiten Konvertierung zurück in die schnell zu replizieren Tachyzoiten Phase charakteristisch für primäre und akute Infektion. Frühe Überleben angesichts der angeborenen Immunantwort ist wichtig, damit der Parasit, genügend Parasitenzahlen zu erreichen, sowie distalen Stellen zu erreichen, für die Niederlassung einer chronischen Infektion zu ermöglichen. T. gondii hat Strategien zur Wirtsabwehrmechanismen, die wahrscheinlich ihre Fähigkeit zu replizieren und Verbreitung der Infektion früh beitragen entgegenzuwirken entwickelt. Zuerst T. gondii bildet eine einzigartige PV bei Parasitenbefall weitgehend getrennt von den endozytischen und Exozytose-Prozesse der Wirtszelle im Vergleich zu anderen intrazellulären Pathogenen 5-9 ist. Auch, wie alle erfolgreichen intrazelluläre Erreger T. gondii modifiziert seine Wirtszelle, um einen permissiven Umgebung f erstellenoder Wachstum. Dies beinhaltet eine Anpassung Wirtszelle Genexpression durch Veränderung Wirtszelle Transkriptionsfaktoren einschließlich der wichtig für die Regulierung Zellaktivierung 10-15. ROP16 16-19 GRA15 20. GRA16 21 und GRA24 22 erwiesen sich alle als bei der Regulierung der Transkriptionsreaktion und Zellsignalkaskaden von Wirtszellen mit T. infiziert wichtig gondii. Jüngste Studien mit genetischen Kreuzungen zwischen Parasitenstämme mit unterschiedlichen Phänotypen sehr produktiv bei der Identifizierung von Genen, die Parasiten Parasiten Genotyp-abhängigen Eigenschaften einschließlich Umgehung der Immunität GTPasen (IRGs) 16,19,23-26 zugrunde liegen gewesen. In Mäusen sind Immunität GTPasen (IRGs) kritisch für die Steuerung der Typ II und III Genotypen des Parasiten während der sehr virulenten Typ I Genotypen Mechanismen entwickelt, um die murinen IRGs entziehen. Es ist aber auch klar, dass der Parasit hat Mechanismen entwickelt, um antimikrobielle Medien umgehenren neben den IRGs und dass einige dieser Mechanismen können für Parasiten Genotypen 27,28 konserviert werden. Zudem ist sehr wenig über den kritischen Mediatoren der Zell autonome Immunität gegen T. bekannt gondii während menschliche Toxoplasmose. Parasite Gene wichtig für die Resistenz gegen Vermittler von Zell autonome Immunität kann auch überlebenswichtig sein, während Tachyzoiten Umwandlung, die auch von Wirtsimmunreaktionen ausgelöst werden können, um bradyzoite. So kann beispielsweise Stickstoffmonoxid auf hohem Niveau Parasitenreplikation in infizierten Makrophagen unterdrücken, aber es kann auch dazu anregen Tachyzoiten zu Umrechnung in Zyste Produktion 30-32 bradyzoite. ToxoDB ist eine funktionelle Genomdatenbank für T. gondii, der als wichtige Ressource für das Feld in Bezug auf die Bereitstellung Sequenzinformation für die Parasitengenom und den Zugang zu veröffentlichten und nicht veröffentlichten genomischen Maßstab Daten einschließlich Community Anmerkungen Gen exp<html> ression und Proteomik-Daten 33. Ähnlich wie bei vielen Protozoen- Pathogene, der Großteil des Genoms besteht aus hypothetischen Gene ohne von Informationen aus Genhomologie Einblick in ihre möglichen Funktionen bereitzustellen. So ist nach vorn Genetik ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Parasiten Gene wichtig für Immunevasion, Zyste Umwandlung und andere Funktionen entscheidend für Parasiten Pathogenese als auch für die Konvertierung zwischen verschiedenen Entwicklungsstadien zu identifizieren. Eine weitere Stärke der Vorwärtsgenetik ist, dass es als ein relativ nicht-vorgespannten Ansatz verwendet, um den Parasit zu den Genen, die für spezifische Aufgaben in Pathogenese, einschließlich Immunumgehung und Zystenbildung sind abzufragen. Die jüngsten Verbesserungen in Next Generation Sequencing für Mutationsprofiling haben sie eine Methode der Wahl für die Identifizierung der verantwortlichen Parasiten Gene von vorn Genetik Studien unter Verwendung von chemischen und Insertionsmutagenese 34-37 hergestellt. ntent &quot;&gt; Es ist wichtig, um Schwachstellen in T. gondii, die ausgenutzt werden, um die Wirksamkeit der Zell autonomen Immunmechanismen gegen den Parasiten insbesondere solche, die auch gegen die resistenten Zyste Bühne aktiv sein können. Um dieses Ziel zu, ein in vitro-Mäuse zu verbessern identifizieren Makrophageninfektion und Aktivierungsmodell wurde entwickelt, um Mutationen in die Parasiten, insbesondere T. gondii Fitness nach Aktivierung der infizierten Makrophagen, aber nicht in naiven Makrophagen limitieren. Dieses Makrophagen Bildschirm verwendet, um eine Bibliothek von T. gondii Insertionsmutanten um abzufragen letztendlich identifizieren T. gondii wichtige Gene für die Resistenz gegen Stickoxid 27,28. Die Isolierung von einem Panel von T. gondii-Mutanten mit verminderter Widerstandsfähigkeit gegenüber der Aktivierung der infizierten Makrophagen, insbesondere eine ausgeprägte Empfindlichkeit gegenüber Stickstoffmonoxid, erwies sich die Nützlichkeit des Screening zur Identifizierung Parasiten Gene wichtig für WiderstandMediatoren der Zell autonome Immunität mit Ausnahme der für die murine IRGs 28 beschriebenen Resistenzmechanismen. Insertionsmutagenese hat Vorteile gegenüber chemischen Mutagenese im Hinblick auf die Erzeugung einer begrenzten Anzahl von zufälligen Mutationen in jeder Parasit Klons und theoretisch eine leichtere Identifizierung der Mutationsstelle. Die Identifizierung der Genom-Stelle des Plasmids Insertion in T. gondii Insertionsmutanten in der Praxis hat sich überraschend schwierig, in vielen Fällen 37. Einführen eines Plasmids in einem Gen ist auch geeignet, die Funktion eines Gens, das im Gegensatz zur chemischen Mutagenese, die typischerweise zu einzelnen Nucleotidänderungen stören. Die chemische Mutagenese mit entweder N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) zu einer erhöhten Fähigkeit, einen größeren Teil des Parasitengenoms zu analysieren bieten, im Vergleich zu Insertionsmutagenese, da sie mehrfache Punktmutationen erzeugt ( geschätzt bei 10 -100) pro Mutante 34, 38. Außerdem jüngsten Fortschritte in der gesamten Genoms Profilierung hat es möglich gemacht, um der nächsten Generation Sequenzierung verwenden, um die wahrscheinlichsten Kandidaten-Gene für die identifizierte Phänotyp eines mutierten Parasiten 34,38 verantwortlich sind. Unabhängig von der Mutagenese-Ansatz, Bestätigung der Rolle von dem Parasiten Gen der Resistenz gegen Makrophagenaktivierung erfordert letztendlich Gendeletion und Komplementation zu molekularer Koch-Postulate zu erfüllen. Die Fähigkeit, die Funktion eines Gens durch genetische Manipulation sowohl des Parasiten und dem Makrophagen zergliedern ist wichtig, da viele der über Vorwärts Genetik in T. identifizierten Gene gondii, wie auch andere Krankheitserreger, werden noch als hypothetische Gene mit wenig bis keine Sequenzhomologie zu anderen Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. Die aktuelle Papier einen allgemeinen Ansatz, der verwendet werden kann, um zu ermitteln, ob die unterbrochene Gen in einer Mutante ist wichtig für den Widerstand gegen eine bekannte oder umreißtunbekannt Vermittler von Zell autonome Immunität. Die erste Analyse der Host antimikrobielle Faktoren wird durch die Auswertung der Überlebensrate von Wildtyp und Mutante Parasiten in Makrophagen, die von Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu denen mit spezifischen Gendeletionen in induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH-Oxidase) durchgeführt wird, und spezifische Immunität GTPasen (IRGs). Damit wird festgelegt, ob die identifizierten Parasiten Gene sind wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffmonoxid, reaktive Sauerstoffzwischenprodukte oder Immunität GTPasen bzw. 28 oder wenn ein unbekannter Immunsystems beteiligt ist. Aktivierung der infizierten Makrophagen sowohl IFN-γ und LPS in der aktuellen Protokoll beschrieben, resultiert in erster Linie bei der Isolierung von Parasitengene wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffoxid 28. Die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die Stickstoffmonoxid in Abwesenheit von Makrophagen-Aktivierung zu induzieren (Stickoxiddonoren) bestätigte, dass die Mehrheit der identifizierten Gene, die für Wieder warenWiderstand gegen Stickstoffmonoxid anstatt Stickoxid zusammen mit weiteren Mediatoren mit Makrophagenaktivierung 28 verbunden. Schritt eins und zwei beschreiben eine Vorwärtsgenetik Bildschirm entworfen, um Parasiten Mutanten mit einem Fitness-Defekt nach der Aktivierung von infizierten Knochenmark-Makrophagen in vitro zu isolieren. Schritt eins beschreibt eine Dosistitration Analyse empirisch bestimmen eine Dosis von IFN-γ und LPS für Makrophagenaktivierung, die Parasiten Replikation reduziert, aber nicht vollständig hemmen die Replikation von Wildtyp T. verwenden gondii Elternstamm, die für die Erstellung der Bibliothek des Parasiten Mutanten verwendet wird. Schritt zwei wird die Vorwärts genetischen Screening der Mutanten-Klone in Makrophagen in 96-Well-Platten. Schritt drei beschreibt einen Ansatz, um den Phänotyp jeder Mutante in dem Bildschirm der 96-Well-Platten identifiziert und zu bewerten, ob der Fehler in jeder Mutante wirkt das Überleben der Parasiten, die Replikation zu bestätigen,oder Zysten Produktion als Antwort auf die Makrophagenaktivierung. Schritt vier wird die Verwendung von Knochenmark-Makrophagen von Mäusen mit Deletionen in spezifischen antimikrobiellen Wege um die Immunmediatoren, auf die der Parasit Mutante spezifisch empfindlich identifizieren. Schritt fünf beschreibt einen Ansatz, um zu bestimmen, ob ein Parasit Mutante ist auch für in vivo Pathogenese beeinträchtigt, wie durch Zystenproduktion in den Gehirnen von infizierten Mäusen ausgewertet.

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Protein-Konjugationskit</td><td>Life Technologies</td><td>A20181</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19135680</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2133236& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& crossRefData =ICN19135680=2& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedien</td><td>Vector Labs</td><td>H1200</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td></tr><tr><td>FITC-konjugierte Dolichos</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1031</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td></tr><tr><td>Antikörper gegen LAMP1</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank</td><td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Leben Technologien</td><td>L-7526</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td></tr><tr><td>C57BL6 Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td></tr><tr><td>gp91 phox knock out Mäuse</td><td>Jackson Labaoratories</td><td>2365</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td></tr><tr><td>iNOS knock out Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2609</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td></tr><tr><td>Natriumnitroprussid</td><td>ACROS Organics</td><td>AC21164-0250&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2627727& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>ACROS Organics</td><td>AC32865-0250</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2252389& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>Monoklonale Maus Anti-Toxoplasma gondii Ab</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10T19A</td><td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td></tr></tbody></table>

zukunfts genetics screens mit makrophagen zu identifizieren<em&gt; toxoplasma gondii</em&gt; gene wichtig für die resistenz gegenüber ifn-γ-abhängige zell autonome immunität

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, der Erreger der Toxoplasmose, ist ein obligat intrazellulärer Protozoen-Erreger. Der Parasit dringt in praktisch jeden warmblütigen Wirbeltierzelltyp ein und repliziert sich darin. Während der Invasion des Parasiten in eine Wirtszelle bildet der Parasit eine parasitophore Vakuole (PV), die unabhängig von der Phagozytose, in der sich der Parasit repliziert, von der Wirtszellmembran ausgeht. Während die IFN-abhängige angeborene und zellvermittelte Immunität für die spätere Kontrolle der Infektion wichtig ist, können angeborene Immunzellen, einschließlich Neutrophilen, Monozyten und dendritische Zellen, auch als Vehikel für die systemische Verbreitung des Parasiten zu Beginn der Infektion dienen. Es wird ein Ansatz beschrieben, der die angeborene Immunantwort des Wirts, in diesem Fall Makrophagen, in einem vorwärtsgerichteten genetischen Screen nutzt, um Parasitenmutanten mit einem Fitnessdefekt in infizierten Makrophagen nach Aktivierung, aber normaler Invasion und Replikation in naiven Makrophagen zu identifizieren. Auf diese Weise isoliert das Screening Parasitenmutanten, die einen spezifischen Defekt in ihrer Fähigkeit aufweisen, den Auswirkungen der Makrophagenaktivierung zu widerstehen. Die Arbeit beschreibt zwei grobe Phänotypen mutierter Parasiten nach Aktivierung infizierter Makrophagen: Parasitenstauung versus Parasitenabbau, oft in amorphen Vakuolen. Die Parasitenmutanten werden dann analysiert, um die verantwortlichen Parasitengene zu identifizieren, die speziell für die Resistenz gegen induzierte Mediatoren der zellautonomen Immunität wichtig sind. In der Arbeit wird ein allgemeiner Ansatz für das Forward-Genetik-Screening vorgestellt, der theoretisch so modifiziert werden kann, dass er auf Parasitengene abzielt, die für die Resistenz gegen spezifische antimikrobielle Mediatoren wichtig sind. Es wird auch ein Ansatz zur Bewertung der spezifischen antimikrobiellen Makrophagenmediatoren beschrieben, für die die Parasitenmutante anfällig ist. Die Aktivierung infizierter Makrophagen kann auch die Parasitendifferenzierung vom Tachyzoit- zum Bradyzoit-Stadium fördern, das eine chronische Infektion aufrechterhält. Daher wird eine Methodik vorgestellt, um die Bedeutung des identifizierten Parasitengens für die Etablierung chronischer Infektionen zu bewerten.

Toxoplasma gondii repliziert frei in naiven Makrophagen und weist eine Verdopplungszeit von 6-12 h in Abhängigkeit von der Belastung des Parasiten. Abbildung 1 zeigt repräsentative Parasiten in naiven Vergleich aktiviert Knochenmark stammenden Makrophagen. Abbildung 2 zeigt die allgemeine Morphologie des Parasiten in HFF Wirtszellen, die nach 2, 4, 8, 16 und 32 Parasiten / PV. In der gegenwärtigen Protokoll wird der Parasit darf naiv Makrophagen eindringen und stellen Sie eine ...

Vorwärtsgenetik ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung von Genen in intrazellulären Krankheitserregern, die für die Resistenz gegen zellautonome Immunität wichtig sind. Der derzeitige Ansatz verwendet angeborene Immunzellen, insbesondere Makrophagen, um neue Toxoplasma gondii-Gene zu identifizieren, die für die Immunevasion wichtig sind.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Vorwärts Genetik ist eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Ebene, wie...

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

Ein Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay mit THP1 Zellen...

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von murinen Makrophagen-Zelllinien mit siRNAs unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systems, zur Stimulation der Makrophagen mit Lipopolysaccharid und zur Überwachung der Auswirkungen auf die Produktion von entzündlichen Zytokinen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Stressresistenz ist eines der Markenzeichen für Langlebigkeit und ist bekannt, genetisch geregelt. Hier entwickelten wir eine unvoreingenommene Hochdurchsatzverfahren für Mutationen, die Stress-Resistenz verleihen in ES-Zellen, mit dem Maus-Modelle für Langlebigkeit Studien entwickeln zu screenen.

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Details werden dargelegt, wie die QTL-Kartierung mit einer genomalen Genomsequenz auf genetischer Weise zur Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in Toxoplasma gondii verwendet werden kann und wie dies mit dem CRISPR / Cas9-System verifiziert werden kann, das ein genomisches Ziel effizient bearbeitet, in diesem Fall die Arzneimittelresistenzgen...

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Um die Wirkung eines Chemokins auf die Makrophagenrekrutierung in vivo zu testen, wurde die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung verwendet, um die ektopische Expression des Chemokins zu erkennen, und Immunstaining wurde verwendet, um Makrophagen zu kennzeichnen. Live-Bildgebung wurde für die Echtzeitbeobachtung der Makrophagenmigration verwendet.

Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Erfahren Sie, wie Forward-Genetik genutzt wird, um Gene von Toxoplasma gondii zu identifizieren, die für die Immunevasion in Makrophagen entscheidend sind. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in Wirt-Pathogen-Interaktionen.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren Toxoplasma gondii Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität (Video) | JoVE Journal

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren

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