Name: Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und Ex Vivo Zellkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Lymphozyten aus menschlicher Haut für phänotypische Analyse und Ex Vivo Zellkultur. Diese Methode ermöglicht die effiziente Gewinnung vitaler T-Zellen für immunologische Studien.

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Hautbiopsien von Patienten mit Psoriasis wurden freundlicherweise von Dr. Andreas Koerber (Dermatologie-Abteilung an der Universität Essen, Deutschland) nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung gestellt. XH wird auch durch NSFC 61263039 und 11101321 NSFC unterstützt.

HINWEIS: Hautbiopsien von gesunden Personen aus Bauchhaut Überbleibsel von Individuen erhalten wurden elektiven plastische Chirurgie nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke. Die Verwendung menschlicher Haut wurde genehmigt und in Übereinstimmung mit den gesetzten Regeln von der medizinischen Ethikkommission für Humanforschung der Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande und Universität Essen, Deutschland. 1. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus der menschlichen Haut (Work Sterile in einem Fluss Schrank wenn Nachfolgende Zellkultur ist erforderlich) <ol><li> Bereiten Zellkulturmedium: RPMI 1640 + Penicillin / Streptomycin (endgültige Konzentration 100 Einheiten / ml und 100 ug / ml, jeweils) + Pyruvat (0,02 mM) und Glutamax (0,02 mM) ohne Serum zugesetzt. </li><li> Bereiten komplette Kulturmedium: Kulturmedium, hergestellt in Schritt 1.1 + 10% humanes Serumsammel (HPS); Lagerung bei 4 ° C. Bringen Medium auf 20 ° C ± 2 vor unsing. </li><li> Besorgen Sie sich die Hautbiopsie eine 4mm lang Biopsie Punch Instrument und halten Sie es in RPMI1640 komplettem Kulturmedium bei 20 ° C ± 2 für bis zu 4 Stunden oder bei 4 ° C an. Verarbeiten Sie die Biopsie so schnell wie möglich bei der Ankunft im Labor. HINWEIS: Eine längere Lagerung der Haut wird die Zellausbeute und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen. </li><li> Beschriften Sie eine blau-capped Dissoziation Rohr und mit 5 ml komplettem Kulturmedium in das markierte Rohr. </li><li> 2 ml komplettem Kulturmedium in jede Vertiefung (insgesamt 3 wells) einer sterilen 6-well-Kulturplatte. Verwenden Sie sterile Werkzeuge, um die Biopsie in einem einzigen gut zu platzieren, spülen, verschieben Sie es zu einem zweiten weit über und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, also insgesamt drei Spülungen zu erreichen. </li><li> Übertragen Sie die gut gespült Hautbiopsie in eine sterile Petrischale, 100 &amp; mgr; l komplettem Kulturmedium auf der Oberseite der Biopsie und vorsichtig abkratzen das subkutane Fettgewebe mit einem Edelstahl-sterilen Einweg-Skalpell ab. HINWEIS: Thist, ist ein kritischer Schritt. </li><li> Schneiden Sie jede Hautbiopsie in 4 kleinere Stücke auf einer sterilen Petrischale. Transfer-Proben (bis zu vier von 4 mm Biopsien pro Röhrchen) auf die vorbereitete Dissoziation Röhrchen mit 5 ml komplettem Kulturmedium. </li><li> dicht schließen die Rohre mit der Kappe, und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator. Stellen Sie sicher, dass alle Probenmaterial in dem Bereich des Rotors befindet. </li><li> Starten Sie den Dissoziationsprozeß durch das &quot;Programm m_spleen _01&quot; läuft (ein vordefiniertes Programm zur Verfügung gestellt von den internen Speicher des Instruments oder durch die Begleitung Programmkarte), um die Biopsie bei der entsprechenden Drehzahl für 56 Sekunden zu distanzieren. </li><li> Nach der Bearbeitung lösen sich von der Dissociator die Dissoziation Rohr und stellen Sie sicher, dass alle das dissoziierte Material am Boden des Rohres gesammelt wird. </li><li> In 150 ul Kollagenase IA (80 mg / ml) in den Spaltrohr und Inkubation der Probe in einem geschüttelten Wasserbad bei 37° C für 60 min. 100 l DNase I (5 MU / ml) in thedissociation Rohr, gut mischen. Hinweis: Eine höhere Konzentration von Kollagenase oder längere Inkubationszeit wird die Lebensfähigkeit der Zellen zu verändern. </li><li> Bringen Sie die Dissoziation Rohr an der Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator und führen Sie das &quot;Programm m_ Milz _01&quot; die Biopsie ein weiteres Mal zu distanzieren. </li><li> Legen Sie eine 70 &amp; mgr; M Nylon Zelle Sieb auf der Spitze eines 50 ml-Falcon-Röhrchen. Anwenden dissoziierten Probenmaterialien auf diese Zellsieb Zellklumpen / Gewebereste zu entfernen. </li><li> Waschen Zellsieb einmal mit 5 ml vollständigem Kulturmedium. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 10 min und Überstand absaugen. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal. Resuspendieren Zellpellets in 300 &amp; mgr; l komplettem Kulturmedium. Einzelzellsuspensionen sind bereit für die weitere Analyse; weiterhin mit Protokollen für die ex vivo Zellkultur oder Zytometrie Analyse fließen. </li><li> Bei weiteren intracellular Zytokinfärbung stimulieren Zellen mit PMA (12,5 ng / ml), Ionomycin (500 ng / ml) und Brefeldin A (5 ug / ml) für 4 h bei 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 4 Stunden vor dem Strömungsdurchführen Zytometrie Analyse. </li></ol> 2. polyklonalen Aktivierung der Haut-Einwohner - T - Zellen (ex vivo Zellkultur) <ol><li> Aliquot 100 ul Einzelzellsuspensionen (hergestellt in Schritt 1.15) in einen Rundboden-96-Well-Platte. HINWEIS: Für jede der 4 mm Hautbiopsie können die erfassten Einzelzellsuspensionen in mindestens zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte aufgeteilt. </li><li> Hinzufügen anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beschichteten Microbeads (25.000 Kügelchen pro Vertiefung), rekombinantes menschliches Cytokin rIL-2 (Endkonzentration 25 U / ml) und rIL-1β (ng / ml Konzentration 50 final). </li><li> Decken Sie die Kulturplatte mit einem gut markierten Platte Deckel, Inkubation in 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit, 37 ° C Inkubator. Ändern Medium, wenn das Medium Farbe gelb wird. <br/&gt; Hinweis: Eine klare Zellkolonie von Tag 8 der Zellkultur beobachtet werden können. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie Analyse von Primär- / kultivierten Haut-Einwohner-T-Zellen <ol><li> Bereiten Sie FACS-Puffer: PBS + 0,2% BSA. </li><li> Übertragen Zellen von Interesse in einer V-Boden 96-Well-Platte. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 100 ul PBS. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Stain Zellen mit 100 &amp; mgr; l präparierte eFluorescence780 konjugiert fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff (1: 1000 Verdünnung mit PBS) bei 4 ° C für 30 min. Füge 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Wählen Sie das gewünschte Zelloberflächenmarker mAb, zum Beispiel: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TÜK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), und CD1c-APC (AD5-8E7, die mAb-Mischung unter Verwendung von FACS-Puffer 1:10), bereiten nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe. </li><li> In 25 ul vorbereitet mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren 20 min bei 20 ° C ± 2, vor Licht schützen. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Bei Proben, die nur Zeiloberflächenfärbung erfordern, weiter mit Schritt 3.16. </li><li> Bei intrazellulären Foxp3-Färbung: <ol><li> Bereiten Fixierung und Permeabilisierung Puffer von einem Teil Konzentrat mit 3 Teilen Verdünnungsmittel zu mischen. </li><li> Vorbereitung 1x Permeabilisierung Puffer: 1 Teil 10x Permeabilisierung Puffer + 9 Teile sterilisiert H 2 O. </li></ol></li><li> Resuspendieren Pellets in 100 ul Fixierung und Diffusionsratesation Puffer, mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min. </li><li> 100 l Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung, Zentrifuge bei 450 × g bei RT für 2 min und absaugen Überstand. </li><li> Wash-Zellen mit Permeabilisierung Puffer noch einmal. </li><li> Wählen erforderlich intrazellulärem mAbs, beispielsweise Foxp3-eFluo450 (pCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) und IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereiten Sie die mAbs Mischung Permeabilisierung Puffer mit 2% normalem Rattenserum nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe. </li><li> In 20 ul der vorbereiteten mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min, vor Licht zu schützen. </li><li> Nach 30 min Inkubation in jede Vertiefung 100 ul Permeabilisierung Puffer hinzuzufügen. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Wash-Zellen mit Permeabilisierung buffer ein weiteres Mal. Pellet in 110 &amp; mgr; l FACS-Puffer und Transfer Zellsuspensionen in microFACS Rohr. HINWEIS: Probe ist bereit für die Messung mit 10-Farben-Durchflusszytometrie. </li><li> Bei genaue Zellzahl erforderlich, fügen Sie 10 ul gut gemischten einheitliche Suspension von Fluorospheres in jeder Probe unmittelbar vor der Durchführung von Messungen mittels Durchflusszytometrie. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Haut resident T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien isolieren. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Isolierung von relativ hohen Anzahl lebensfähiger Lymphozyten und relevante Oberflächenmarker exprimieren. Die Zell - Untergruppen identifiziert wurden , waren: CD11c + DCs, CD4 + und CD8 + T - Zellen und Foxp3 + CD25 + Zellen. Wichtig ist , dass Ex - vivo - Kultur der isolierten Haut resident T -...

Die Haut, als primäre Schnittstelle zwischen dem Körper und der Umgebung, bietet die erste Verteidigungslinie gegen äußere physikalische, chemische und biologische Beleidigungen wie Verwundung, UV-Strahlung und Mikroorganismen. Haut besteht aus zwei Hauptfächer, die Epidermis und die Dermis, und enthält eine Vielzahl von Immunzellen einschließlich Langerhans&#39;schen Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen (DCs) und etwa 20 Milliarden Gedächtnis - T - Zellen, fast doppelt so viele , die in der gesamten Blutvolumen 1 , 2. Eine wachsende Zahl von Daten unterstützt die Vorstellung, dass die Haut wesentliche immunologische Funktionen, sowohl während der Gewebehomöostase und in verschiedenen pathologischen Zuständen. Immunzellen mit Wohnsitz in normaler Haut sind gedacht immunosurveillance 3 zu leiten und haben eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen wie Psoriasis 4 zu spielen gezeigt. In psoriatischer läsionaler Haut, sowohl CD4 + und CD8 + T - Zellen infiltriert waren observed und es wurde gezeigt , dass das Verhältnis der CD4 und CD8 5 auf der Krankheitszustand variiert. Jedoch sind diese Populationen von Zellen schwierig zu studieren, weil bestehende Techniken, um die Isolierung von nur wenigen Zellen ermöglichen. Die derzeit weit verbreiteten Techniken zur T-Zell-Isolierung aus der menschlichen Haut verbinden mechanische Haut Dissoziation mit enzymatische Behandlung. Menschliche Hautbiopsien werden in großem Umfang zerkleinert und inkubiert mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und / oder EDTA 6-8. Bedenkt man, dass die Haut eine Barrieregewebe ist, die Zugkräfte und mechanische Disaggregation sehr widerstandsfähig ist, die etablierten Methoden der T Zellisolierung sehr wenige Zellen produziert und noch geringere Anzahl von lebensfähigen Zellen, die ex vivo Zellkultur dieser Zellpopulationen schwierig macht , und herausfordernd. Hier berichten wir über eine modifizierte Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus gesunden und beteiligt psoriatischer menschliche Haut durch mechan Kombinationsche Dissoziation der Haut eines automatisierten Gewebe Dissociator anstatt die etablierte Methode ausgiebig zerkleinern, zusammen mit enzymatische Verdauung mit Kollagenase verwenden. Verschiedene lebensfähige Immunzelluntergruppen einschließlich DCs und T-Zellen wurden nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension beobachtet. Wichtig wurde die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gut erhalten. So hergestellten Zellen, sind bereit für den Einsatz in Ex - vivo - Zellkulturen oder Durchflusszytometrie - Analyse. Dieses Protokoll wurde für die Analyse der einzelnen Hautbiopsien (4 mm), abgeleitet von fallener Haut von Psoriasis-Patienten erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten , dass residente Haut Patienten T - Zellen mehr inflammatorische Zytokine wie IL-17 produziert und IFNy im Vergleich zu gesunden Probanden 9.

<table><tbody><tr><td>Einweg-Biopsie-Stanze</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Skalpelle</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C-Röhrchen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td> Mit <td>blauer Kappe, wird als Dissoziationsröhrchen verwendet.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Automatisierter Gewebedissoziator. Verwendung des "Programms spleen_01" zur Dissoziation der Hautbiopsie.</td></tr><tr><td>Sieb für Zellen&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 & Mikro; m Nylon</td></tr><tr><td>96-Well U-Bodenplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Mensch Gepooltes Serum (HPS)</td><td>hauseigene Herstellung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Typ 1-A, geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Abgestorbene Zellen vor der Zellfixierung färben; mit PBS im Verhältnis 1:1.000 verdünnen</td></tr><tr><td>Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilisierungspuffer (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Maus Anti-Human-CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Klon: HI30; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>FITC Maus anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Klon: TUK4; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>PE Maus anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Klon: MOC-1; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>ECD Maus anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Klon: UCHT1; Verdünnungsfaktor 1:50 für Oberflächenfärbung; Verdünnungsfaktor 1:25 für intrazelluläre Färbung.</td></tr><tr><td>PC5.5 Maus anti-human CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Klon: 13B8.2; Verdünnungsfaktor 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Maus anti-human CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Klon: BU15; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>APC Maus anti-human CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Klon: AD5-8E7; Verdünnungsfaktor 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Maus anti-human CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Klon: B9.11; Verdünnungsfaktor 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Maus Anti-Mensch CD19</td><td>Beckman - Schar</td><td>A94681</td><td>Klon: J3-119; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Maus Anti-Mensch CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Klon: BC96; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; PE Ratte Anti-Human-CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>Klon: HECA-452; Verdünnungsfaktor 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Ratte Anti-Human-Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Klon: PCH101; intrazelluläre Färbung; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Maus Anti-Human-IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Klon: eBio64DEC17; intrazelluläre Färbung; Verdünnungsfaktor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Maus Anti-Human-IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Klon: 4S. B3; intrazelluläre Färbung; Verdünnungsfaktor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorosphären</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Counting beads, für die Durchflusszytometrie</td></tr></tbody></table>

lymphocyte isolierung von menschlicher haut für phänotypische analyse und<em&gt; ex vivo</em&gt; zellkultur

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Die menschliche Haut hat eine wichtige Barrierefunktion und enthält verschiedene Immunzellen, die zu Gewebshomöostase und Schutz vor Krankheitserregern beitragen. Da die Haut für den Zugriff relativ einfach ist, bietet es eine ideale Plattform peripheren Immunregulationsmechanismen zu untersuchen. Immun-residenten Zellen in gesunde Haut Verhalten immunosurveillance, sondern spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Hauterkrankungen wie Psoriasis. Trotz Schwellen Einsichten, unser Verständnis der Biologie verschiedenen entzündlichen Hauterkrankungen zugrunde liegen noch begrenzt. Es besteht ein Bedarf für eine gute Qualität (single) Zellpopulationen aus biopsiert Hautproben isoliert. Bisher Isolierungsverfahren wurden durch einen Mangel an Erhalten einer ausreichenden Anzahl von lebensfähigen Zellen ernsthaft behindert. Isolierung und die anschließende Analyse wurden auch durch den Verlust der Immunzelllinie Marker, aufgrund der mechanischen und chemischen Beanspruchung durch die aktuellen Dissoziation Verfahren betroffen zu erhaltenEinzelzellsuspension. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode von T-Zellen zu isolieren, sowohl gesunde und engagierte psoriatischer menschliche Haut durch mechanische Haut Dissoziation Kombination eines automatisierten Gewebe Dissociator und Kollagenase Behandlung. Diese Methodik bewahrt Expression der meisten Immun Linie Marker wie CD4, CD8, Foxp3 und CD11c auf die Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Beispiele für erfolgreiche CD4 + T - Zell - Isolierung und anschließende phänotypische und funktionelle Analyse gezeigt.

Das Protokoll hier präsentiert wird Ausbeute zwischen 2200 ± 615 (Mittelwert ± SEM, Haut von gesunden Probanden) bis 178.000 ± 760 (Mittelwert ± SEM, fallener Haut von Psoriasis-Patienten) rentable Lymphozyten aus der menschlichen Haut, wenn eine einzelne 4 mm Hautbiopsie. Verschiedene Arten von CD45 + Zellen wurden in Einzelzellsuspensionen identifiziert , die von der Haut von gesunden Personen einschließlich CD4 + T-Zellen (~ 45%), CD8 + T-Zellen (~ 30%) un...

Wir beschreiben ein Protokoll zur effizienten Isolierung von hautresidenten T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien. Dieses Protokoll liefert eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Lymphozyten in der menschlichen Haut für die durchflusszytometrische Analyse und die Ex-vivo-Kultur.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Haut-residente T-Zellen effizient aus menschlichen Hautbiopsien zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche Hautbiopsien mit einer runden Biopsiezange gewonnen werden. Anschließend wird jede Hautbiopsie in einer Petrischale in vier kleinere Stücke zerschnitten. Anschließend wird das Hautgewebe mechanisch und enzymatisch dissoziiert, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Abschließend werden die im Hautgewebe residenten Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert und ex vivo kultiviert. Letztendlich können ausreichende Mengen an vitalen humanen, im Hautgewebe residenten Lymphozyten isoliert und durch Immunfärbung sowie FACS-Analyse untersucht werden.Diese Methode trägt dazu bei, zentrale Fragen in der Dermatologie und der Immunologie der Hauttumoren zu beantworten. Zum Beispiel, wie im Hautgewebe ansässige T-Zellen zur Erkrankung beitragen. Die Durchführung der Methode wird Xuehui He, ein Doktorand aus unserem Labor, demonstrieren.Nach der Zubereitung des Kulturmediums gemäß dem Textprotokoll zwei Milliliter komplettes Medium in drei Vertiefungen einer sterilen sechswelligen Kulturplatte geben. Anschließend mit einer vier Millimeter runden Biopsiepunch eine Hautbiopsie entnehmen. Diese in RPMI 1640 komplettes Kulturmedium geben und bis zu vier Stunden bei Raumtemperatur auf dem Laborpult belassen oder über Nacht bei vier Grad Celsius lagern.Während die Biopsie inkubiert, beschriften Sie ein blau gedeckeltes Dissoziationssröhrchen und geben fünf Milliliter komplettes Kulturmedium hinzu. Verwenden Sie anschließend sterile Instrumente, um die Biopsie in die erste Vertiefung zum Spülen zu legen. Überführen Sie das Gewebe in die zweite Vertiefung, spülen Sie es erneut und wiederholen Sie den Vorgang danach ein weiteres Mal in der dritten Vertiefung.Überführen Sie die gut gespülte Hautbiopsie in eine sterile Petrischale und pipettieren Sie 100 Mikroliter vollständiges Kulturmedium auf die Probe. Entfernen Sie dann mithilfe eines sterilen Einweg-Skalpells aus rostfreiem Stahl vorsichtig das subkutane Fettgewebe. Schneiden Sie jede Hautbiopsie in einer frischen sterilen Petrischale in vier kleinere Stücke.Überführen Sie die Proben anschließend in die vorbereitete Dissoziationsschlauchflasche, die fünf Milliliter komplettes Medium enthält. Verschließen Sie die Flasche fest und befestigen Sie sie verkehrt herum am Ärmel des automatisierten Gewebedispergierers. Achten Sie darauf, dass sich das gesamte Probenmaterial im Bereich des Rotors befindet.Starten Sie als Nächstes den Dissoziationsprozess, indem Sie das Programm M Milz null eins ausführen, um die Biopsie für 56 Sekunden bei der geeigneten Drehzahl zu dissoziieren. Trennen Sie nach der Verarbeitung das Dissoziationssystem vom Dissoziator und stellen Sie sicher, dass sich das gesamte dissoziierte Material am Boden des Rohrs sammelt.Fügen Sie 150 µL kollagenhaltiges One A dem Dissoziationstube hinzu und inkubieren Sie die Probe 60 Minuten lang in einem schüttelnden Wasserbad bei 37 °C. Geben Sie anschließend 100 µL DNase in den Dissoziationstube und mischen Sie gründlich. Befestigen Sie den Dissoziationstube an der Hülse des automatisierten Gewebe-Dissoziators und führen Sie Programm M Milz null eins aus, um die Biopsie ein weiteres Mal zu dissoziieren.Danach einen 70-Mikrometer-Nylon-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen setzen und das dissoziierte Probenmaterial auf den Zellsieb auftragen, um Zellklumpen und Gewebeabfälle zu entfernen. Den Zellsieb anschließend einmal mit fünf Millilitern komplettem Medium spülen. Anschließend das Filtrat bei 450 × g und 20 Grad Celsius, plus oder minus zwei Grad, zehn Minuten lang zentrifugieren und danach den Überstand abpipettieren.Nachdem der Waschschritt nochmals wiederholt wurde, die Zellpellets mit 300 µL vollständigem Kulturmedium resuspendieren. Die Einzelzell-Suspensionen sind nun bereit für die weitere Analyse. Für die intrazelluläre Zytokinstainung die Zellen mit PMA, Ionomycin und Brefeldin A stimulieren und vor der Durchflusszytometrie-Analyse vier Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Um eine polyklonale Aktivierung der in der Haut residenten T-Zellen durchzuführen, portionieren Sie 100 Mikroliter der Einzelzell-Suspension in eine rundbodige 96-Well-Platte. Geben Sie anti-CD3-, anti-CD28-Massenantikörper-gebundene Mikroperlen, rekombinantes humanes Zytokin, IL-2 und IL-1B hinzu. Decken Sie die Kulturplatte mit einem gewichteten Deckel ab und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit. Dann wechseln Sie das Medium, sobald die Farbe des Mediums gelb wird. Am achten Tag kann in der Zellkultur eine klare Zellkolonie beobachtet werden. Für die FACS-Analyse überführen Sie die Zellen von Interesse in eine V-förmige 96-Well-Platte.Zentrifugieren Sie bei 450 × g und 20 Grad Celsius, plus oder minus zwei Grad, für zwei Minuten. Anschließend den Überstand abpipettieren. Verwenden Sie 100 µL der vorbereiteten fluoreszierenden, mit 780 konjugierten, fixierbaren Vitalitätsfärbung, um die Zellen durch Inkubation bei vier Grad Celsius für 30 Minuten zu färben.Als Nächstes 100 Mikroliter FACS-Puffer hinzufügen und zentrifugieren, bevor das Überstand entfernt wird. Danach, nach Auswahl der monoklonalen Antikörper gegen die Zelloberflächenmarker aus der im Textprotokoll bereitgestellten Liste, die Antikörperlösungen mit FACS-Puffer herstellen. Zum Festlegen der Gating-Einstellungen den Isotypkontrollantikörper der Antikörper zusammen mit einer nichtgefärbten Probe verwenden.Fügen Sie nun 25 Mikroliter der vorbereiteten Maus-Antikörper-Mischung in jede Vertiefung hinzu und schützen Sie vor Licht. Inkubieren Sie bei 20 Grad Celsius für 20 Minuten. Geben Sie 100 Mikroliter FACS-Puffer hinzu, zentrifugieren Sie und aspirieren Sie den Überstand.Unter Verwendung von Puffern, die gemäß dem Textprotokoll für die Foxp3-Färbung hergestellt wurden, 100 Mikroliter Fixierungs- und Permeabilisierungspuffer hinzufügen, um die Pellets erneut aufzuschwemmen. Gut mischen und 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend 100 Mikroliter Permeabilisierungspuffer zu jedem Well hinzufügen und nach der Zentrifugation den Überstand absaugen.Nachdem die Zellen erneut gewaschen und die geeigneten Antikörper ausgewählt wurden, 20 µL der vorbereiteten monoklonalen Antikörpermischung in jede Vertiefung geben und vor Licht schützen, bevor sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubiert werden. Mit Permeabilisierungspuffer die Zellen erneut waschen. Anschließend die Pellets mit 110 µL FACS-Puffer resuspendieren und die Zellsuspensionen in Mikro-FACS-Röhrchen überführen.Schließlich, wenn die exakte Zellanzahl erforderlich ist, 10 Mikroliter einer gut gemischten, homogenen Suspension von Fluorosphären unmittelbar vor der Durchführung der FACS-Messungen zu jeder Probe hinzufügen. Wie hier gezeigt, wurden verschiedene Typen von CD45-positiven Leukozyten in Einzelzell-Suspensionen identifiziert, die aus der Haut gesunder Individuen stammten. Dazu gehören CD4-positive T-Zellen, CD8-positive T-Zellen und CD11c-positive dendritische Zellen.Während nur wenige B-Zellen, NK-Zellen oder Mikrophagen beobachtet wurden. Außerdem ermöglicht die Methodik die Analyse von CD4-positiven, CD25-positiven, foxp3-positiven Zellen in menschlichen Hautbiopsien. Beispielsweise kann durch intrazelluläre Färbung nach Fixierung und Permeabilisierung der Nachweis der Expression des Transkriptionsfaktors foxp3 in CD25-positiven T-Zellen erbracht werden.Wie hier gezeigt, wird zur Vermeidung von Hintergrund-Autofluoreszenz und der autofluoreszierenden Zellpopulation empfohlen, den mit einem Brilliant Violent 421-Fluorochrom konjugierten anti-humanen CD45-Maus-Antikörper für das Gating der Lymphozytenpopulation zu verwenden. Diese Abbildung zeigt, dass der Großteil der im menschlichen Hautgewebe angesiedelten Zellen CD3-positive T-Zellen waren. Zur Analyse der Zellviabilität wird ein fixierbarer Viabilitätsfarbstoff empfohlen, um lebende von toten oder absterbenden Zellen zu unterscheiden.Für eine weitere funktionelle Analyse wurde anhand einer einzelnen vier Millimeter großen Hautbiopsie aus befallener Haut von Psoriasis-Patienten gezeigt, dass aus der Biopsie gewonnene T-Zellen IL-17a und Interferon Gamma produzieren. Nach einer vierstündigen Stimulation mit PMA und Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A. Abschließend zeigt diese Abbildung, dass T-Zellen von psoriatischen Individuen eine deutlich höhere Kapazität besitzen, die mit Psoriasis assoziierten Zytokine IL-17a und Interferon Gamma zu produzieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe und Laboragentien gefährlich sein kann.Berücksichtigen Sie stets Sicherheitsmaßnahmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Das Ziel des Protokolls ist es, lymphatische Endothelzellen menschlicher Lymphmissbildung zystenartige Gefäße und Vorhaut mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Anschließende Zellkultur und Expansion dieser Zellen ermöglicht eine neue Stufe der experimentellen Raffinesse für genetische, Proteomik, funktionale und Zelldifferenzierung Studien.

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Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

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