Name: Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung funktionaler Gefäßtransplantate aus partiell induzierten pluripotenten Stammzellen für ein Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellviabilität und Transplantationserfolg in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt von der British Heart Foundation und der The Oak Foundation.

Führen Sie alle Tierversuche nach Protokollen des Institutionellen Ausschusses für Benutzung und Pflege von Labortieren zugelassen. 1. Vorbereitung der Nährmedien <ol><li> Make Kulturmedien für den menschlichen Fibroblastenzelllinie CCL-153: F-12K-Medium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin und Streptomycin. </li><li> Stellen Reprogrammierung Medien für PiPSC Generation: Knockout Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 20% Knockout Serum Replacement, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM Minimum Essential Medium (MEM) Non-essentiellen Aminosäuren, 10 ng / ml Grund Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (bFGF-2) und 100 U / ml Penicillin und Streptomycin. Frisch jedes Mal hinzufügen bFGF-2, bevor Sie die Medien. </li><li> Make Differenzierungsmedium (DM) zu der glatten Muskelzellen induzieren (SMC) Differenzierung: α-MEM-Medium, enthaltend 10% FBS, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 100 U / ml Penicillin und Streptomycin und 25 ng / ml Blutplättchen-Wachstumsfaktor(PDGF-ββ). </li><li> Make Endotheldifferenzierung Medien (EC-DM) von Endothelzellen (EC) Differenzierung zu induzieren: Endotheliale Wachstumsmedien-2 (EGM-2) Medien, die 50 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und 100 U / ml Penicillin und Streptomycin. </li></ol> 2. Reprogramming menschlichen Fibroblasten in Teilweise induzierte pluripotente Stammzellen (PiPSC) <ol><li> Kultur menschlichen Fibroblasten-Zelllinie CCL-153 auf 0,04% Gelatinelösung beschichtet Kolben in Kulturmedium. </li><li> Passage-Zellen alle 3 Tage in einem Verhältnis von 1: 6. Verwenden Sie vor dem Durchgang 9 Zellen für eine optimale Effizienz der PiPSC Generation. Die Zellen sind bereit für die Transfektion bei Erreichen von 80 bis 90% Konfluenz. </li><li> Linearisieren polycistronischen Plasmid pCAG2LMKOSimO enthaltend 4 Reprogrammierungsfaktoren Octamer bindenden Transkriptionsfaktors 4 (OCT4) SOX2, Kruppel artigen Faktor 4 (KLF4) und C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug Plasmid mit 5 Einheiten Restriktionsenzym PvuI 3 h bei 37 ° C. Reinigendas Plasmid mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. </li><li> Transfizieren 2 x 10 6 menschlichen Fibroblasten, die mit 4 &amp; mgr; g linearisierter pCAG-OSKM Plasmid durch Elektroporation mit humanen dermalen Fibroblasten (NHDF) Nukleofektion Set nach dem Protokoll des Herstellers. Sanft Saatgut transfizierten Zellen auf Vor- 0,04% Gelatine beschichtete T25-Kolben mit 5 ml vorgewärmtem Reprogrammierung Medien. </li><li> Nach 24 Stunden wechseln Medium mit Ergänzungen von 25 ug / ml Neomycin, um eine reine Population transfizierter Zellen auszuwählen. </li><li> Ändern Medium jeden zweiten Tag bis zum Tag 4. Hinweis: Humane Fibroblasten werden PiPSC nach 4 Tagen der Umprogrammierung. </li></ol> 3. Differenzierung der PiPSC in Endothelzellen und glatte Muskelzellen <ol><li> Seed PiPSC auf Kollagen IV vorbeschichteten Schalen mit DM für 4 Tage, um die Differenzierung in SMCs induzieren. Ändern Medium jeden zweiten Tag bis zum Tag 4. </li><li> Seed PiPSC auf Kollagen IV vorbeschichtete Gerichte containing Endothel-DM für 6 Tage, um die Differenzierung zu Endothelzellen zu induzieren. Ändern Medium jeden zweiten Tag bis zum Tag 6. </li></ol> 4. Dezellularisierte Aorta Graft Vorbereitung Hinweis: Alle Lösungen und Geräte sollten steril sein. <ol><li> Opfern Sie die Maus durch Genickbruch und befestigen Sie die Maus in Rückenlage unter Dissektionsmikroskop. </li><li> Durch das Brustbein und um den Brustkorb geschnitten, um die Brusthöhle zu öffnen. Entfernen Sie die Herz, Lunge und Speiseröhre, um die Aorta aus. Entfernen Sie vorsichtig die peri-Aorta Fett mit einer Pinzette. </li><li> Schneiden Sie die Aorta vom vorderen Ende mit einer Schere und sanft halten Sie das Ende mit stumpfen Pinzette. Nehmen Sie die Aorta von der Wirbelsäule Spalte hinter stumpf. Alle Verzweigungs Arterien sorgfältig schließen aus der Aorta durch Ligation mit einem bipolaren Elektrokoagulator und Schneiden von dem fernen Ende der Ligation mit einer Schere. </li><li> Verwenden Sie ein 5-ml-Spritze, um die Aorta Lumen mit 3 m spülenl Kochsalzlösung, enthaltend 100 U Heparin, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. </li><li> Schneiden Sie das hintere Ende der Aorta, bevor es von Verzweigungen in die Nieren. Beibehaltung der Unversehrtheit des Aorta ist das ganze Verfahren sehr wichtig. </li><li> Spülen Sie die Aorta Lumen mit 5 ml 0,075% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt. </li><li> Weichen die Aorta in 0,075% SDS-Lösung in einer 10 cm Petrischale. Platzieren Sie die Petrischale auf einem Orbitalschüttler für 2 Stunden bei 150 Upm bei RT. </li><li> Spülen Sie die Aorta Lumen mit 5 ml PBS. </li><li> Weichen Sie die Aorta in PBS in einer 10 cm Petrischale. Platzieren Sie die Petrischale auf dem Orbitalschüttler für 2 Stunden bei 150 Upm bei RT. Aktualisieren PBS alle 20 min. </li><li> Spülen Sie die Aorta Lumen mit 5 ml PBS. </li><li> Halten dezellularisierten Transplantats Aorta in PBS bei 4 ° C für bis zu einer Woche. </li></ol> 5. Dual-Seeding von PiPSC und Bioreaktoranlage Hinweis: Alle Lösungs und Geräte sollten steril sein. Führen Sie alle Vorgänge in einer Gewebekultur Kapuze. <ol><li> Montieren Sie den Bioreaktor Strömungskreislauf, wie in Abbildung 1 dargestellt. Schließen Sie Inkubationskammer, Medienspeicher, Schlauchpumpe und Ausgleichkammer mit Schlauch. Minimal Volumen des Mediums für den Umlauf gebraucht wird, ist 40 ml. </li><li> Vorbedingung das dezellularisierte Gefäß mit Kulturmedium durch Einweichen der Aorta in DM Medium in einer 10 cm Petrischale. Platzieren Sie die Petrischale auf dem Orbitalschüttler für 1 Stunde bei 50 Umdrehungen pro Minute bei RT. </li><li> Setzen Sie 1 cm Länge Nylon Rohre (OD 0,9 mm, 0,75 mm ID) in beiden Enden des dezellularisierten Gefäß unter dem Mikroskop. Binden Sie das Schiff und die Schläuche mit 8-0 Seidenfäden. </li><li> Montieren Sie die dezellularisierte Aorta Graft in die Inkubationskammer durch die Einlass- und Auslasskanäle (1/32 &quot;Schlauch) von der Kammerwand, welche die Nylonrohre. Pflegen Inkubationskammer mit 5mls mittel jedes Mal. </li><li> Trypsinieren PiPSC durch Zugabe von vorgewärmtenTrypsin, um die Kulturschale zu decken und schaukeln das Gericht 10 Mal. Entsorgen Sie die Trypsin und lassen Sie das Gericht in Inkubator für 2-3 min. In vorgewärmten Kulturmedium in die Schüssel und mischen Sie das Medium mit den Zellen. </li><li> Graf Zellzahl mit einer Zählkammer. Zentrifuge zwei Aliquots von Zellsuspension mit 5 x 10 5 Zellen je 5 min bei 300 x g. Saugen Sie den Überstand vollständig. </li><li> Nach Absaugen der Überstand vollständig resuspendieren ein Pellet der PiPS Zellpellets in 50 ul DM. Spritzen Sie diese Zellsuspension in die dezellularisierte Gefäßlumen. </li><li> Dann resuspendieren anderen PiPS Zellpellet in 100 &amp; mgr; l Matrigel. Beim Pipettieren der Mischung auf die dezellularisierte Aorta Graft. </li><li> Warten Sie 10 bis 15 Minuten, bis die Mischung in einen gelartigen Zustand und wickelt sich um den Behälter Außenfläche gleichmäßig. Füllen Sie die Inkubationskammer mit DM. </li><li> Setzen Sie den ganzen Bioreaktor Einstellung in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Manuelles drehen Sie den dezellularisierten Transplantats 90 ° um die Längsachse jede halbe Stunde in der ersten 2 h. </li><li> Halten statischer Kultur für 12 Stunden, um die Zelladhäsion zu ermöglichen. </li><li> Liefern DM durch das Lumen durch die peristaltische Pumpe an der glatten Muskulatur-Zelldifferenzierung zu induzieren. Starten anfänglichen Flussrate bei 5 ml / min und die stufenweise Erhöhung auf 20 ml / min über 24 h. </li><li> Halten Sie das zirkulierende Medium Durchfluss bei 20 ml / min für 24 Stunden. </li><li> Halten Sie den Medienstrom und bewegen Sie den Bioreaktor Einstellung aus dem Inkubator. </li><li> Re-Samen das Lumen des Transplantats mit PiPSC. Trypsinieren, zählen und Zentrifuge 1 x 10 6 PiPSC wie in Schritten von 5,5 bis 5,6. Resuspendieren der Zellen in 50 &amp; mgr; l EGM-2-Medium, enthaltend 50 ng / ml VEGF. Spritzen den Zellgemisch in das Lumen des Transplantats. </li><li> Ändern Sie das Medium in der Inkubationskammer und Vollblutung EGM-2 Medium mit 50 ng / ml VEGF an endotheliale Differenzierung zu induzieren. </li><li> Bewegen Sie den Bioreaktor Einstellung zurück auf thE-Inkubator. Hand drehen das Transplantat 90 ° alle 30 Minuten in der ersten 2 h und dann halten eine statische Kultur für 12 Stunden. </li><li> Starten Zirkulationsströmung von 5 ml / min und der stufenweisen Erhöhung auf 35 ml / min. Halten der Strömungsrate auf 35 ml / min für 5 Tage. Ändern zirkulierenden und Kammer Medium jeden zweiten Tag. </li><li> Ernten Sie die entwickelt Transplantat für die weitere Veredelung zu Maus. </li></ol> 6. Pfropfen von Doppel ausgesät PiPSC Graft in Mäuse <ol><li> Verwenden NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl männlichen Mäusen als Gefäßtransplantat-Empfänger. Achten Sie immer darauf, dass die Mäuse sind ca. 10 Wochen alt, wiegt etwa 25 - 35 g, und in einem guten gesundheitlichen Bedingungen. </li><li> Anesthetize Empfängermaus durch Verabreichung einer Kombination von Hypnorm (25 mg / kg) und Hypnovel (25 mg / kg) intraperitoneal. Bewerben Vaseline Augensalbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Bestätigen effiziente Betäubung, indem sichergestellt wird, dass Mäuse entspannt Muskeln und stetig zu atmen. <ol><li> Befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit seinem Hals rasiert und erweitert. Verabreichen Atropinsulfat (1,7 mg / kg) in Kombination mit den Anästhetika, um sicherzustellen, dass die Atemwege der Maus klar bleibt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie ein Mittellinienschnitt aus dem Unterkiefer zu Brustbein der Maus. Unter einem Binokular mit 5- bis 10-fache Verstärkung, heben Sie die richtigen Speicheldrüsen seitlich und nehmen Sie die richtige sternocleidomastoideus, um die rechte Arteria carotis communis freizulegen. </li><li> Entfernen sanft angebracht Geweben, die rechte Arteria carotis communis aus dem distalen Ende zu dem proximalen Ende zu mobilisieren. Ligieren der mittlere Abschnitt der Arteria carotis communis zweimal mit einem 8-0-Seidenfaden und sezieren zwischen den beiden Bindungen. </li><li> Fahren Sie durch eine Manschette aus autoklavierbarem Nylonschlauch in jedem Gefäß Ende gemacht und fixieren Sie jedes Ende mit microhemostat Schellen. </li><li> Entfernen Nahtverbindungs ​​an einem Ende und einen Tropfen Heparin (100 U / ml). Unmittelbar danach invertieren das distale Ende des the Arterie, die ganze Manschette Körper bedecken und befestigen Sie den umgekehrten Gefäß mit einem 8-0 Seidennaht an der Manschette. <ol><li> Das Verfahren wird wiederholt, um den anderen Abschnitt der Arterie. Flush Arterie mit Kochsalzlösung, um Blutgerinnsel zu entfernen. </li></ol></li><li> Implantieren eine dezellularisierte Gefäßtransplantat zwischen zwei Enden der Halsschlagader durch Verschieben der dezellularisierten Gefäßenden die in den Arterien Bündchen und Befestigung mit 8-0 Seidenfäden. Entfernen Gefäßklemmen entweder endet, bevor die Bewertung der Pulsation des Transplantats. </li><li> Legen Sie den rechten Speicheldrüsen wieder in seine ursprüngliche Position. Schließen der Haut an der chirurgischen Stelle mit einer unterbrochenen Naht unter Verwendung eines 6-0 Polyglactin Naht. </li><li> Konsequent beobachten Vital Maus, nachdem die Prozedur abgeschlossen ist, bis es das Bewußtsein wieder. Sacrifice Empfängermäuse durch Genickbruch und Erntegefäßimplantate entweder 24 Stunden oder 3 Wochen später für weitere Analysen. </li></ol>

<ol><li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li>
<li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+insight%3A+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li>
<li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118(2014).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34%2B+progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK%2FERK+and+BMP4+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li>
<li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li>
<li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li>
<li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li>
<li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+control+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirolimus+stimulates+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor%2Fextracellular+signal-regulated+kinase%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li>
<li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li>
<li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li>
<li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine widerstreitenden finanziellen Interessen.

Das aktuelle Protokoll wird der Ton, schnelle, einfache, effiziente und reproduzierbare Strategie, bei der funktionellen Tissue Engineering Tanks können über PiPSC aus humanen Fibroblasten erzeugt werden. Diese Technik stellt ein wertvolles Werkzeug für die regenerative Medizin, Tissue Engineering und möglicherweise patientenspezifischer Zelltherapie in naher Zukunft. Kritische Schritte, um die Wirksamkeit des Protokolls sicher umfassen die Herstellung von PiPSC, Herstellung von sterilen und voll dezellularisierten Aort...

Der Bau des vaskulären Conduits ist eine grundlegende Strategie für chirurgische Reparatur von beschädigten und verletzte Gefäße von Herz-Kreislauf- Erkrankungen resultieren. Bis heute sind in der Chirurgie Transplantatmaterialien biokompatible synthetische Polymere (Polytetrafluorethylen [Teflon], expandiertem Polytetrafluorethylen [ePTFE, Gore-Tex] oder Polyethylenterephthalat [Dacron]), allogene Transplantate, körpereigenes Gewebe (Herzbeutel oder Vena saphena) und Xenotransplantate 1. Während künstliche Transplantate (zB Gore-Tex und Dacron) werden am häufigsten verwendet, diese Materialien wahrscheinlich dazu führen zahlreiche kurz- und langfristige Komplikationen, die Stenose, Kalziumablagerung, thrombo-Embolisation und Infektionen gehören. Obwohl Patienten mit mit vorhandenen biologische Transplantate verringert thromboembolischer Ereignisse, sie immer noch Grenzen stoßen, wie sekundären Transplantatversagen und verkürzt die Haltbarkeit wegen Verkalkung Abbau 2. Daher ist trotz erheblichen Verbesserungen in der chirurgischen techniques über die Jahre, Forschern und Klinikern immer noch die Notwendigkeit zur Identifizierung der idealen Leitung für Gefäßerkrankungen belastet. In jüngerer Zeit hat sich die Forschung zur vaskulären Gewebetechnik, ein Konzept, bei dem Zellen in biologisch abbaubare Gerüst eingebaut, mit dem Ziel, einen biomimetischen Umgebung, die eine funktionelle Gefäß zur erfolgreichen Pfropfung 1 verkörpert erzeugt. Grundsätzlich ist der Erfolg der Gefäßkonstrukte hängen von drei wesentlichen Komponenten; Zellen, die das Gerüst, das heißt, eine Endothelzelle innere Schicht und eine glatte Muskelzellschicht, ein Gerüst, das die entsprechende extrazelluläre Matrix auf vergleichbare mechanische Eigenschaften der nativen Vaskulatur bereitzustellen, und das Molekular / zelluläre Signalübertragung, das zur Initiierung / Regel erforderliche umfassen Reparatur. Langzeittransplantatdurchgängigkeit und nachhaltige Entwicklung der neo-Gewebe sind in hohem Maße auf effektive Zellaussaat von Gerüsten, thereby Rendern der Entscheidung des Zelltyp von entscheidender Bedeutung. Mehrere Berichte zeigen die Verwendung von reifen Endothelzellen und glatte Muskelzellen aus verschiedenen Quellen, um Leitungen 3-6 kleinen Durchmesser zu entwickeln. Obwohl vielversprechend, um das Fehlen einer ausreichenden autologen Gefäße erhalten reifen Endothelzellen und glatte Muskelzellen vor eine erhebliche Belastung. In jüngerer Zeit haben Stammzellen aus verschiedenen Quellen für Gefäßgewebe-Engineering-Anwendungen genutzt. Tat eine Vielzahl von Stammzelltypen einschließlich embryonaler Stammzellen 7, pluripotenten Stammzellen (iPS) 8,9, PiPSC 10,11, Knochenmark stammenden mononukleären Zellen 12, mesenchymale Stammzellen 13, endotheliale Vorläuferzellen und adulte Gefßwand -abgeleiteten Stammzellenantigen-1 (Sca-1) + Stammzellen / Vorläuferzellen 14,15 wurden alle gezeigt, dass sie in der Lage, die Differenzierung werden entweder funktionelle Endothelzellen oder Zellen der glatten Muskulatur als Antwort auf definierten Medien undKulturbedingungen. Darüber hinaus machen die unbegrenzte Selbsterneuerungsfähigkeit der Stammzellen ihnen bessere Kandidaten Gegensatz reifen Endothelzellen und glatte Muskelzellen, die nur für eine begrenzte Anzahl von Malen teilen können vor einer Wachstumsarrest und Seneszenz. Die Auswahl der Gerüstmaterial für eine erfolgreiche Gewebezüchtung Behälter erzeugen für die Veredelung von mehreren Faktoren abhängig, wie Biokompatibilität, biomechanischen Eigenschaften und Geschwindigkeit des biologischen Abbaus. Grundsätzlich verwendeten Materialien, um Gerüste für Transplantate erstellen sollten biologisch abbaubar sein und wird nicht gemountet unnötige Empfänger Immunantworten. Darüber hinaus müssen sie eine geeignete Porosität und Mikrostruktur für die Zellanheftung und anschließende Überlebens umfassen. Bis heute sind die am häufigsten für Gerüste in vaskulären Gewebetechnik verwendeten Materialien umfassen Polymere von Polyglykolsäure, Polymilchsäure und Poly-ε-caprolacton 16. In jüngerer Zeit haben dezellularisierten biologischen Materialienauch mit einigem Erfolg angewendet. Mehrere Labors haben gezeigt, dass der Aussaat dezellularisierte Mensch, Hund oder Schwein Gefäße mit patienteneigenen Zellen ein biologischen Transplantats, die Blutgerinnung und Intimahyperplasie 17-19 widerstanden. Andere Strategien in der Gefäß Tissue Engineering sind extrazellulären Matrixproteinen basierenden Gefäßprothesen zB Aussaat Zellen in Fibrin-Gel 13 und das Erzeugen Zellschichten ohne Stützträger 20, 21. Die aktuelle Protokoll zeigt die Differenzierung von humanen PiPSC in funktionelle Endothel- und glatte Muskelzellen, die Erzeugung von einem Bioreaktor, bestehend aus einer dezellularisierten Gefäßgerüst funktionelle PiPSC abgeleiteten Gefäßzellen beherbergen, und Pfropfen der Gewebezüchtung Gefäßen in severe combined immunodeficiency (SCID ) Mäusen. PiPSC sind eine optimale Zelltyp für das Tissue Engineering von Gefäßtransplantaten zu verwenden, da diese Zellen nicht-Tumoren in Mäusen bilden oder ethische undallo-Immunantworten. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Strategie zur Erzeugung von pips-Endothelzellen und Zacken-glatten Muskelzellen ist effiziente und reproduzierbare 10,11. Danach haben wir eine dezellularisierte Gefäß für die Aussaat von PiPSC abgeleiteten Gefäßzellen, um die Matrixproteine, die in einem nativen Gefäß existiert genau imitieren und somit eine Verbesserung Pfropfen und Überleben Wirksamkeit. Ferner die Dezellularisierung der Gefäße vor PiPSC Aussaat verhindert das Auftreten von entzündlichen Reaktionen, die durch Immunzelltypen montiert, wie Makrophagen. Noch wichtiger ist, hat das Protokoll nicht nur stellen eine Methode zur Erzeugung von vielversprechenden Gefäßleitungen für die Übersetzung in Menschen, sondern auch eine wertvolle Hilfe von Studium und Verständnis der molekularen Mechanismen, die Gefäßgeweberegeneration durch Mausmodellen zu regieren.

<table><tbody><tr><td>Humane Fibroblasten CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Pränatale humane embryonale Fibroblasten</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM Medium, optimiert für embryonale Stammzellen</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement Life</td><td>Technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human-Basic FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Lebenstechnologien (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R& D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatinelösung 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgen</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PvuI Restriktionsenzym</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Beleuchtung für Stereomikroskopie</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Kaltlichtbeleuchtung für Stereomikroskopie</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromikroskop SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Stammlösung Molekularbiologie Reagenz</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Schüttler IKA Vibrax mit Schüttelplattform VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton's, Janke& Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digitaler Pumpenantrieb</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-Kanal, 6-Rollen-Pumpenkopf</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S große Kartuschen für Pumpenkopf</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinvernetzter Silikonpumpenschlauch, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-96410-14</td><td>Der Schlauch geht durch die Schlauchpumpe</td></tr><tr><td>0,5 mm Innendurchmesser, 0,8 mm Außendurchmesser Silikonschlauch</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Schläuche verbinden die Inkubationskammer, das Medienreservoir und die Compliance-Kammer.</td></tr><tr><td>Verschraubung Reduzierstück 0,5 bis 1,6, natur Polypropylin</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adapter Anschluss über zwei Schlauchtypen</td></tr><tr><td>1/32" Schlauch, ID 0,01" (250&micro; m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Schlauch durch die Inkubationskammerwand, der das Transplantat mit dem Außenschlauch verbindet</td></tr><tr><td>Einteilige Anschlüsse&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Befestigen Sie die oben genannten Schläuche durch die Wand der Inkubationskammer</td></tr>. <tr><td>Nylonschläuche (AD 0,9 mm, ID 0,75 mm)&nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>Schläuche werden in zwei Enden des Aortentransplantats</td></tr><tr><td>NOD eingeführt. CB17-Prkdcscid/NcrCrl Maus</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Nähte, 8-0&nbsp; Seide</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgetikum zur Anwendung bei Mäusen</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Einleitung der Anästhesie</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nylonschlauch</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0,65 mm Durchmesser und 1 mm Länge; zur Herstellung von Arterienmanschette</td></tr><tr><td>Elektrokoagulator</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligatur von Arterienästen an der Aorta</td></tr><tr><td>Bipolare Mikrohämostatenzange</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixation von Gefäßenden</td></tr><tr><td>Gefäßdilatator</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Gefäßdilatator</td><td>S& T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Gefäßdilatator</td><td>S& T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini Applikation&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Hämostaten Clips</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Nahtmaterial, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung und pfropfen von tissue engineering gefäße in einem maus-modell

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Der Bau von Gefäßkanälen ist eine grundlegende Strategie für die chirurgische Reparatur von beschädigten und verletzten Gefäßen, die aus Herz-Kreislauf-Erkrankungen resultieren. Das aktuelle Protokoll stellt eine effiziente und reproduzierbare Strategie dar, bei der funktionelle Tissue-Engineering-Gefäßtransplantate unter Verwendung von teilweise induzierten pluripotenten Stammzellen (PiPSC) aus menschlichen Fibroblasten erzeugt werden können. Wir haben einen dezellularisierten Gefäßgerüst-Bioreaktor entwickelt, der die Matrixproteinstruktur und den Blutfluss in einem nativen Gefäß genau nachahmt, für die Aussaat von PiPSC-Endothelzellen oder glatten Muskelzellen vor der Transplantation in Mäuse. Dieser Ansatz erwies sich als vorteilhaft, da immundefiziente Mäuse, die mit den PiPSC-abgeleiteten Transplantaten transplantiert wurden, 3 Wochen nach der Operation eine deutlich erhöhte Überlebensrate aufwiesen. Dieses Protokoll stellt ein wertvolles Werkzeug für die regenerative Medizin, das Tissue Engineering und die potenziell patientenspezifische Zelltherapie in naher Zukunft dar.

Die erfolgreiche Generation von PiPSC wurde 4 Tage nach der bestätigten nucleofecting menschlichen Fibroblasten mit einem linea pCAG2LMKOSimO Plasmid, das 4-Transkriptionsfaktoren, OCT4, SOX2, Klf4 und c-MYC (OSKM). PiPSC zeigte eine deutlich unterschiedliche Phänotyp im Vergleich zu Fibroblasten (2A) und drückte die 4 Reprogrammierungsfaktoren an mRNA (2B) und Eiweiß (2C) Ebenen 10. Die Wirksamkeit eines PiPSC Basis Gefßtransplantat ist stark abhängig von de...

Hier zur Gewebezüchtung Gefäßimplantate, die zum Pfropfen in Mäusen durch Impfen Doppel partiell pluripotenten Stammzellen funktional erzeugen präsentieren wir ein Protokoll (PiPSC) - abgeleiteten glatten Muskelzellen und PiPSC - abgeleitete Endothelzellen auf einer dezellularisierten Gefäßgerüst Bioreaktor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gewebeengineeringbasierte Gefäßtransplantate herzustellen, die funktionsfähig für die Transplantation in Mäuse sind. Dies wird erreicht, indem menschliche Fibroblasten zunächst in vitro zu teilweise induzierten pluripotenten Stammzellen umprogrammiert werden, die zur Differenzierung in endotheliale und glatte Muskelzellen fähig sind. Anschließend wird eine Aorta von einer getöteten Maus entnommen und mit einer Natriumlaurylsulfat- oder SDS-Lösung dezellularisiert, um die dezellularisierten Aortatransplantate vorzubereiten.Anschließend wird der Durchflusskreislauf des Bioreaktors für die doppelte Besiedlung von teilweise induzierten pluripotenten Stammzellen eingerichtet. Der letzte Schritt besteht in der Transplantation des doppelt besiedelten Transplantats aus teilweise induzierten pluripotenten Stammzellen in Mäuse. Abschließend wird die Analyse der Sterblichkeitsraten der Mäuse drei Wochen nach der Transplantation verwendet, um die Funktionalität der gewebeengineeringbasierten Gefäßtransplantate zu demonstrieren.Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen hinein, da gezeigt wurde, dass mit PIPS-Zellen in kurzer Zeit funktionstüchtige Blutgefäße erfolgreich erzeugt werden können. Im Allgemeinen ist es sehr wichtig, den Gefäßtransplantat während des gesamten Verfahrens intakt und steril zu halten, insbesondere für Personen, die neu in dieser Methode sind. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in partiell induzierte pluripotente Stammzellen oder PIPS-Zellen, indem die Zellen mit vier Mikrogramm linearisiertem OSKM-Plasmid mittels eines Nuclear-Affektions-Kits für humane dermale Fibroblasten transfiziert werden.Menschliche Fibroblasten werden nach vier Tagen der Umprogrammierung zu PIPS-Zellen. Nach der Tötung der Maus durch Halswirbelaustraktion. Legen Sie die Maus in Rückenlage unter ein Stereomikroskop.Danach durch das Brustbein und entlang des Rippenbogens schneiden, um die Brusthöhle zu öffnen. Herz, Lunge und Speiseröhre entfernen, um die Aorta freizulegen, und anschließend vorsichtig das periaortale Fett mit einer Pinzette ablösen. Die Aorta am vorderen Ende mit der Schere durchschneiden und das Ende vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette festhalten.Danach die Aorta durch stumpfe Dissektion von der Wirbelsäule hinter ihr ablösen. Sorgfältig alle Seitenäste der Aorta durch Ligatur mit einem bipolarer Elektrokoagulationseinheit verschließen und distal zur Ligatur mit der Schere durchtrennen. Die Aortenlumina mit einem Fünf-Milliliter-Spritze mit drei Milliliter Kochsalzlösung, die 100 Einheiten Heparin enthält, spülen.Um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern, schneiden Sie das hintere Ende der Aorta, bevor sie sich in die Nierenarterien verzweigt. Die Erhaltung der Integrität der Aorta ist während des gesamten Verfahrens sehr wichtig. Spülen Sie anschließend das Aortalumen mit fünf Millilitern von 0,075 aus.Natriumdodecylsulfat oder SDS-Lösung, verdünnt in Phosphatpuffer-Salzlösung oder PBS, zum Einweichen der atherosklerotischen Aorta in einer 0,075 %igen SDS-Lösung in einer 10 cm Petrischale auf einem Rotationskorb bei 150 U/min für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend spülen Sie das Aortenlumen mit fünf Millilitern PBS aus. Danach weichen Sie die Aorta in PBS in einer 10 cm Petrischale ein und stellen die Petrischale zwei Stunden lang bei 150 U/min auf den Rotationskorb bei Raumtemperatur. Erneuern Sie das PBS alle 20 Minuten nach zwei Stunden. Spülen Sie das Aortenlumen mit fünf Millilitern PBS aus. Beginnen Sie damit, den Durchflusskreislauf des Bioreaktors gemäß der schriftlichen Anleitung zusammenzubauen.Als Nächstes konditionieren Sie das dezellularisierte Gefäß mit Kulturmedium, indem Sie die Aorta in Differenzierungsmedium in einer 10 cm großen Petrischale eine Stunde lang bei 50 U/min bei Raumtemperatur auf einem Rüttler einlegen. Führen Sie unter dem Mikroskop Nylonröhrchen mit einer Länge von einem Zentimeter in beide Enden des dezellularisierten Gefäßes ein. Danach befestigen Sie das Gefäß und die Röhrchen mit acht-null Seidenlitzen.Bauen Sie das entzelluläre Aortentransplantat in der Inkubationskammer zusammen, indem Sie die Nylonröhrchen mit den Einlass- und Auslassöffnungen der Kammerwand verbinden. Füllen Sie die Inkubationskammer jedes Mal mit fünf Millilitern Medium. Anschließend lösen Sie die PIPS-Zellen durch Zugabe von vorgewärmtem Trypsin ab.Bedecken Sie die Kulturschale und schaukeln Sie die Schale vorsichtig zehnmal. Entsorgen Sie die Abgüsse und lassen Sie die Schale zwei bis drei Minuten im Inkubator. Geben Sie dann vorgewärmtes Kulturmedium in die Schale und mischen Sie das Medium mit den Zellen. Anschließend zählen Sie die Zellanzahl mithilfe eines hämocytometrischen Zentrifugalsystems. Zwei Aliquots der Zellsuspension enthalten jeweils eine halbe Million Zellen und werden fünf Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Nach dem Überstand vollständig resuspendieren Sie ein Pellet der PIPS-Zellen-Pellets in 50 µL DM und injizieren die Zellsuspension in das dezelluläre Lumen des Gefäßes.Anschließend das andere PIPS-Zellpellet in 100 Mikroliter Matrigel resuspendieren. Die Mischung vorsichtig auf das dezelluläre Aortentransplantat pipettieren. 10 bis 15 Minuten warten, bis die Mischung einen gelartigen Zustand erreicht und gleichmäßig um die äußere Oberfläche des Gefäßes liegt.Zu diesem Zeitpunkt den Inkubationsbehälter mit dm aufbauen. Die gesamte Bioreaktor-Anordnung in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius stellen. Anschließend den Schlauch, der zwischen Medienreservoir und Compliance-Kammer verbunden ist, auf die Peristaltikpumpe setzen.Im Inkubator. Drehen Sie das dezellularisierte Transplantat manuell alle 30 Minuten um 90 Grad um die Längsachse, und zwar während der ersten zwei Stunden nach einer 12-stündigen statischen Kultivierung, um die Zellbesiedlung zu ermöglichen, und führen Sie DM über die Lumenperfusion mittels einer peristaltischen Pumpe zu, um die Differenzierung der glatten Muskelzellen zu induzieren. Beginnen Sie mit einer anfänglichen Flussrate von fünf Millilitern pro Minute.Danach schrittweise über einen Zeitraum von 24 Stunden eine Erhöhung um 20 Milliliter pro Minute vornehmen, nachdem die Strömungsgeschwindigkeit des zirkulierenden Mediums 24 Stunden lang bei 20 Milliliter pro Minute gehalten wurde, anschließend den Mediumfluss stoppen und den Bioreaktor aus dem Inkubator entfernen. Danach besiedeln Sie das Lumen des Transplantats mit PIPS-Zellen mittels Trypsin-Zählung und Zentrifugation unter Verwendung von 1 Million PIPS-Zellen. Wie zuvor suspendieren Sie die Zellen in 50 Mikroliter endothelialem Wachstumsmedium.Zwei, die 50 Nanogramm pro Milliliter vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor enthalten. Dann die Zellmischung in das Lumen des Transplantats injizieren. Das Medium in der Inkubationskammer und im gesamten Kreislaufsystem wechseln zu eGM zwei, das VEGF enthält, um die endotheliale Differenzierung zu induzieren.Nachdem der Bioreaktor wieder in den Inkubator gestellt wurde, manuell das Transplantat in den ersten zwei Stunden alle dreißig Minuten um 90 Grad drehen und anschließend 12 Stunden eine statische Kultur beibehalten. Nach 12 Stunden beginnen Sie mit einer Strömung von fünf Millilitern pro Minute und erhöhen diese schrittweise auf 35 Milliliter pro Minute; danach die Strömungsgeschwindigkeit fünf Tage lang bei 35 Millilitern pro Minute halten. Danach das offensichtlich konstruierte Transplantat durch Abschneiden der Enden der Nylonröhrchen gewinnen.Platzieren Sie das Transplantat auf einer Petrischale mit frischem e GM zwei Medium, um es für die Transplantation auf die Maus vorzubereiten, nachdem die Empfängertiermaus anästhesiert wurde. Fixieren Sie die Maus in Rückenlage, wobei ihr Hals rasiert und gestreckt ist. Bereiten Sie unter einem Stereomikroskop mit fünf- bis zehnfacher Vergrößerung einen medianen Schnitt von der Unterkieferregion bis zum Brustbein der Maus vor.Heben Sie die rechten Speicheldrüsen seitlich an und entfernen Sie den rechten glidenden Mastoidmuskel. Um die rechte Arteria carotis communis freizulegen, entfernen Sie vorsichtig anhängende Gewebestücke, um die rechte Arteria carotis communis vom distalen Ende aus in Richtung des proximalen Endes zu mobilisieren. Ligieren Sie den mittleren Abschnitt der Arteria carotis communis zweimal mit einer 8-0-Seidennaht und dissezieren Sie zwischen den beiden Ligaturen. Führen Sie an jedem Gefäß eine Manschette aus sterilisierbarem Nylonrohr ein.Ende und fixieren Sie jedes Ende mit mikrochirurgischen Hämostasenklammern. Entfernen Sie dann die Nahtbinden an einem Ende und geben Sie unmittelbar danach einen Tropfen Heparin hinzu. Stülpen Sie das distale Ende der Arterie um, um den gesamten Manschettenkörper zu bedecken, und fixieren Sie das umgestülpte Gefäß mit einer 8-0-Seidennaht an der Manschette. Nachdem der gleiche Vorgang mit dem anderen Teil der Arterie wiederholt wurde, spülen Sie die Arterie mit Kochsalzlösung, um Blutgerinnsel zu entfernen. Implantieren Sie anschließend ein dezellularisiertes Gefäßtransplantat zwischen die beiden Enden der Arteria carotis, indem Sie die Enden des dezellularisierten Gefäßes über die Arterienhülsen schieben und mit acht Null-Seidennähten fixieren. Entfernen Sie die vaskulären Klammern von beiden Enden, bevor Sie die Pulsation des Transplantats überprüfen, und legen Sie die rechte Speicheldrüse danach wieder in ihre ursprüngliche Position.Schließen Sie die Haut an der Operationsstelle mit einer unterbrochenen Naht unter Verwendung einer Sechser-Null-Prolactin-Naht. Setzen Sie die postoperative Versorgung wie im repräsentativen Textprotokoll beschrieben fort. Die Morphologie menschlicher Fibroblasten vier Tage nach der Umprogrammierung in PIPS-Zellen ist hier dargestellt.PIPS-Zellen wiesen ein deutlich anderes Phänotyp auf als Fibroblasten. Wie erwartet wurde die vollständige Entzellularisierung der Aorta durch eine zweistündige Behandlung mit SDS erreicht. Infolgedessen erschien die entzellularisierte Aorta im Vergleich zu einer frisch entnommenen Aorta als durchscheinendes, zellfreies Gerüst.Nach der dualen Besiedlung von PIPS-Zellen in entzellulierten Aorten weisen die hergestellten vaskulären Transplantate Eigenschaften von Endothel- und glatten Muskelzellen auf, im Gegensatz zu entzellulierten Gefäßtransplantaten. Dies wird hier durch die grüne Färbung für Endothelzellen und die rote Färbung für glatte Muskelzellen veranschaulicht. Mäuse, die mit PIPS-Zell-Gefäßtransplantaten versorgt wurden, wiesen drei Wochen nach der Transplantation wie erwartet eine Überlebensrate von 60 % auf.Mäuse, die mit entzellulären Gefäßen transplantiert wurden, wiesen bereits ab dem ersten Tag nach der Operation deutlich höhere Sterblichkeitsraten auf. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Kardiologie den Weg, um die Verwendung von PIPS-Zellen und entzellulären Gefäßtransplantaten bei der Herstellung funktionaler, gewebeengineering-basierter vaskulärer Verbindungsröhren zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos hoffe ich, dass Sie ein gutes Verständnis dafür erlangt haben, wie man das entzelluläre Gefäßtransplantat vorbereitet, wie man den Bioreaktor zusammenbaut und wie man das reimplantierte Transplantat wieder in Mäuse einsetzt.

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben ein Verfahren, bei dem ein Abschnitt der Bauchaorta von einer Maus transplantiert orthotopisch wird knapp unterhalb der Nierenarterien in einer allogenen oder syngenen Empfänger. Diese Technik kann in Untersuchungen, bei denen die Transplantation von grossen Arterien von einheitlicher Größe als vorteilhaft erachtet wird nützlich.

Orthotopen Aortic Transplantation in Mäuse für das Studium der Vascular Disease

Wir beschreiben Protokolle für unseren Maus Transplantat arteriosclerois (GA)-Modelle, die unter Zwischenschaltung einer Maus Gefäßsegmentes beinhalten in einen Empfänger des gleichen Inzuchtstammes. Durch Rückkreuzen zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender kann das Modell beurteilen die Wirkung bestimmter Gene auf GA.

Mausmodelle für Graft Arteriosklerose

Die murine Gebärmutterhalskrebs Herztransplantation Modell ist für immunologische sowie Ischämie Reperfusionsschaden Studien gut geeignet. Wir modifizierten das Verfahren mit einem nicht-Nahttechnik und Manschette durchgeführt mehr als 1.000 erfolgreiche Transplantationen mit diesem Ansatz.  Hier stellen wir weitere Einzelheiten dieser Technik, um das Video zu ergänzen.

Murine Cervical Herztransplantation Modell mithilfe eines modifizierten Cuff-Technik

Nach unserer Kenntnis der zellulären und molekularen neotissue Bildung zu verbessern, wurde ein Maus-Modell der TEVG vor kurzem entwickelt. Die Transplantate wurden als infrarenalen Vena cava Zwischen Transplantate in C57BL / 6 Mäusen implantiert. Dieses Modell erzielt ähnliche Ergebnisse wie in unserer klinischen Untersuchung erreicht wird, sondern über einen weit verkürzt Zeitverlauf.

Die Implantation von Vena Cava Interposition Graft in Maus-Modell

Um die kombinierte Allotransplantation von soliden Organen und vaskularisierten Kompositen zu untersuchen, beschreiben wir ein neuartiges heterotopes En-bloc-Modell für Brustwand-, Thymus- und Herztransplantationen bei Mäusen unter Verwendung einer zervikalen Non-Sewure-Manschettentechnik.

A Novel Mikromodell für Heterotope, En Bloc Brustwand, Thymus und Herz-Transplantation bei Mäusen

Wir präsentieren eine Orthotopic Aorten-Transplantation-Modell mit der Sleeve-Technik bei Mäusen. Es ist eine sehr schnelle Anastomose-Methode, die in Studien von Gefäßerkrankungen eingesetzt werden können.

Mit Hilfe der Sleeve-Technik in einem Mausmodell der Aorta Transplantation - ein Lehr-Video

Transplantat Stenose stellt eine kritische Hindernis Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz. Um zellulären Mechanismen, die Stenose zu untersuchen, verwenden wir ein Mausmodell entwickelt trachealen Gewebeersatz mit kernigen Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC). Hier zeigen wir unsere Protokoll, einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation.

Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell

Hier stellen wir ein Protokoll der heterotopischen Aortentransplantation bei Mäusen mit der Nicht-Naht-Manschettentechnik in einem zervikalen Murin-Modell vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um die zugrunde liegende Pathologie der chronischen Allograft-Vaskulopathie (CAV) zu untersuchen und kann helfen, neue therapeutische Wirkstoffe zu bewerten, um ihre Bildung zu verhindern.

Murine Cervical Aortic Transplantation Modell mit einer modifizierten Non-Suture Manschettentechnik

Maus-Herztransplantationsmodelle stellen wertvolle Forschungswerkzeuge für die Untersuchung der Transplantationsimmunologie dar. Das vorliegende Protokoll beschreibt die heterotope zervikale Herztransplantation der Maus, bei der Manschetten auf die gemeinsame Halsschlagader des Empfängers und den Lungenarterienstamm des Spenders gelegt werden, um einen laminaren Blutfluss zu ermöglichen.

Heterotope zervikale Herztransplantation der Maus mit Gefäßmanschetten

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Implantation eines Tissue-Engineering-Gefäßtransplantats in die Halsschlagader der Maus mit Hilfe der Manschettentechnik vorgestellt, das ein geeignetes Tiermodell für die Untersuchung von Regenerationsmechanismen des Gefäßgewebes bietet.

Implantation eines Tissue-Engineering-Gefäßtransplantats in die Halsschlagader der Maus mittels Manschettentechnik

In dieser Studie wird ein Schweinemodell zur Bewertung von Transplantaten mit kleinem Durchmesser in Oberschenkelarterien vorgestellt. Das Modell ahmt die Gefäßdynamik des Menschen nach und bewertet umfassend die Durchgängigkeit von Transplantaten, die Hämodynamik und den Gefäßumbau. Es bietet eine wertvolle Plattform, um Gefäßtransplantate zu testen und mit Doppler-Ultraschall und Angiographie zu überwachen.

Implantation eines femoralen Gefäßtransplantats in einem Schweinemodell zur Prüfung von Gefäßtransplantaten mit kleinem Durchmesser

Erfahren Sie die Herstellung funktionaler Gefäßtransplantate aus partiell induzierten pluripotenten Stammzellen für ein Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellviabilität und Transplantationserfolg in vivo.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

Weitere Videos entdecken