Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, morphologisch spezifische Reagenzien gegen das an Tar-DNA bindende Protein 43 in einem LS vorkommende Varianten unter Verwendung einer zweiphasigen, auf A FM basierenden Radio-Panning-Technologie zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine vielfältige Phagenbibliothek mehreren Runden negativen Pannings gegen nichtzielgerichtete Antigene unter Verwendung von Immunröhren ausgesetzt wird.

Das negative Panning wird nacheinander gegen Rinderserumalbumin, aggregiertes Alpha-Synuclein und gesundes menschliches Hirngewebe durchgeführt. Der zweite Schritt besteht darin, nach jeder Serie negativen Pannings eine FM-Verifizierung durchzuführen, um sicherzustellen, dass alle unerwünschten Phagen erfolgreich entfernt wurden. In diesem Beispiel des negativen Pannings sind Phagen nach einer Runde sichtbar, jedoch nach der 10. Runde nicht mehr vorhanden.

Anschließend werden aufgrund der begrenzten Probenverfügbarkeit die verbleibenden negativen Panning-Schritte an MICA durchgeführt. Phagen, die gegen immunpräzipitiertes TDP 43 aus gesundem Gewebe sowie aus Frontotemporal-Demenz- oder FTD-Gewebe reagieren, werden nacheinander entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, die Phagen zu isolieren, die an das a LS immunpräzipitierte Bindung zeigen.

TDP 43 unter Verwendung von auf Mica gebundenen Phagen wird durch Trypsin, Triethylamin und TG-Eins-Zellen eluiert. Letztendlich wird die Spezifität dieser potenziellen ALS-Klone mittels indirekter ELISA- und Dot-Blot-Analysen überprüft, wobei homogenisiertes ALS-FTD- und gesundes menschliches Hirngewebe in beiden Assays immobilisiert wird. Im Vergleich zu den anderen getesteten Gruppen wird gewöhnlich eine stärkere Reaktivität gegenüber ALS-Gewebe nachgewiesen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der herkömmlichen phagenbasierten Bio-Panning-Methode liegt in der Anwendung umfassender negativer Panning-Protokolle, die durch ein FM überprüft wurden, um die Isolierung von Reagenzien sicherzustellen, die selektiv krankheitsspezifische Proteinvarianten direkt aus komplexen biologischen Proben erkennen, selbst wenn diese in niedrigen Konzentrationen vorliegen. Obwohl ein FM Einblicke in biomolekulare Eigenschaften und Wechselwirkungen ermöglichen kann, ist es auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise zur Überwachung des Fortschritts des Bio-Panning oder zur Bestätigung der Spezifität einzelner CLOs. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Phagenproduktion, wie im Textprotokoll beschrieben, um zunächst ein negatives Panning gegen BSA durchzuführen, und geben Sie vier Milliliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter hinzu.

BSA-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS in 12 Immuno-Röhrchen geben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend Phagenpartikel aus jeweils drei Bibliotheken kombinieren, wobei eine kleine Menge dieser Phagenmischung für die spätere Überprüfung des negativen Panning-Prozesses beiseitegestellt wird. Danach die BSA-Lösung aus dem ersten Röhrchen entfernen und das Röhrchen zwei bis drei Mal mit PBS waschen, um nicht gebundenes BSA zu entfernen. Die kombinierten Phagenbibliotheken dann diesem ersten Röhrchen hinzufügen, 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Rotator inkubieren und anschließend die nicht gebundenen Phagen sammeln.

Beachten Sie, dass es wichtig ist, nach Abschluss der zahlreichen Runden der negativen Panning gegen jedes Ziel eine kleine Menge Phagen aufzubewahren, um den Erfolg des Panning-Prozesses zu überprüfen und im Falle einer Kontamination den negativen Panning-Vorgang mit den verbleibenden Röhrchen BSA-Lösung jeweils zu wiederholen. Verwenden Sie die nach der Inkubation des vorherigen Röhrchens gesammelten ungebundenen Phagen. Überprüfen Sie anschließend die vollständige Entfernung aller BSA-Phagen-Binder mithilfe des im nächsten Abschnitt des Videos beschriebenen A-FM-Verfahrens.

Um die Bindung von Phagen mittels einer FM zu visualisieren, geben Sie 10 bis 20 Mikroliter des Zielantigens auf gespaltenes Mica und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten lang. Waschen Sie das MICA fünfmal mit Wasser, geben Sie anschließend 10 bis 20 Mikroliter der Phagen auf das MICA und inkubieren Sie erneut fünf bis 10 Minuten lang. Waschen Sie das Mica danach weitere fünfmal mit Wasser und lassen Sie es an der Luft trocknen.

Führen Sie einen KM-Bildgebungsprozess unter Verwendung eines KM-Tapping-Modus mit einem Nanoskop Drei und einer Steuerungseinheit an Luft bei Raumtemperatur durch. Die Silizium-KM-Sonden weisen eine Resonanzfrequenz von 300 Kilohertz und eine Federkonstante von 40 Newton pro Meter auf. Setzen Sie die KM-Spitze in den Spitzenlader ein.

Befestigen Sie die Spitzenhalterung am A FM-Mikroskop. Platzieren Sie die Probe unter dem A FM-Mikroskop. Richten Sie mithilfe der Knöpfe den Laser auf die A FM-Spitze aus.

Stellen Sie die Abtastrate auf 3,05 Hertz und die Scanauflösung auf 512 Abtastwerte pro Zeile ein. Optimieren Sie die Silica-Schwingung durch automatische Abstimmung des Geräts. Frequenz der Spitze, Start der Probenscanung.

Die Spitze scannt die Oberfläche des MICA und misst dabei die Höhe der gebundenen Phagen. Die Phagen erscheinen als lange weiße Linien. Nach dem Erfassungsprozess werden die Bilder durch einfache Hintergrundglättung bearbeitet, um sicherzustellen, dass alle Partikelgrößen innerhalb jedes Bildes vergleichbar sind. Die Breite der Phagen kann von Bild zu Bild aufgrund anderer Partikelgrößen und des Scannbereichs variieren, dies beeinträchtigt jedoch niemals die Genauigkeit der Bindung von Phagen an das Antigen.

Das Bild wird in ein 2D-Bild abgeflacht, und schlecht abgebildete Bereiche, die durch PEG-Kontamination verursacht wurden, werden zur Entfernung aus der zukünftigen Datenanalyse hervorgehoben. Immunpräzipitieren Sie gesundes TDP-43-Protein aus gesundem menschlichem Hirngewebe, wie im Textprotokoll beschrieben, aufgrund der geringeren Menge an immunpräzipitiertem Protein. Führen Sie diese Runden der negativen Panning unter Verwendung von MICA zuerst durch, indem Sie acht MICA-Oberflächen mit dem ersten MICA unter Zugabe von etwa 100 µL des immunpräzipitierten Proteins koppeln und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation.

Waschen Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % Phosphat-gepufferter Salzlösung mit Tween 20, abgekürzt PBST. Danach etwa 100 Mikroliter Phagen nach der negativen Panning gegen gesundes menschliches Hirngewebe hinzufügen und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zur halben Inkubationszeit das immunpräzipitierte Protein der zweiten Mica hinzufügen.

Sammeln Sie die Phagen von der ersten MICA, bevor Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % PBST waschen. Nach dem Waschen der zweiten MICA fügen Sie die zuvor gesammelten Phagen hinzu. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang, bis die Phagen negativ gegen alle acht MICA mit dem immunpräzipitierten Protein gepanzert wurden.

Überprüfen Sie den Erfolg des Panning-Prozesses unter Verwendung des Phagen nach der ersten und achten Runde des negativen Pannings mit einem FM, um wie im Textprotokoll beschrieben das TDP-43-Protein aus den Gehirnen von Individuen mit einer LS immunpräzipitieren zu können, spalten Sie drei MICA-Oberflächen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter A LS TDP 43 zur ersten MICA nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Waschen Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % PBST.

Fügen Sie anschließend 50 µL der Phagen, die nach der negativen Panning gegen gesundes TDP 43 gesammelt wurden, zur MICA hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie die nicht gebundenen Phagen. Es ist wichtig, alle gesammelten Phagen in diesen Panning-Schritten getrennt aufzubewahren.

Sammeln Sie anschließend die gebundenen Phagen mithilfe dreier Elutionsmethoden. Geben Sie zunächst 50 Mikroliter Trypsin zu jedem MICA hinzu und inkubieren Sie höchstens 10 Minuten lang. Sammeln Sie die Lösung ein und bewahren Sie sie auf.

Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter 100 Millimolar Triethylamin zu jedem MICA hinzu und inkubieren Sie nicht länger als 10 Minuten. Sammeln Sie die Lösung in einem gleichen Volumen an einem molaren Tris-HCl-Puffer mit pH 7,4 und bewahren Sie sie auf. Als Drittes geben Sie 50 Mikroliter TG1-Zellen direkt zu dem MICA hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie außerdem die aus den ersten beiden Elutionsmethoden gewonnenen Phagen 100 Mikrolitern TG1-Zellen in derselben Konzentration hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Als Nächstes wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer zweiten Mica. Nehmen Sie die gesammelten nicht gebundenen Phagen unter Verwendung der ersten MICA mit A LST DP 43 und geben Sie diese auf die zweite MICA mit A-A-L-S-T-D-P 43; inkubieren Sie fünf Minuten lang. Kombinieren Sie die TG1-Zellen, die mit den Phagen infiziert wurden und durch Trypsin aus jeder A LST DP 43 MICA freigesetzt wurden, und impfen Sie sie auf eine Luria-Burani-Platte mit Ampicillin oder eine LBA-Platte ab.

Wiederholen Sie denselben Vorgang für die Triethylamin- und TG-one-alludierenden Phagen aus den beiden Sätzen von A LS TDP 43 MICA, insgesamt drei Platten. Wiederholen Sie alle Schritte mit einer dritten A LS-Mika, verwenden Sie in diesem Fall jedoch Phagen, die nach zwei Runden der negativen Panning gegen die frontotemporale Demenz gesammelt wurden. Impfen Sie die infizierten TG-one-Zellen auf drei LBA-Platten aus und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf den sechs LBA-Platten mit potenziellen a LS-Klonen. Auf den drei LBA-Platten aus dem dritten A LS MICA sollten weniger Kolonien vorhanden sein im Vergleich zu den drei LBA-Platten nach den zwei Runden positiven Pannings unter Verwendung des Phagen nach negativem Panning gegen gesundes TDP 43. Stellen Sie Phagen und lösliche variable einkettenige Antikörpfragment-Domänen oder s cvs aus diesen Klonen her und analysieren Sie sie mittels verschiedener Immunoassays, um die Spezifität gegenüber a LS-Gewebe zu überprüfen.

Mittels FM-Bildgebung wird die negative Panning-Schritte gegen die verschiedenen Zielstrukturen überwacht, um sicherzustellen, dass alle reaktiven Phagen entfernt werden. FM-Ergebnisse zeigten eine Phagenbindung nach einer Runde negativen Pannings gegen aggregiertes alpha-Synuclein und keine Bindung nach acht Runden. Das negative Panning gegen gesundes menschliches Hirngewebe wurde durchgeführt, um Phagen zu entfernen, die an die zahlreichen Antigene im Homogenat gesunden menschlichen Gehirns binden.

Hier wird die Phagenbindung an gesundes Gewebe nach einer Runde negativer Panning und keine verbleibende Phagenbindung nach 10 Runden negativer Panning gezeigt. Nach der Herstellung sowohl von Phagen als auch von löslichem SCFE aus potenziellen Klonen wurden diese im indirekten ELISA auf Spezifität gegenüber einem LS-Gewebe getestet. Fast alle Phagen zeigten eine Präferenz für ein LS-Gewebe gegenüber gesundem Gewebe.

Ähnliche Ergebnisse werden bei dem Vergleich der Phagenbindung an eine LS mit Bindung an Frontotemporale Demenz- oder FTD-Gewebe erhalten. Der Vergleich der SCFV-Bindung an LS-Gewebe in gesundem und FTD-Gewebe zeigte erneut eine selektive Bindung an LS-Gewebe in nahezu allen Klonen. Der Dot-Blot-Immunassay wurde verwendet, um die Bindung an LS-Gewebe weiter zu bestätigen und auch um festzustellen, welche Klone in anderen immunologischen Anwendungen reaktiv sind.

Hier wird ein Klon zwei a, der an ein LS-Gewebe bindet, gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein FM-basiertes Biop-Panning anwendet, um Reagenzien gegen krankheitsspezifische Zielstrukturen zu isolieren, die als potenzielle diagnostische und/oder therapeutische Werkzeuge dienen können.