Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, morphologiespezifische Reagenzien gegen das Teer-DNA-Bindungsprotein zu isolieren. 43 Varianten in einem LS unter Verwendung einer zweiphasigen A FM-basierten Radio-Panning-Technologie. Dies wird erreicht, indem zunächst eine vielfältige Phagenbibliothek mehreren Runden negativen Pannings gegen Off-Target-Antigene mit Hilfe von Immunröhrchen unterzogen wird.

Das negative Panning wird nacheinander gegen Rinderserumalbumin, aggregiertes Alpha-Synuclein und gesundes menschliches Hirngewebe durchgeführt. Der zweite Schritt besteht darin, nach jedem negativen Panning eine FM-Verifizierung durchzuführen, um eine erfolgreiche Entfernung aller unerwünschten Phagen sicherzustellen. In diesem negativen Panning-Beispiel sind Phagen mit aggregiertem Alpha-Synuclein nach einer Runde sichtbar, aber nach der 10. Runde nicht mehr vorhanden.

Als nächstes werden die verbleibenden negativen Panning-Runden aufgrund der begrenzten Probenverfügbarkeit auf MICA durchgeführt. Phagen, die auf immunpräzipitiertes TDP 43 aus gesundem und frontotemporalem Demenz- oder FTD-Gewebe reagieren, werden nacheinander entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, die Phagen zu isolieren, die an das a LS-Immunpräzipitat binden.

TDP 43 unter Verwendung von glimmergebundenen Phagen wird unter Verwendung von Trypsin-, Triethyl-, Amin- und TG-1-Zellen angedeutet. Letztendlich wird die Spezifität dieses Potentials, eines LS-Klons, mittels indirekter fa eliza's und Dot Blots verifiziert, homogenisierte A-L-S-F-T-D und gesundes menschliches Hirngewebe werden in beiden Assays immobilisiert. Im Vergleich zu den anderen getesteten Gruppen wird in der Regel eine größere Reaktivität gegenüber einem LS-Gewebe festgestellt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichem Phagen-Biopanning ist die Verwendung von umfassenden negativen Panning-Protokollen, die von einem FM verifiziert werden, um die Isolierung von Reagenzien zu gewährleisten, die krankheitsspezifische Proteinvarianten selektiv direkt aus komplexen biologischen Proben erkennen, selbst wenn sie in niedrigen Konzentrationen vorliegen. Obwohl ein FM Einblicke in die Untersuchung biomolekularer Merkmale und der Wechselwirkungen geben kann, kann es auch in anderen Systemen eingesetzt werden, z. B. zur Überwachung des Fortschritts des Bio-Pennings und zur Bestätigung der Spezifität einzelner CLOs. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Phagenproduktion, wie im Textprotokoll beschrieben, um zuerst ein negatives Panning gegen BSA durchzuführen, fügen Sie vier Milliliter von einem Milligramm pro Milliliter hinzu.

BSA-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS auf 12 Immunröhrchen geben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Kombinieren Sie als Nächstes Phagenpartikel aus jeder der drei Bibliotheken und legen Sie eine kleine Menge dieser Phagenmischung für die zukünftige Überprüfung des negativen Panning-Prozesses beiseite. Verwerfen Sie dann die BSA-Lösung aus dem ersten Röhrchen und waschen Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal mit PBS, um ungebundenes BSA zu entfernen, fügen Sie die kombinierten Phagenbibliotheken zu diesem ersten Röhrchen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Rotator, bevor Sie die ungebundenen Phagen sammeln.

Denken Sie daran, dass es wichtig ist, eine kleine Menge Phagen zu sparen, nachdem Sie die zahlreichen Runden des negativen Pannings gegen jedes Ziel beendet haben, um den Erfolg des Panning-Prozesses zu überprüfen, und im Falle einer Kontamination den negativen Panning-Prozess jedes Mal mit den restlichen Röhrchen der BSA-Lösung zu wiederholen. Verwenden Sie den ungebundenen Phagen, der nach der Inkubation des vorherigen Röhrchens entnommen wurde. Überprüfen Sie dann die Entfernung aller BSA-Phagenbinder mit dem A FM-Verfahren, das im nächsten Abschnitt des Videos beschrieben wird.

Um die Phagenbindung mit einem FM sichtbar zu machen, geben Sie 10 bis 20 Mikroliter des Zielantigens zu gespaltenem Glimmer und inkubieren Sie es fünf bis 10 Minuten lang. Waschen Sie die MICA fünfmal mit Wasser, geben Sie dann 10 bis 20 Mikroliter der Phagen in die MICA und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang. Den Glimmer nochmals fünfmal mit Wasser waschen und an der Luft trocknen lassen.

Führen Sie den FM-Bildgebungsprozess mit einem FM-Klopfmodus mit einem Nanoskop drei, einem Regler in Luft bei Raumtemperatur, aus. Die Silizium-FM-Sonden haben eine Resonanzfrequenz von 300 Kilohertz und eine Federkonstante von 40 Newton pro Meter. Setzen Sie die FM-Spitze in den Spitzenlader ein.

Befestigen Sie den Tiploader am A FM Mikroskop. Legen Sie die Probe unter das A FM-Mikroskop. Verwenden Sie die Knöpfe, um den Laser auf die A FM-Spitze auszurichten.

Stellen Sie die Scanrate auf 3,05 Hertz und die Scanauflösung auf 512 Samples pro Zeile ein. Stimmen Sie die Maschine automatisch ab, um die Kieselsäureschwingungen zu optimieren. Häufigkeit der Spitze, Starten Sie den Probenscan.

Die Spitze scannt die Oberfläche der MICA und misst die Höhe des gebundenen Phagen. Die Phagen sind die langen weißen Linien nach dem Aufnahmeprozess der Bilder durch grundlegende Abflachung des Hintergrunds, um sicherzustellen, dass alle Partikelgrößen innerhalb jedes Bildes vergleichbar sind. Die Phagenbreite kann aufgrund anderer Partikelgrößen und des Scanbereichs von Bild zu Bild variieren, aber sie wird niemals die Genauigkeit beeinträchtigen, ob Phagen an das Antigen binden oder nicht.

Das Bild wird in ein 2D-Bild abgeflacht und schlecht abgebildete Regionen, die durch PEG-Kontamination verursacht wurden, werden hervorgehoben, um sie aus der zukünftigen Datenanalyse zu entfernen. Immunpräzipitation gesundes TDP 43-Protein aus gesundem menschlichem Gehirngewebe, wie im Textprotokoll beschrieben, aufgrund einer geringeren Menge an immunpräzipitiertem Protein. Führen Sie diese Runden des negativen Pannings mit MICA durch: Zuerst Spalten Sie acht MICA-Oberflächen an die erste MICA-Oberfläche bei etwa 100 Mikrolitern des immungefällten Proteins und inkubieren Sie es nach der Inkubation fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die MICA fünfmal mit 0,1% phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 abgekürzt PBST. Fügen Sie dann nach dem negativen Panning gegen gesundes menschliches Hirngewebe etwa 100 Mikroliter Phagen hinzu und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie nach der Hälfte der Inkubation das immunpräzipitierte Protein zur zweiten Glimmer hinzu.

Sammeln Sie den Phagen von der ersten MICA, bevor Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % PBST waschen. Nach dem Waschen des zweiten Glimmers den zuvor gesammelten Phagen hinzufügen. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang, bis der Phagen negativ gegen alle acht Glimmer mit dem immunpräzipitierten Protein gepannt ist.

Überprüfen Sie den Erfolg des Panning-Prozesses unter Verwendung des Phagen nach der ersten und acht Runden des negativen Pannings mit einem FM, um mit der Immunpräzipitation des TDP 43-Proteins aus den Gehirnen von Personen mit einem LS zu beginnen, wie im Textprotokoll beschrieben, und spalten Sie drei MICA-Oberflächen. Geben Sie dann 50 Mikroliter A LS TDP 43 nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur in die erste MICA. Waschen Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % PBST.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter des Phagen, der nach negativem Panning gegen gesundes TDP 43 gesammelt wurde, in die MICA und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie die ungebundenen Phagen. Es ist wichtig, alle gesammelten Phagen in diesen Panning-Schritten getrennt zu halten.

Sammeln Sie als Nächstes die gebundenen Phagen mit drei elucianischen Methoden. Geben Sie zunächst 50 Mikroliter Trypsin in jede MICA und inkubieren Sie sie nicht länger als 10 Minuten. Sammeln Sie die Lösung und sparen Sie.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter 100 millimolare Triethylamine zu jeder MICA und inkubieren Sie sie nicht länger als 10 Minuten. Sammeln Sie die Lösung mit einem gleichen Volumen von einem molaren Tris HCL-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 und bewahren Sie die dritte auf, geben Sie 50 Mikroliter TG one Zellen direkt in die MICA und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie außerdem die Phagen, die aus den ersten beiden elozianischen Methoden gewonnen wurden, zu 100 Mikrolitern TG eins-Zellen in der gleichen Konzentration und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend mit einer zweiten Glimmer. Nehmen Sie den gesammelten ungebundenen Phagen mit der ersten MICA mit A LST DP 43 und geben Sie ihn zur zweiten MICA mit A-A-L-S-T-D-P 43 und inkubieren Sie ihn fünf Minuten lang. Kombinieren Sie die mit den Phagen infizierten TG 1-Zellen, angedeutet mit Trypsin aus jeder A LST DP 43 MICA und Platte auf allen Luria Burani Schneckenplatte mit Ampicillin oder LBA-Platte.

Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Triethylamin und TG one angespielten Phagen aus den beiden Sätzen von A LS TDP 43 MICA für insgesamt drei Platten. Wiederholen Sie alle Schritte mit einer dritten A LS-Glimmer, verwenden Sie in diesem Fall jedoch Phagen, die nach zwei Runden negativem Panning gegen frontotemporale Demenz gesammelt wurden. T DP 43 plattieren die infizierten TG one Zellen auf drei LBA-Platten und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag. Zähle die Anzahl der Kolonien auf den sechs LBA-Platten mit einem potentiellen a LS-Klon. Es sollten weniger Kolonien auf den drei LBA-Platten des dritten A LS MICA vorhanden sein als auf den drei LBA-Platten, nachdem die beiden Runden des positiven Pannings unter Verwendung des Phagen nach dem negativen Panning gegen gesundes TDP 43 Phagen und lösliche einkettige Antikörperfragmente mit variabler Domäne oder s cvs aus diesen Klonen produziert und unter Verwendung verschiedener Immunoassays analysiert wurden, um die Spezifität für ein LS-Gewebe zu überprüfen.

Eine FM-Bildgebung wird verwendet, um die negativen Panning-Schritte gegen die verschiedenen Ziele zu überwachen und sicherzustellen, dass alle reaktiven Phagen entfernt werden. Ein FM-Ergebnis zeigte eine Phagenbindung nach einer Runde negativen Pannings gegen das aggregierte Alpha-Synuclein und keine Bindung nach acht Runden. Negatives Panning gegen gesundes menschliches Hirngewebe wurde durchgeführt, um die Phagenbindung der vielen Antigene zu entfernen, die in gesundem menschlichen Gehirnhomogenat vorhanden sind.

Hier ist die Bindung von Phagen an gesundes Gewebe nach einer Runde negativen Pannings und keine Phagenbindung nach 10 Runden negativem Panning zu sehen. Nachdem sowohl Phagen als auch lösliche SCFE aus potenziellen Klonen hergestellt worden waren, wurden sie in indirektem Eliza auf Spezifität zu einem LS-Gewebe getestet. Fast alle Phagen zeigten eine Präferenz für ein LS-Gewebe gegenüber gesundem Gewebe.

Ähnliche Ergebnisse werden beim Vergleich der Phagenbindung an ein LS mit frontotemporaler Demenz oder FTD-Gewebe erzielt. Der Vergleich der SCFV-Bindung an ein LS-Gewebe sowohl in gesundem als auch in FTD-Gewebe zeigte erneut eine selektive Bindung an ein LS-Gewebe in fast allen Klonen. Der Dot-Blot-Immunoassay wurde verwendet, um die Bindung an ein LS-Gewebe weiter zu verifizieren und um festzustellen, welche Klone in anderen immunologischen Anwendungen reaktiv sind.

Hier wird beim Klonen von zwei eine Bindung an ein LS-Gewebe gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein FM-basiertes Biop-Panning anwenden können, um Reagenzien gegen Krankheiten, spezifische Interessenziele, Reagenzien, die als potenzielle diagnostische und/oder therapeutische Werkzeuge dienen können, zu isolieren.