Name: Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Antikörper gegen TDP-43-Varianten bei ALS mittels Rasterkraftmikroskopie und Biopanning isolieren. Diese Methode ermöglicht die selektive Erkennung krankheitsspezifischer Proteine aus biologischen Proben.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus NIH: R21AG042066. Wir möchten Philip Schulz für seine Verdienste bei der Erstellung der Videos mit Bildschirmaufzeichnungen danken.

<ol><li>Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+recombinant+antibodies+against+specific+protein+morphologies+using+atomic+force+microscopy+and+phage+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies.</a> Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).</li>
<li>Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Human+Single+Chain+Antibody+Fragment+Against+Oligomeric+%CE%B1-Synuclein+that+Inhibits+Aggregation+and+Prevents+%CE%B1-Synuclein-induced+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity.</a> Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).</li>
<li>Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Morphologically+Distinct+Oligomeric+Forms+of+%CE%B1-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+specific+for+oligomeric+beta-amyloid+stabilizes+nontoxic+form%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form.</a> Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+antibody+fragments+selective+for+specific+protein+morphologies+from+nanogram+antigen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples.</a> Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).</li>
<li>Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-oligomeric+A%CE%B2+Single-chain+Variable+Domain+Antibody+Blocks+A%CE%B2-induced+Toxicity+Against+Human+Neuroblastoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells.</a> Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+%CE%B2-Secretase+Activity+in+Alzheimer%27s+Disease+Cell+Models+with+Single-Chain+Antibodies+Specifically+Targeting+APP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP.</a> Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+Tandem+Single+Chain+Antibody+Simultaneously+Inhibits+%CE%B2-Secretase+and+Promotes+%CE%B1-Secretase+Processing+of+A%CE%B2PP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).</li>
<li>Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Single-Chain+Fv+Intrabody+Blocks+Aberrant+Cellular+Effects+of+Overexpressed+%5Balpha%5D-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein.</a> Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43-mediated+neurodegeneration%3A+towards+a+loss-of-function+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).</li>
<li>Akamatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+mouse+model+for+investigating+the+properties+of+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+protein+TDP-43%2C+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation.</a> Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).</li>
<li>Keage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+in+the+Population%3A+Prevalence+and+Associations+with+Dementia+and+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).</li>
<li>Honda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALS%2FFTLD-related+RNA-binding+proteins+TDP-43+and+FUS+have+common+downstream+RNA+targets+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons.</a> FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).</li>
<li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43%3A+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li>
<li>Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).</li>
<li>Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+subcellular+localization+of+TDP-43+immunoreactivity+in+the+anterior+horns+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).</li>
<li>Robertson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+TDP-43+abnormalities+in+mutant+SOD1+transgenic+mice+shows+disparity+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS.</a> Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).</li>
<li>Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+of+TDP-43+in+the+G93A+mutant+SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS.</a> Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+processing+of+TDP-43+is+not+an+upstream+event+of+reduced+ADAR2+activity+in+ALS+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons.</a> Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+abolishes+mutant+TDP-43+induced+excitability+in+a+motoneuron-like+cellular+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS.</a> Neuroscience. 272, 141-153 (2014).</li>
<li>Sheets, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library%3A+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li>
<li>Hairul Bahara, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+antibodies+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Phage display antibodies for diagnostic applications.</a> Biologicals. 41, 209-216 (2013).</li>
<li>Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+%28Bt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cry1B+toxin.+Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li>
<li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+salivary-pellicle-binding+peptide+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display.</a> Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).</li>
<li>Adamson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+antibodies+to+the+prion+protein+identified+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display.</a> Virology. 358, 166-177 (2007).</li>
<li>Hebron, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+%28TDP-43%29+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+%28HDAC6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li>
<li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li>
<li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li>
<li>Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages%E2%80%94review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The influence of external factors on bacteriophages—review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li>
<li>Hammers, C. M., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Phage+Display%3A+Technique+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antibody Phage Display: Technique and Applications.</a> J Invest Dermatol. 134, e17(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Es wurde gezeigt, dass Proteinvarianten am Fortschreiten vieler neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, ALS und FTDbeteiligt sind 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Die Isolierung von Antikörpern, die diese verschiedenen Ziele von Proteinvarianten selektiv erkennen können, kann ein wirksames Reagenzium sein, um solche Erkrankungen zu untersuchen, zu diagnostizieren und möglicherweise zu behandeln. Um solche variantenspezifischen Antikörper zu erzeugen, haben wir ein neuartiges Biopanning-Verfahren en...

Die Anwesenheit von Protein-Varianten wurde als ein Faktor beim Fortschreiten vieler Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, ALS und frontotemporale Demenz (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 verwickelt , 10,11. Oligomere Formen der Proteine ​​beta-Amyloid und alpha-Synuclein sind gedacht, um die toxischen Spezies von Alzheimer und Parkinson, jeweils 2,3,4,5 verantwortlich. Aggregate der TAR DNA-bindende Protein 43 (TDP-43) wurden an ALS und FTD 12,13,14 verbunden. Daher Reagenzien wie Antikörpern, die selektiv die verschiedenen Proteinvarianten können leistungsfähige Werkzeuge, um als diagnostische Marker und potenziellen Therapeutika dienen können. In dieser Studie haben wir uns auf die Entwicklung von Reagenzien, die selektiv binden Varianten des TDP-43-Proteins in ALS verwickelt, aber die Technik, die in diesem Dokument beschriebenen sollte für die Isolierung von Reagenzien werden gegenüber einer Vielzahl von protEin Varianten. Zytoplasmatische Aggregation von TDP-43 wurde als pathologisches Merkmal bei ALS 15,16,17,18,19 identifiziert. Typischerweise TDP-43 ist im Kern von allen Zellen, die von einem normalen Individuum gefunden werden, obwohl es zwischen Cytosol und Nukleus 15,17 bewegen tendiert. Bei ALS aggregierten Formen von TDP-43 sind im Zytoplasma der ausgewählten Neuronen und Glia mit geringeren Konzentrationen in den Zellkern was auf die Bewegung des TDP-43 aus dem Zellkern in das Cytoplasma bei der Krankheitsprogression 16,20 gefunden detektiert. Während Aggregation von TDP-43 ist in den meisten Fällen gefunden, ALS, ist es nicht in allen Fällen, da 1% bis 2% der gesamten ALS Fälle (oder 15% -20% der familiären ALS Fälle) werden, um Mutationen in die verknüpfte Konto Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) Gen 15,17. Wegen der wichtigen Rolle der TDP-43 in der überwiegenden Mehrheit der Fälle ALS, hier konzentrieren wir uns auf die Entwicklung von Antikörper-basierten Reagenzien, die selektiv an TDP-43-Varianten, die sich binden könnenin der menschlichen Nutzung unserer neuartigen AFM basierend Biopanning Techniken ALS Hirngewebe vorhanden. Zunächst brauchen wir ein breites Repertoire von Antikörper-Bindungsdomänen. Wir kombinierten drei verschiedenen Phagen-Display-single chain variable Domäne Antikörperfragment (scFv) Bibliotheken (Tomlinson I und J und Blätter Bibliotheken 21). Die Panning Prozess ist in negative und positive Panning Phasen unterteilt. Phagen aus den Bibliotheken werden zuerst mit der negativen Panning während welcher Phagen reaktiv mehreren Off-Target-Antigene ausgeschlossen unterworfen. Nach dem Abschluss jeder Runde der negativen Panning gegen jede Off-Target-Antigen wird der Prozess durch AFM überwacht, um sicherzustellen, dass alle Phagenbindung die Off-Target-Antigene wurden entfernt. Erst nach Überprüfung durch AFM, die alle reaktiven Phagen entfernt werden wir gehen in die nächste Ziel. Um Reagenzien gegen TDP-43-Varianten bei ALS beteiligt isolieren wir benutzt die folgenden negativen Panning-Antigene:<html> 1) BSA, um Phagen, die schwach oder nicht-spezifisch an Proteine ​​binden, zu entfernen; 2) aggregierte Alpha-Synuclein, um Phagen, die generische Strukturelemente der aggregierten Proteine ​​binden zu entfernen; 3) menschliche Gehirn Gewebehomogenaten auf Phagen, die auf alle Proteine ​​oder andere in Post-mortem-Proben von gesunden menschlichen Hirngewebe vorhandenen Komponenten zu binden, zu entfernen; 4) immun TDP-43 von gesunden menschlichen Gehirn auf Phagen, die für alle TDP-43 bildet mit gesunden menschlichen Gehirn assoziiert binden zu entfernen; und 5) immunpräzipitiert TDP-43 isoliert von FTD Hirnhomogenaten auf Phagen, die TDP-43-Varianten mit nicht-ALS-Pathologie assoziiert binden zu entfernen. Nach Entfernung aller Phagen an alle Off-Target-Antigenen reaktiv sind, schließlich wurden die positive Schwenkphase, in der Antikörperfragmenten, die das Antigen von Interesse binden, isoliert werden, in diesem Fall TDP-43 von menschlichem ALS Hirngewebe immunpräzipitiert. Diese isolierten Antikörper können aggregiert oder modifizierte Formen von TDP-43 reagieren. &quot;&gt; Konventionelle Phagen Biopanning konzentriert sich vor allem auf die positive Phase 22,23 Panning. Gewöhnlich wird die interessierende Target immobilisiert ist, die Phagen-Bibliothek hinzugefügt und gebundene Phagen eluiert. Die Phagen werden dann verstärkt und in die Richt erneut. Diese Verstärkung und Inkubationsprozesses wird üblicherweise mehrmals wiederholt, um den Prozentsatz an positiven bindenden Phagen zu erhöhen. Obwohl Variationen dieser Verfahren sind weitgehend verwendet worden, um Antikörper-Reagenzien gegen ein breites Spektrum von Zielantigene zu isolieren, sie erfordert in der Regel große Mengen an gereinigtem Zielantigen 24,25,26, 27, wohingegen unsere Verfahren erfordert nur Spuren der Ziel-Antigen ist. Die hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Reagenzien, die selektiv an Zielantigenen, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden sind, ohne die Notwendigkeit für die Reinigung und den Schwenk direkt gegen erfolgen isolieren in komplexe Gewebeproben vorhandenen Antigen. Die Verwendung von erschöpfenden negativen Panning-Protokolle verifiziertAFM sorgt dafür, dass Klone gegen die positive Antigen isoliert sollten selektiv das Ziel binden, auch wenn sie nicht gereinigt oder angereichert. Kasturirangan und Mitarbeiter (2003) haben eine ähnliche negative und positive Biopanning Verfahren, um Antikörper zu oligomeren beta-Amyloid mit Nanogramm-Konzentration des Target 5 reaktive isolieren geführt. Hier an diesem Verfahren zu erweitern, um die Erzeugung von Reagenzien, die selektiv binden krankheitsspezifische Proteinvarianten direkt aus menschlichen Gewebeproben zu ermöglichen. In zukünftigen Studien wollen wir weiter untersuchen nicht nur den diagnostischen Wert der Reagenzien hier isoliert, sondern auch prüfen, ihre therapeutische Bedeutung für die Behandlung von ALS. Insgesamt sollte unserer neuartigen AFM basiert Biopanning-Technologie für die Isolierung irgendkrankheitsspezifische Proteinvariante in jedes biologische Material sein, ohne die Notwendigkeit für die Proteinreinigung oder Änderung, auch wenn das Ziel-Antigen concentrations sind extrem niedrig.

<table><tbody><tr><td>Tomlinson I und J Libraries</td><td>MRC (Cambridge, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sheets Library</td><td>MRC (Cambridge, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>BD Sciences</td><td>244020</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Amresco</td><td>0188-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>KM13 Helfer Phage</td><td>MRC (Cambridge, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>OmniPur</td><td>5880</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 8000</td><td>OmniPur</td><td>6510</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Macron</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasisch</td><td>Amresco</td><td>0404-1KG</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>EMD</td><td>PX1405-1</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Kalium Monobasisches Phosphat</td><td>Amresco</td><td>0781-500G</td><td>Reizende</td></tr><tr><td>TG1-Zellen</td><td>MRC (Cambridge, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani-Agar</td><td>EMD</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>STEN-Puffer</td><td>Crystalgen Inc.</td><td></td><td></td>33429775</tr><tr><td>Immunotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>470319</td><td></td></tr><tr><td>Glimmer</td><td>Fichte Kiefer Glimmer</td><td>24365</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>EMD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T-0303</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Sigma</td><td>T-0886</td><td>Entzündliches</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>DNA-Plasmid-Vorbereitungskit</td><td>qiagen</td><td>27106</td><td>Reizendes</td></tr><tr><td>fettfreies Milchpulver</td><td>Nelke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-ELISA-Platte mit hoher Bindung</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-M13 HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-9421-01</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Femto Chemilumineszenz-Substrat-Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TDP 43 Polyklonaler Antikörper</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>A/G Agarose-Kügelchen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>HB 2151 Zellen</td><td>MRC (Cambridge, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthiogalactosid</td><td>Teknova</td><td>13325</td><td></td></tr><tr><td>9e10 HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Membran</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Entflammbare</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall RC 6+</td><td></td></tr><tr><td>Nanoskop IIIa Rasterkraftmikroskop</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM-Sonden</td><td>VistaProbes</td><td>T300R-10</td><td></td></tr></tbody></table>

novel rasterkraftmikroskopie.wie biopanning für isolierung von morphologie spezifische reagenzien gegen tdp-43 varianten in amyotrophe lateralsklerose

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Weil Protein-Varianten spielen kritische Rollen bei vielen Erkrankungen einschließlich TDP-43 in Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit und beta-Amyloid und Tau in Alzheimer-Krankheit, ist es von entscheidender Bedeutung, um die Morphologie spezifische Reagenzien, die selektiv entwickeln kann Diese krankheitsspezifische Proteinvarianten, die Rolle dieser Varianten in Krankheitspathologie und für mögliche diagnostische und therapeutische Anwendungen zu untersuchen. Wir haben neue Rasterkraftmikroskopie (AFM), basierend Biopanning Techniken, die Isolierung von Reagentien, die selektiv erkennen krankheitsspezifische Proteinvarianten können entwickelt. Es gibt zwei wichtige Phasen in den Prozess, den negativen und positiven Panning Phasen beteiligt. Während der negativen Panning Phase werden Phagen, die Off-Target-Antigenen reaktiv sind, durch mehrere Runden der subtraktiven Panning unter Verwendung einer Reihe von sorgfältig ausgewählten off-Zielantigene eliminiert. Ein wesentliches Merkmal in der negativenPanning Phase nutzt AFM, um den Prozess zu überwachen und zu bestätigen, dass alle unerwünschten Phagen Partikel entfernt sind. Für die positive Panning Phase wird das Zielantigen von Interesse auf einer Glimmer-Oberfläche fixiert und gebundenen Phagen werden eluiert und gesiebt, um Phagen, die selektiv das Zielantigen binden identifizieren. Die Zielproteinvariante muss nicht gereinigt werden, sofern die entsprechenden negativen Panning Kontrollen verwendet wurden. Auch Zielproteinvarianten, die nur in sehr niedrigen Konzentrationen in komplexen biologischen Materials in der positiven Panning Schritt verwendet werden vorliegen. Durch Anwendung dieser Technologie übernahmen wir Antikörper gegen Proteinvarianten der TDP-43, die selektiv in menschlichen ALS Hirngewebe gefunden werden. Wir erwarten, dass dieses Protokoll anwendbar sein sollte, um die Erzeugung Reagentien, die selektiv binden Proteinvarianten in einer Vielzahl von verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten vorkommen.

In Abbildung 1 ist die schematische zeigt die negativen Panning von denen wir entfernt Phagenbindung off-Zielantigene aus der Bibliothek unter Verwendung von Immunoröhrchen. Wir haben zunächst mit BSA begonnen, da dies ein gemeinsames Blockmittel und jeder Phage, unspezifisch reagieren mit dieser Ziel problematisch wäre in Zukunft Immunoassays. Als nächstes wir entfernt Bindemittel aggregierte alpha-Synuclein Phagen mit generischen Strukturen der aggregierten Proteine ​​(dh, ein Antikörper, sei...

Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie in Kombination mit der Biopanning-Technologie haben wir ein negatives und positives Biopanning-System entwickelt, um Antikörper gegen krankheitsspezifische Proteinvarianten zu gewinnen, die in jedem biologischen Material vorhanden sind, selbst bei niedrigen Konzentrationen. Es ist uns gelungen, Antikörper gegen TDP-43-Proteinvarianten zu erhalten, die an der Amyotrophen Lateralsklerose beteiligt sind.

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, morphologisch spezifische Reagenzien gegen das an Tar-DNA bindende Protein 43 in einem LS vorkommende Varianten unter Verwendung einer zweiphasigen, auf A FM basierenden Radio-Panning-Technologie zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine vielfältige Phagenbibliothek mehreren Runden negativen Pannings gegen nichtzielgerichtete Antigene unter Verwendung von Immunröhren ausgesetzt wird.Das negative Panning wird nacheinander gegen Rinderserumalbumin, aggregiertes Alpha-Synuclein und gesundes menschliches Hirngewebe durchgeführt. Der zweite Schritt besteht darin, nach jeder Serie negativen Pannings eine FM-Verifizierung durchzuführen, um sicherzustellen, dass alle unerwünschten Phagen erfolgreich entfernt wurden. In diesem Beispiel des negativen Pannings sind Phagen nach einer Runde sichtbar, jedoch nach der 10. Runde nicht mehr vorhanden.Anschließend werden aufgrund der begrenzten Probenverfügbarkeit die verbleibenden negativen Panning-Schritte an MICA durchgeführt. Phagen, die gegen immunpräzipitiertes TDP 43 aus gesundem Gewebe sowie aus Frontotemporal-Demenz- oder FTD-Gewebe reagieren, werden nacheinander entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, die Phagen zu isolieren, die an das a LS immunpräzipitierte Bindung zeigen.TDP 43 unter Verwendung von auf Mica gebundenen Phagen wird durch Trypsin, Triethylamin und TG-Eins-Zellen eluiert. Letztendlich wird die Spezifität dieser potenziellen ALS-Klone mittels indirekter ELISA- und Dot-Blot-Analysen überprüft, wobei homogenisiertes ALS-FTD- und gesundes menschliches Hirngewebe in beiden Assays immobilisiert wird. Im Vergleich zu den anderen getesteten Gruppen wird gewöhnlich eine stärkere Reaktivität gegenüber ALS-Gewebe nachgewiesen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der herkömmlichen phagenbasierten Bio-Panning-Methode liegt in der Anwendung umfassender negativer Panning-Protokolle, die durch ein FM überprüft wurden, um die Isolierung von Reagenzien sicherzustellen, die selektiv krankheitsspezifische Proteinvarianten direkt aus komplexen biologischen Proben erkennen, selbst wenn diese in niedrigen Konzentrationen vorliegen. Obwohl ein FM Einblicke in biomolekulare Eigenschaften und Wechselwirkungen ermöglichen kann, ist es auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise zur Überwachung des Fortschritts des Bio-Panning oder zur Bestätigung der Spezifität einzelner CLOs. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Phagenproduktion, wie im Textprotokoll beschrieben, um zunächst ein negatives Panning gegen BSA durchzuführen, und geben Sie vier Milliliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter hinzu.BSA-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS in 12 Immuno-Röhrchen geben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend Phagenpartikel aus jeweils drei Bibliotheken kombinieren, wobei eine kleine Menge dieser Phagenmischung für die spätere Überprüfung des negativen Panning-Prozesses beiseitegestellt wird. Danach die BSA-Lösung aus dem ersten Röhrchen entfernen und das Röhrchen zwei bis drei Mal mit PBS waschen, um nicht gebundenes BSA zu entfernen. Die kombinierten Phagenbibliotheken dann diesem ersten Röhrchen hinzufügen, 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Rotator inkubieren und anschließend die nicht gebundenen Phagen sammeln.Beachten Sie, dass es wichtig ist, nach Abschluss der zahlreichen Runden der negativen Panning gegen jedes Ziel eine kleine Menge Phagen aufzubewahren, um den Erfolg des Panning-Prozesses zu überprüfen und im Falle einer Kontamination den negativen Panning-Vorgang mit den verbleibenden Röhrchen BSA-Lösung jeweils zu wiederholen. Verwenden Sie die nach der Inkubation des vorherigen Röhrchens gesammelten ungebundenen Phagen. Überprüfen Sie anschließend die vollständige Entfernung aller BSA-Phagen-Binder mithilfe des im nächsten Abschnitt des Videos beschriebenen A-FM-Verfahrens.Um die Bindung von Phagen mittels einer FM zu visualisieren, geben Sie 10 bis 20 Mikroliter des Zielantigens auf gespaltenes Mica und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten lang. Waschen Sie das MICA fünfmal mit Wasser, geben Sie anschließend 10 bis 20 Mikroliter der Phagen auf das MICA und inkubieren Sie erneut fünf bis 10 Minuten lang. Waschen Sie das Mica danach weitere fünfmal mit Wasser und lassen Sie es an der Luft trocknen.Führen Sie einen KM-Bildgebungsprozess unter Verwendung eines KM-Tapping-Modus mit einem Nanoskop Drei und einer Steuerungseinheit an Luft bei Raumtemperatur durch. Die Silizium-KM-Sonden weisen eine Resonanzfrequenz von 300 Kilohertz und eine Federkonstante von 40 Newton pro Meter auf. Setzen Sie die KM-Spitze in den Spitzenlader ein.Befestigen Sie die Spitzenhalterung am A FM-Mikroskop. Platzieren Sie die Probe unter dem A FM-Mikroskop. Richten Sie mithilfe der Knöpfe den Laser auf die A FM-Spitze aus.Stellen Sie die Abtastrate auf 3,05 Hertz und die Scanauflösung auf 512 Abtastwerte pro Zeile ein. Optimieren Sie die Silica-Schwingung durch automatische Abstimmung des Geräts. Frequenz der Spitze, Start der Probenscanung.Die Spitze scannt die Oberfläche des MICA und misst dabei die Höhe der gebundenen Phagen. Die Phagen erscheinen als lange weiße Linien. Nach dem Erfassungsprozess werden die Bilder durch einfache Hintergrundglättung bearbeitet, um sicherzustellen, dass alle Partikelgrößen innerhalb jedes Bildes vergleichbar sind. Die Breite der Phagen kann von Bild zu Bild aufgrund anderer Partikelgrößen und des Scannbereichs variieren, dies beeinträchtigt jedoch niemals die Genauigkeit der Bindung von Phagen an das Antigen.Das Bild wird in ein 2D-Bild abgeflacht, und schlecht abgebildete Bereiche, die durch PEG-Kontamination verursacht wurden, werden zur Entfernung aus der zukünftigen Datenanalyse hervorgehoben. Immunpräzipitieren Sie gesundes TDP-43-Protein aus gesundem menschlichem Hirngewebe, wie im Textprotokoll beschrieben, aufgrund der geringeren Menge an immunpräzipitiertem Protein. Führen Sie diese Runden der negativen Panning unter Verwendung von MICA zuerst durch, indem Sie acht MICA-Oberflächen mit dem ersten MICA unter Zugabe von etwa 100 µL des immunpräzipitierten Proteins koppeln und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation.Waschen Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % Phosphat-gepufferter Salzlösung mit Tween 20, abgekürzt PBST. Danach etwa 100 Mikroliter Phagen nach der negativen Panning gegen gesundes menschliches Hirngewebe hinzufügen und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zur halben Inkubationszeit das immunpräzipitierte Protein der zweiten Mica hinzufügen.Sammeln Sie die Phagen von der ersten MICA, bevor Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % PBST waschen. Nach dem Waschen der zweiten MICA fügen Sie die zuvor gesammelten Phagen hinzu. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang, bis die Phagen negativ gegen alle acht MICA mit dem immunpräzipitierten Protein gepanzert wurden.Überprüfen Sie den Erfolg des Panning-Prozesses unter Verwendung des Phagen nach der ersten und achten Runde des negativen Pannings mit einem FM, um wie im Textprotokoll beschrieben das TDP-43-Protein aus den Gehirnen von Individuen mit einer LS immunpräzipitieren zu können, spalten Sie drei MICA-Oberflächen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter A LS TDP 43 zur ersten MICA nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Waschen Sie die MICA fünfmal mit 0,1 % PBST.Fügen Sie anschließend 50 µL der Phagen, die nach der negativen Panning gegen gesundes TDP 43 gesammelt wurden, zur MICA hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie die nicht gebundenen Phagen. Es ist wichtig, alle gesammelten Phagen in diesen Panning-Schritten getrennt aufzubewahren.Sammeln Sie anschließend die gebundenen Phagen mithilfe dreier Elutionsmethoden. Geben Sie zunächst 50 Mikroliter Trypsin zu jedem MICA hinzu und inkubieren Sie höchstens 10 Minuten lang. Sammeln Sie die Lösung ein und bewahren Sie sie auf.Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter 100 Millimolar Triethylamin zu jedem MICA hinzu und inkubieren Sie nicht länger als 10 Minuten. Sammeln Sie die Lösung in einem gleichen Volumen an einem molaren Tris-HCl-Puffer mit pH 7,4 und bewahren Sie sie auf. Als Drittes geben Sie 50 Mikroliter TG1-Zellen direkt zu dem MICA hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie außerdem die aus den ersten beiden Elutionsmethoden gewonnenen Phagen 100 Mikrolitern TG1-Zellen in derselben Konzentration hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.Als Nächstes wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer zweiten Mica. Nehmen Sie die gesammelten nicht gebundenen Phagen unter Verwendung der ersten MICA mit A LST DP 43 und geben Sie diese auf die zweite MICA mit A-A-L-S-T-D-P 43; inkubieren Sie fünf Minuten lang. Kombinieren Sie die TG1-Zellen, die mit den Phagen infiziert wurden und durch Trypsin aus jeder A LST DP 43 MICA freigesetzt wurden, und impfen Sie sie auf eine Luria-Burani-Platte mit Ampicillin oder eine LBA-Platte ab.Wiederholen Sie denselben Vorgang für die Triethylamin- und TG-one-alludierenden Phagen aus den beiden Sätzen von A LS TDP 43 MICA, insgesamt drei Platten. Wiederholen Sie alle Schritte mit einer dritten A LS-Mika, verwenden Sie in diesem Fall jedoch Phagen, die nach zwei Runden der negativen Panning gegen die frontotemporale Demenz gesammelt wurden. Impfen Sie die infizierten TG-one-Zellen auf drei LBA-Platten aus und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf den sechs LBA-Platten mit potenziellen a LS-Klonen. Auf den drei LBA-Platten aus dem dritten A LS MICA sollten weniger Kolonien vorhanden sein im Vergleich zu den drei LBA-Platten nach den zwei Runden positiven Pannings unter Verwendung des Phagen nach negativem Panning gegen gesundes TDP 43. Stellen Sie Phagen und lösliche variable einkettenige Antikörpfragment-Domänen oder s cvs aus diesen Klonen her und analysieren Sie sie mittels verschiedener Immunoassays, um die Spezifität gegenüber a LS-Gewebe zu überprüfen.Mittels FM-Bildgebung wird die negative Panning-Schritte gegen die verschiedenen Zielstrukturen überwacht, um sicherzustellen, dass alle reaktiven Phagen entfernt werden. FM-Ergebnisse zeigten eine Phagenbindung nach einer Runde negativen Pannings gegen aggregiertes alpha-Synuclein und keine Bindung nach acht Runden. Das negative Panning gegen gesundes menschliches Hirngewebe wurde durchgeführt, um Phagen zu entfernen, die an die zahlreichen Antigene im Homogenat gesunden menschlichen Gehirns binden.Hier wird die Phagenbindung an gesundes Gewebe nach einer Runde negativer Panning und keine verbleibende Phagenbindung nach 10 Runden negativer Panning gezeigt. Nach der Herstellung sowohl von Phagen als auch von löslichem SCFE aus potenziellen Klonen wurden diese im indirekten ELISA auf Spezifität gegenüber einem LS-Gewebe getestet. Fast alle Phagen zeigten eine Präferenz für ein LS-Gewebe gegenüber gesundem Gewebe.Ähnliche Ergebnisse werden bei dem Vergleich der Phagenbindung an eine LS mit Bindung an Frontotemporale Demenz- oder FTD-Gewebe erhalten. Der Vergleich der SCFV-Bindung an LS-Gewebe in gesundem und FTD-Gewebe zeigte erneut eine selektive Bindung an LS-Gewebe in nahezu allen Klonen. Der Dot-Blot-Immunassay wurde verwendet, um die Bindung an LS-Gewebe weiter zu bestätigen und auch um festzustellen, welche Klone in anderen immunologischen Anwendungen reaktiv sind.Hier wird ein Klon zwei a, der an ein LS-Gewebe bindet, gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein FM-basiertes Biop-Panning anwendet, um Reagenzien gegen krankheitsspezifische Zielstrukturen zu isolieren, die als potenzielle diagnostische und/oder therapeutische Werkzeuge dienen können.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

A-Tapping-Modus Rasterkraftmikroskop (AFM)-Methode zur Visualisierung von Plasmid-DNA, cytoplasmatische Proteine ​​und DNA-Protein-Komplexen beschrieben. Das Verfahren umfasst das alternative Ansätze zur Vorbereitung der Proben für AFM folgenden biochemischen Manipulation. DNA mit spezifischen Protein interagiert Regionen sind in der Nähe-physiologischen Puffer Bedingungen beobachtet.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Quelle: Lunelli, L., et. al. Blick auf Gehirnpolysomen mit Rasterkraftmikroskopie. J. Vis. Exp.(2016). Dieses Video zeigt die Bildgebung von Polysomen mittels Rasterkraftmikroskopie. Ein mit Nickelionen beschichtetes Glimmerblatt verankert RNA mit angehängten Ribosomen. Die Probe wird gewaschen, getrocknet und auf den Mikroskoptisch montiert. Die Cantilever-Spitze tastet die Probenoberfläche ab und zeichnet Laserablenkungen auf, um die Topologie abzubilden. Software wird eingesetzt, um...

 Bildgebung von Polysomen, die aus einem Mausgehirn isoliert wurden, mittels Rasterkraftmikroskopie

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Wir beschreiben die Anwendung von Infrarot-Nanospektroskopie und hochauflösender Atomkraftmikroskopie, um den Prozess der Protein-Selbstmontage in oligomere Aggregate und Amyloidfibrillen zu visualisieren, die eng mit dem Beginn und der Entwicklung verbunden sind. einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen.

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

Blutbasierte Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen sind für die Durchführung groß angelegter klinischer Studien unerlässlich. Ein zuverlässiger und validierter Bluttest sollte ein kleines Probenvolumen sowie eine weniger invasive Probenahmemethode erfordern, erschwinglich und reproduzierbar. Dieses Papier zeigt, dass der Immunoassay für kapillare Elektrophorese mit hohem Durchsatz Kriterien für die entwicklung potenzieller Biomarker erfüllt.

Verwendung von Kapillarelektrophorese Immunoassay zur Suche nach potenziellen Biomarkern der Amyotrophen Lateralsklerose in menschlichen Thrombozyten

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des TAR-DNA-bindenden Proteins 43 (TDP-43) durch Licht in den spinalen Motoneuronen am Beispiel des Zebrafisches.

Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Diese Studie skizziert experimentelle Methoden zur biochemischen Charakterisierung von GFAP und seinen krankheitserregenden Mutationen, mit Fokus auf Filamentassemblierung, Aggregation und posttranslationale Modifikation. Hochreine GFAP-Proteine wurden analysiert, was Einblicke in die Mechanismen der Alexander-Krankheit liefert, die einen Rahmen für die Untersuchung potenzieller therapeutischer Ziele sowie das Verständnis von GFAP-Mutationen und verwandten Erkrankungen bieten könnten.

Experimentelle Ansätze zur biochemischen Analyse des glialen fibrillären sauren Proteins und seiner krankheitsassoziierten Varianten

Erfahren Sie, wie Sie Antikörper gegen TDP-43-Varianten bei ALS mittels Rasterkraftmikroskopie und Biopanning isolieren. Diese Methode ermöglicht die selektive Erkennung krankheitsspezifischer Proteine aus biologischen Proben.

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