Name: Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Rekombinase-Polymerase-Amplifikation zur DNA-Quantifizierung mit interner positiver Kontrolle. Diese isotherme Methode ermöglicht präzise Konzentrationsbestimmungen ohne teures Gerät.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Bill &amp; Melinda Gates-Stiftung durch die Grand Challenges in Global Health Initiative finanziert.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Um aussagekräftige Quantifizierung Daten mit Hilfe des MATLAB-Algorithmus zu erhalten, muss der Benutzer bei der Aufforderung entsprechenden Eingabewerte auswählen. Nach Beginn jedes Skript in den Abschnitten 5 und 6 werden alle Eingangsgrößen automatisch im Befehlsfenster erbeten und Ausgänge werden automatisch generiert. In Abschnitt 5.7 wird der Benutzer aufgefordert, einen Schwellenwert für die Steigung zu wählen. Der Wert der Steigung Schwelle wirkt das Quadrat des Korrelationskoeffizient (r 2) des Passf...

Quantitative Nucleinsäureamplifikation ist eine wichtige Technik für den Nachweis von Umwelt, Lebensmittelvergiftungen und Wasser übertragenen Krankheitserregern sowie in der klinischen Diagnostik. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist der Goldstandard für empfindliche, spezifische und quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren, beispielsweise für HIV-1-Viruslasttest Nachweis bakterieller Erreger, und Screening auf vielen anderen Organismen 1 - 3. Während der qPCR, Primer amplifizieren pathogene DNA in Zyklen, und ein Fluoreszenzsignal erzeugt, das proportional zu der Menge der amplifizierten DNA in der Probe bei jedem Zyklus ist. Eine Probe, die eine unbekannte Konzentration von Pathogen-DNA kann unter Verwendung einer Standardkurve, die die anfängliche DNA-Konzentration von Standardproben und den Zeitpunkt, an dem das Fluoreszenzsignal einen bestimmten Schwellenwert erreicht (dh der Schwellenwert-Zyklus oder C T) bezieht quantifizieren. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Aufgrund der qPCR erfordert teure Temperaturwechsel Geräte und mehrere Stunden, um Ergebnisse, alternative isothermen Amplifikationsverfahren wie Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) zu erhalten, sind entwickelt worden 4. Diese Plattformen bieten in der Regel schneller Ergebnisse und verstärken Nukleinsäuren auf einem niedrigeren, einzigen Temperatur, die mit preiswerter, einfacher Ausrüstung durchgeführt werden kann. RPA, der für Point-of-Care-Anwendungen besonders attraktiv ist, verstärkt DNA in Minuten, benötigt eine geringe Verstärkung Temperatur (37 ° C) und bleibt in der Anwesenheit von Verunreinigungen 5,6 aktiv. RPA-Assays sind für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt, darunter Lebensmittelanalyse, Nachweis von Krankheitserregern, Krebs Wirkstoff-Screening, und die Aufdeckung von biothreat Agenten 7-12. Jedoch wird die Verwendung von RPA zur Quantifizierung von Nukleinsäuren wurde beschränkt 13,14. In früheren Arbeiten war es shown die quantitative Echtzeit-RPA (qRPA) möglich ist 15. Hier wird eine detailliertere Protokoll für die Verwendung von Echtzeit quantitative RPA zu unbekannten Proben mittels einer Standardkurve, eine Methode, die analog zur Quantifizierung mit qPCR Quantifizierung zur Verfügung gestellt. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein RPA-Reaktion auf einem Thermocycler sowie wie eine interne positive Kontrolle (IPC), um das System sicher, ordnungsgemäß funktioniert Entwicklung durchzuführen, um HIV-1-DNA als Proof-of-concept erfassen. Datenerfassung unter Verwendung eines Thermocyclers oder Mikroskop und die Datenanalyse für die Konstruktion einer Standardkurve unter Verwendung von Trainingsdaten werden auch beschrieben. Schließlich wird das Verfahren zur Quantifizierung von unbekannten Proben anhand der Standardkurve mit einem benutzerdefinierten Skript demonstriert. Diese qRPA Technik ermöglicht die Quantifizierung von Proben mit unbekannter Konzentration und hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Echtzeit-qPCR.

<table><tbody><tr><td>qRPA Assay</td> HIV-1 Forward Primer Integrated DNA Technologies Custom DNA Oligos <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA Oligos</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1-Sonde</td><td>BioSearch Technologies</td><td>benutzerdefinierte DNA-Oligos</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C C -3' &nbsp;</td></tr><tr><td>IPC-Sonde</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>benutzerdefinierte DNA-Oligos</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>RPA exo Reagenzien (Pellets, Rehydrationspuffer,</td><td>Magnesiumacetat TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tube Strips</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR Flat Cap Tube Strips</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Micro-seal Kleber</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1-Ziel (pHIV-IRES- eYFP&Delta; Env&Delta; Vif&Delta; Vpr)</td><td></td><td></td><td>kundenspezifisches Plasmid, siehe: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Charakterisierung und Nachweis von künstlich replikationskompetenten Lentiviren mit verändertem Wirtsbereich. Molekulare Therapie 8, 118&ndash; 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>Humane männliche genomische DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Cold-Block</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Puffer 1,0 M, pH 8,0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Entwicklung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum IPC-Vorlage</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>Es ist auch möglich, ein doppelsträngiges synthetisches Ziel bei IDT zu bestellen, wenn der Benutzer nicht in der Lage ist, mit C. parvum (einem BSL-2-Infektionserreger) zu arbeiten. PCR- und RPA-Primer für C. parvum wurden unter Verwendung der GenBank-Zugangsnummer AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR Long Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'</td></tr> entwickelt<tr><td>PCR langer reverser Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>benutzerdefinierte DNA-Oligos</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelty DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X Puffer</td><td>EMD Millipore 574797</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Experimente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aufrechte Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Tischheizung</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1-Kanal Präzision Hochstabiler Temperaturregler</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP Filterwürfel</td><td>Zeiss</td><td>Filtersatz 38 (000000-1031-346)</td><td>Anregung BP 470/40 nm, Emission BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>HEX Filter Würfel</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>Anregung BP 530/30 nm, Emission BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Laser Cutter</td><td>Engraver's Network</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" schwarzes Acryl</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm klares Acryl</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Office Depot</td><td>Duro Sekundenkleber&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl in PCR-Qualität</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Datenanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skript: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>Im SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB-Skript enthalten: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>Im SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB-Skript enthalten: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>Enthalten in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Enthalten in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Enthalten in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Enthalten in SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung eines quantitative rekombinase polymerase amplification assay mit einem internen positiven kontrolle

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA), eine isotherme Amplifikationsplattform für den Nachweis von Krankheitserregern, zur Quantifizierung der DNA-Probenkonzentration unter Verwendung einer Standardkurve verwendet werden kann. In diesem Manuskript wird ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung und Implementierung eines quantitativen Echtzeit-Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsassays (qRPA-Assay) bereitgestellt. Am Beispiel der HIV-1-DNA-Quantifizierung werden die Assemblierung von Echtzeit-RPA-Reaktionen, das Design einer internen Positivkontrollsequenz (IPC) und die Co-Amplifikation des IPC und des Ziels von Interesse beschrieben. Es werden Anweisungen und Datenverarbeitungsskripte für die Erstellung einer Standardkurve unter Verwendung von Daten aus mehreren Experimenten bereitgestellt, die zur Vorhersage der Konzentration unbekannter Proben oder zur Bewertung der Leistung des Assays verwendet werden können. Abschließend wird eine alternative Methode zur Erfassung von Echtzeit-Fluoreszenzdaten mit einem Mikroskop und einem Tischheizer als Schritt zur Entwicklung eines Point-of-Care qRPA-Assays beschrieben. Das Protokoll und die bereitgestellten Skripte können für die Entwicklung eines qRPA-Assays für jedes DNA-Ziel von Interesse verwendet werden.

Vor der Auswahl einer Sequenz, die als IPC in qRPA Experimente mit Ziel dienen (HIV-1) DNA, interne positive Kontrolle (IPC) Kandidaten erzeugt werden und für ihre Fähigkeit, in qRPA Reaktionen verstärken, ohne HIV-1-DNA vorhanden abgeschirmt. IPC-Kandidaten sind länger als das Ziel (HIV-1) DNA nach IPC Bildung von heraus konkurrierenden HIV-1 Amplikon Bildung zu verhindern. Wie in 2A, die Erzeugung von zwei C. gezeigten parvum IPC Kandidaten wurde durch die Anwesenheit von 415 und 435...

Bereitgestellt wird ein Protokoll zur Entwicklung eines Echtzeit-Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsassays zur Quantifizierung der Anfangskonzentration von DNA-Proben unter Verwendung eines Thermocyclers oder eines Mikroskops und einer Tischheizung. Ebenfalls beschrieben wird die Entwicklung einer internen Positivkontrolle. Skripte werden für die Verarbeitung von Echtzeit-Fluoreszenzrohdaten bereitgestellt.

Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der quantitativen rekombinativen Polymeraseverstärkung die DNA-Konzentration unbekannter Proben zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Ziel-DNA, eine interne positive Kontrolle, DNA-Primer und fluoreszenzmarkierte Sonden zur Reaktion hinzugefügt werden. In einem zweiten Schritt werden die Ansätze in die Echtzeit-PCR-Maschine gegeben, die die Reaktionen erhitzt, um die Enzyme zu aktivieren, und gleichzeitig die Fluoreszenz der Sonden überwacht, um die Bildung der Ziel- und Kontroll-Amplicons nachzuweisen.Anschließend werden die fluoreszenten Daten mithilfe eines Skripts analysiert, um die Standardkurve zu erstellen und den Assay zu validieren. Die Ergebnisse zeigen, dass DNA-Proben innerhalb einer Größenordnung der korrekten Konzentration genau quantifiziert werden können, basierend auf den Validierungsexperimenten zur Quantifizierung einer HIV-Einzelziel-DNA. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der echtzeitquantitativen PCR besteht darin, dass die RPA isotherm ist und daher kein teurer Thermocycler benötigt wird.RPA erfordert auch eine geringere Amplifikationstemperatur, ist gegenüber verunreinigten Proben tolerant, amplifiziert das Ziel innerhalb weniger Minuten bis zu nachweisbaren Konzentrationen und nutzt lyophile Enzyme, wodurch ein einfacher Transport und eine Lagerung bei Raumtemperatur ermöglicht werden. Beginnen Sie damit, alle Arbeitsflächen und Geräteoberflächen mit einer 50 %igen Bleichlösung zu reinigen, um einen sauberen Bereich für die Präamplifikation zu schaffen. Entnehmen Sie die 280 mM Magnesiumacetatlösung, den Rehydratisierungspuffer und die Reaktionspellets aus dem minus 20 °C tiefen Gefrierschrank und lassen Sie die Lösungen bei Raumtemperatur auftauen. Bereiten Sie anschließend eine Master-Mix-Lösung vor, indem Sie 383,5 µL des Rehydratisierungspuffers in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen, 41,6 µL nukleasefreies Wasser zum Puffer geben und vortexen, um die Lösung zu mischen. Geben Sie 35 µL Magnesiumacetat in ein separates Röhrchen. Stellen Sie das Magnesiumacetat in den Rehydratisierungspuffer-Stammlösungen zurück in den Gefrierschrank. Danach entnehmen Sie den Primer und die Prob-Quas aus dem Kühlschrank bei vier Grad Celsius. Platzieren Sie sie im Vorverstärkungsarbeitsbereich und schalten Sie das Licht aus, um die Lichtexposition zu minimieren, bei 27,3 Mikrolitern jedes der 10-Mikromolar-Frontwärts- und Rückwärtsprimer zum Mastermix. Fügen Sie anschließend 7,8 Mikroliter der 10 Mikromolar hex-markierten HIV-1-DNA-Sonde zur Master-Mischung hinzu und wirbeln Sie das Gefäß kurz an. Danach kehren Sie die Primer- und Sonden-Stammlösungen in den Kühlschrank zurück. Reagenzien für die interne positive Kontrolle können hier wie im Textprotokoll angegeben hinzugefügt werden, um die QRPA-Reaktionen aufzusetzen. Stellen Sie zunächst die gefriergetrockneten Enzym-Pellets in einzelne Gefäße eines zweireihigen, flachen PCR-Röhrchenstreifens mit acht Vertiefungen. Pipettieren Sie 37,5 Mikroliter der Master-Mischung in ein Gefäß, das ein Pellet enthält.Rühren Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes vorsichtig mit der Pipettenspitze um, um das Pellet aufzulösen, ohne dabei Blasen zu bilden. Entfernen Sie die Spitze vorsichtig aus der Reaktion, um ein Volumenverlust zu vermeiden, und vergewissern Sie sich, dass Sie zwischen jedem Reaktionsgefäß die Pipettenspitzen wechseln. Überführen Sie die Reaktionsgefäße für mindestens fünf Minuten in einen gekühlten 96-Loch-Kühlblock, um die Master-Mix-Lösung abzukühlen.Unterdessen laden Sie die Software des Thermocyclers mit dem Protokoll und der in dem schriftlichen Protokoll angegebenen Plattenanordnung. Schneiden Sie anschließend zwei Streifen aus transparentem, selbstklebendem Mikroplattenverschlussfolie so zurecht, dass sie etwas breiter als die PCR-Röhrchen sind. Beschaffen Sie außerdem zwei flache PCR-Röhrchenstreifen-Deckel und portionieren Sie die HIV-1-Plasmidvorlage gemäß der Angabe im schriftlichen Protokoll.Und dann 10 µL der Vorlage dem entsprechenden PCR-Röhrchen hinzufügen. Auch hier die Mischung vorsichtig mit der Pipettenspitze verrühren. Als Nächstes 2,5 µL Magnesiumacetat auf jeden Röhrchenverschluss geben und dann die Verschlüsse vorsichtig auf die Reaktionsröhrchen setzen, sodass diese nicht vollständig verschlossen sind.Das Magnesiumacetat sollte deutlich durch den Verschluss sichtbar sein. Die PCR-Röhrchenstreifen in eine Mikrozentrifuge geben und 10 Sekunden lang zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit am Röhrchenboden zu sammeln und eventuelle Bläschen zu entfernen. Das Mischen der Magnesiumacetatlösung mit der Master-Mix-Lösung initiiert die QRPA-Reaktion.Entnehmen Sie die PCR-Röhrchen umgehend dem Wärmeblock, um die Reaktion zu stoppen. Öffnen Sie anschließend langsam die Deckel, um eine Kontamination der Ansätze zu vermeiden, und verschließen Sie die Röhrchen mit einer klaren Mikro-Seal-Folie. Überführen Sie die Röhrchen entsprechend der Positionen im Plattenlayout in den Thermocycler.Schließen Sie den Deckel des Thermocyclers und klicken Sie auf „Startlauf“. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Dateinamen für das Experiment festlegen, sobald der Lauf abgeschlossen ist. Zeigen Sie die rohen Fluoreszenzdaten an und exportieren Sie sie in eine Tabellenkalkulation, wodurch eine Datei mit dem Namen Quantifizierungsverstärkungsergebnisse erstellt wird.Um die Standardkurve zu erstellen. Laden Sie zunächst das Skript für die Standardkurve herunter und öffnen Sie anschließend MATLAB oder ein ähnliches Datenanalyseprogramm. Öffnen Sie das Skript und klicken Sie auf „Ausführen“, um das Skript zu starten.Geben Sie bei Aufforderung die Anzahl der zu analysierenden Datendateien ein. Geben Sie anschließend die Anzahl der Proben und die Anzahl der Wiederholungen in jeder Trainingsdatei im Befehlsfenster ein.Geben Sie die niedrigste DNA-Konzentration in dekadischen Logarithmus-Stufen (Basis 10) ein, die zur Erstellung der Standardkurve verwendet wurde, und drücken Sie die Eingabetaste. Im hier gezeigten Beispiel beträgt die niedrigste Konzentration eine dekadische Logarithmusstufe mit 10 Kopien.Geben Sie dann die Konzentrationsdifferenz zwischen jedem DNA-Standard in die Eingabeaufforderung ein und drücken Sie hier die Eingabetaste. Das Konzentrationsintervall beträgt eine log-Stufe mit Basis 10 Kopien. Geben Sie anschließend den Wert für die Steilheitschwelle in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste.Dieser Wert liegt typischerweise zwischen drei und fünf. Geben Sie die Anzahl der Standardabweichungen über dem Hintergrund für die positive Schwelle, auch bekannt als Z, ein und drücken Sie dann die Eingabetaste. Typische Z-Werte liegen zwischen eins und fünf. Geben Sie anschließend das Gerät an, das zur Datenerfassung verwendet wurde.Geben Sie eine Eins für den Thermocycler ein und drücken Sie dann die Eingabetaste. Falls eine interne positive Kontrolle vorhanden ist, wählen Sie den Standardwert oder einen neuen Schwellenwert aus, indem Sie je nach Notwendigkeit eines neuen Schwellenwerts Y oder N eingeben. Wählen Sie abschließend alle Tabellenkalkulationsdateien aus, die zur Erstellung der Standardkurve verwendet werden sollen.Das Skript importiert und analysiert anschließend automatisch alle Daten. Echtzeit-QRPA wurde an duplizierten Proben durchgeführt, die unterschiedliche Kopienzahlen von HIV-1-DNA enthielten. Der Beginn der nachweisbaren Amplifikation, gekennzeichnet durch einen Anstieg der Fluoreszenz, trat bei Proben mit höherer DNA-Kopienzahl früher ein als bei Proben mit niedrigerer Kopienzahl. Die rohen Fluoreszenzdaten wurden verwendet, um eine Standardkurve anhand der Amplifikation bekannter Konzentrationen von HIV-1-DNA zu erstellen. Diese Daten wurden an eine exponentielle Kurve angepasst, und der R-Quadrat-Wert zeigt eine hohe Güte der Anpassung an.Die Standardkurve wurde verwendet, um die Konzentrationen zusätzlicher DNA-Proben mit bekannter Konzentration vorherzusagen. Die Anpassung des Werts von Z auf eins ermöglicht eine genaue Vorhersage niedriger DNA-Konzentrationen. Im Gegensatz dazu werden hohe DNA-Konzentrationen besser mit einem Z-Wert von fünf vorhergesagt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die RPA über keine echten Zyklen zur Begrenzung der DNA-Amplifikationsrate verfügt. Daher muss die Amplifikationsrate genau kontrolliert werden. Die Konsistenz zwischen Experimenten ist entscheidend, daher sollten für alle Experimente dieselben Primer-Aliquots verwendet werden.Schützen Sie die Reaktionsbestandteile vor Wärme und Licht. Geben Sie Magnesiumacetat unmittelbar vor Beginn der Datenerfassung hinzu und bewahren Sie die Reaktionen bis zum Start im Kälteblock auf. Das Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode für die Identifizierung der Quelle der fäkale / Urin Kontamination oder Verunreinigung durch Nitrat in Wasser mittels qPCR für die spezifische Quantifizierung von Mensch / Schwein / Rind DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren als MST-Tools vorgeschlagen.

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In diesem Video demonstrieren wir die Duplex-Digital-PCR (ddPCR)-Technik — eine Modifikation der traditionellen PCR-Technik, die nützlich ist, um zwei verschiedene genetische Marker gleichzeitig zu detektieren. Eine einzelne PCR-Reaktion wird in nanolitergroße emulgierte Tröpfchen aufgeteilt, die unabhängig voneinander amplifiziert werden, und der Nachweis verschiedenfarbiger Fluoreszenzamplifikationssignale aus der Tröpfchenfraktion wird verwendet, um die Anfangskonzentration der Zielsequenzen...

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Hier beschreiben wir eine Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Exzisionskreisen (TRECs) und K-löschenden Rekombinations-Exzisionskreisen (KRECs). Der TREC/KREC-Assay kann als Marker für die Thymus- und Knochenmarkausscheidung verwendet werden.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode, die zum Nachweis und zur Quantifizierung von EHV-2-DNA in Atemwegsflüssigkeiten von Pferden verwendet wird. Das EHV-2 qRT-PCR-Validierungsprotokoll umfasst ein dreiteiliges Verfahren: Entwicklung, Charakterisierung des qRT-PCR-Assays allein und Charakterisierung der gesamten Analysemethode.

Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

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Detaillierte Anweisungen werden bereitgestellt, um ein modulares Open-Source-Fluorimeter zu bauen, das mit vielen kostengünstigen Heizgeräten kompatibel ist, um eine quantitative isotherme Nukleinsäureamplifikation in Echtzeit durchzuführen.

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Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

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