Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die quantitative Rekombinase-Polymerase-Vereinfachung zu nutzen, um die DNA-Konzentration unbekannter Proben zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem der Reaktion zunächst die interne Positivkontrolle der Ziel-DNA, DNA-Primer und fluoreszenzmarkierte Sonden hinzugefügt werden. In einem zweiten Schritt werden die Reaktionen in die Echtzeit-PCR-Maschine gegeben, die die Reaktionen erhitzt, um die Enzyme zu aktivieren, und die Fluoreszenz der Sonden überwacht, um die Erzeugung von Ziel- und Kontrollamplikons zu erkennen.

Anschließend werden die Fluoreszenzdaten mit Hilfe eines Skripts analysiert, um die Standardkurve zu generieren und den Assay zu validieren. Die Ergebnisse zeigen, dass DNA-Proben auf der Grundlage der Validierungsexperimente, die zur Quantifizierung einer HIV-Ziel-DNA verwendet werden, innerhalb einer Größenordnung der korrekten Konzentration genau quantifiziert werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen Echtzeit-PCR besteht darin, dass RPA isotherm ist, so dass kein teurer Thermocycler benötigt wird.

RPA erfordert auch eine niedrigere Amplifikation auf Temperatur, ist tolerant gegenüber verschmutzten Proben, amplifiziert das Ziel innerhalb von Minuten auf nachweisbare Werte und verwendet lly-Enzyme, um einen einfachen Transport und eine einfache Lagerung bei Raumtemperatur zu ermöglichen. Um mit der Reinigung aller Tisch- und Geräteoberflächen mit einer Lösung aus 50 % Bleiche zu beginnen, um einen sauberen Arbeitsbereich vor der Amplifikation zu schaffen, entfernen Sie die 280 Millimolare Magnesiumacetatlösung, den Rehydrationspuffer und die Reaktionspellets aus dem minus 20 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen Sie die Lösungen bei Raumtemperatur auf. Stellen Sie dann einen Mastermix zusammen, indem Sie 383,5 Mikroliter des Rehydrationspuffers in ein neues Mikrofuge-Röhrchen mit 41,6 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser in den Puffer überführen und einen Vortex, um 35 Mikroliter Magnesiumacetat in ein separates Röhrchen zu mischen.

Das Magnesiumacetat in den Rehydrationspufferlösungen wieder in den Gefrierschrank stellen. Holen Sie sich dann die Grundierung und das Prob quas aus dem vier Grad Celsius Kühlschrank. Platzieren Sie sie im Arbeitsbereich vor der Verstärkung und schalten Sie das Licht aus, um die Lichteinstrahlung auf 27,3 Mikroliter jedes der 10 mikromolaren Vorwärts- und Rückwärtsprimer auf den Mastermix zu minimieren.

Als nächstes folgten 7,8 Mikroliter des 10 Mikromolaren Hex-Hexadezimals, das mit HIV 1D NA markiert ist. Sondieren Sie zum Mastermix und wirbeln Sie das Röhrchen ein. Geben Sie dann den Primer und die Sondenstammlösungen an die Lagerung zurück, hier können Reagenzien für die interne Positivkontrolle hinzugefügt werden, wie im Textprotokoll angegeben, um die QRPA-Reaktionen zusammenzusetzen. Legen Sie zuerst die gefriergetrockneten Enzympellets in einzelne Röhrchen mit zwei Röhrchen, flache PCR-Röhrchenstreifen mit acht Vertiefungen, pipettieren Sie 37,5 Mikroliter des Mastermixes in ein Röhrchen mit einem Pellet

Rühren Sie den Inhalt des Röhrchens vorsichtig mit der Pipettenspitze um, um das Pellet aufzulösen, ohne Blasen zu bilden. Entfernen Sie die Spitze vorsichtig aus der Reaktion, um einen Volumenverlust zu vermeiden, und stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitzen zwischen den einzelnen Röhrchen gewechselt werden. Übertragen Sie die Röhrchen für mindestens fünf Minuten in einen gekühlten 96-Well-Kaltblock, um den Mastermix abzukühlen.

In der Zwischenzeit wird die Thermocycler-Software mit dem Protokoll geladen und das Plattenlayout wird im Textprotokoll angezeigt. Schneiden Sie als Nächstes zwei Streifen durchsichtiger Mikro-Dichtungsklebstoffe aus Kunststoff so ab, dass sie etwas breiter sind als die PCR-Röhrchen. Und erhalten Sie auch zwei flache PCR-Röhrchen-Streifendeckel, aliquotieren Sie die HIV-Ein-Plasmid-Vorlage, wie im Textprotokoll angegeben.

Geben Sie dann 10 Mikroliter des Templates in das entsprechende PCR-Röhrchen. Rühren Sie die Mischung wieder vorsichtig mit der Pipettenspitze um. Geben Sie als Nächstes 2,5 Mikroliter des Magnesiumacetats auf jede Röhrchenkappe und setzen Sie die Kappen dann vorsichtig auf die Reaktionsröhrchen, so dass sie nicht vollständig verschlossen sind.

Das Magnesiumacetat sollte durch die Kappe gut sichtbar sein. Legen Sie die PCR-Röhrchenstreifen in eine Mikrozentrifuge und zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang, um die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln und alle Blasen zu entfernen. Durch die Kombination der Magnesiumacetatlösung mit dem Mastermix wird die QRPA-Reaktion eingeleitet.

Entfernen Sie die PCR-Röhrchen schnell zum kalten Block, um die Reaktion zu stoppen. Entfernen Sie anschließend langsam die Deckel, um eine Kontamination der Reaktionen zu vermeiden, und versiegeln Sie die Röhrchen mit einer durchsichtigen Mikroversiegelungsfolie. Übertragen Sie die Rohre entsprechend den Positionen im Plattenlayout an den Thermocycler.

Schließen Sie den Deckel des Thermocyclers und klicken Sie auf Lauf starten. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Dateinamen für das Experiment angeben, wenn die Ausführung abgeschlossen ist. Zeigen Sie die Fluoreszenzrohdaten an und exportieren Sie sie in eine Tabelle, die eine Datei mit dem Namen Quantifizierungsamplifikationsergebnisse erstellt.

Um die Standardkurve zu erstellen. Laden Sie zuerst das Standard-Kurvenskript herunter und öffnen Sie dann MATLAB oder ein ähnliches Datenanalyseprogramm. Öffnen Sie das Skript, und drücken Sie Ausführen, um das Skript auszuführen.

Geben Sie die Anzahl der zu analysierenden Datendateien ein, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Geben Sie als Nächstes die Anzahl der Stichproben und die Anzahl der Replikate in jeder Trainingsdatei ein. Im Befehlsfenster.

Geben Sie die niedrigste DNA-Konzentration in logarithmischen 10 Kopien ein, die zum Erstellen der Standardkurve verwendet wurde, und drücken Sie die Eingabetaste. Im Beispiel hier. Die niedrigste Konzentration ist ein Logarithmus basierend auf 10 Kopien.

Geben Sie dann den Konzentrationsunterschied zwischen den einzelnen DNA-Standards in die Eingabeaufforderung ein und drücken Sie hier die Eingabetaste. Das Konzentrationsintervall beträgt ein Logarithmus basierend auf 10 Kopien. Geben Sie anschließend den Wert für den Steigungsschwellenwert in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste.

Dieser Wert liegt in der Regel zwischen drei und fünf. Geben Sie die Anzahl der Standardabweichungen über dem Hintergrund für den positiven Schwellenwert ein, der auch als Z bezeichnet wird, und drücken Sie dann die Eingabetaste. Typische Z-Werte liegen zwischen eins und fünf. Geben Sie als Nächstes das Gerät an, das in diesem Fall zum Erfassen der Daten verwendet wurde.

Geben Sie eins für den Thermocycler ein, und drücken Sie dann die Eingabetaste. Wenn es eine interne Positivkontrolle gibt, wählen Sie den Standardwert oder einen neuen Wert für den Schwellenwert aus, indem Sie Y oder N eingeben, je nachdem, ob ein neuer Schwellenwert erforderlich ist. Wählen Sie abschließend alle Tabellenkalkulationsdateien aus, die zum Erstellen der Standardkurve verwendet werden sollen.

Das Skript importiert und analysiert dann automatisch alle Daten. Die Echtzeit-QRPA wurde an doppelten Proben durchgeführt, die unterschiedliche Kopienzahlen von HIV 1D NA enthielten. Der Beginn der nachweisbaren Amplifikation, der durch eine Zunahme der Fluoreszenz angezeigt wird, tritt bei Proben mit höheren DNA-Kopienzahlen früher auf als bei Proben mit niedrigeren Kopienzahlen. Die rohen Fluoreszenzdaten wurden verwendet, um eine Standardkurve aus der Amplifikation bekannter Konzentrationen von HIV 1D NA zu erstellen. Diese Daten wurden an eine Exponentialkurve angepasst, und der R-Quadrat-Wert gibt eine hohe Anpassungsgüte an.

Die Standardkurve wurde verwendet, um die Konzentrationen zusätzlicher DNA-Proben mit bekannter Konzentration vorherzusagen. Die Einstellung des Z-Wertes auf eins ermöglicht eine genaue Vorhersage niedriger DNA-Konzentrationen. Im Gegensatz dazu lassen sich hohe DNA-Konzentrationen mit einem Z-Wert von fünf besser vorhersagen.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass RPA keine echten Zyklen hat, um die Rate der DNA-Amplifikation zu begrenzen. Die Verstärkungsrate muss also genau gesteuert werden. Die Konsistenz zwischen den Experimenten ist entscheidend, also stellen Sie sicher, dass Sie für alle Experimente die gleichen Primer-Aliquots verwenden.

Schützen Sie Reaktionskomponenten vor Hitze und Licht. Fügen Sie Magnesiumacetat unmittelbar vor Beginn der Datenerfassung hinzu und halten Sie die Reaktionen bis zum Beginn im kalten Block. Das Experiment.