Name: Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Elektrospinnanofasergerüsten mit graduierter Faserorganisation aus Polycaprolacton. Diese Methode ermöglicht die Steuerung von Zellmorphologie und -orientierung für Anwendungen in der Geweberegeneration.

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Diese Arbeit wurde von der Anschubfinanzierung von der University of Nebraska Medical Center und National Institute of Health (Förderkennzeichen 1R15 AR063901-01) unterstützt.

1. Herstellung der Lösung <ol><li> Es wird eine Lösung von Poly (ε-caprolacton) (PCL) (M w = 80.000 g / mol) bei einer ungefähren Konzentration von 100 mg / ml. Löse PCL in einem Gemisch von Dichlormethan (DCM) und N, N-dimethlyformamide (DMF) in einem Verhältnis von 4: 1 (v / v) mit einer Konzentration von 10% (w / v). </li><li> Legen Sie die Lösung in einem 20 ml Glasröhrchen zum Mischen. Platzieren Glasrohr in Ultraschallreiniger für 30 Minuten oder bis die Lösung durchlässig ist. </li></ol> 2. Geräte Vorbereitung <ol><li> Fügen Sie den PCL-Lösung vorbereitet in eine 5-ml-Spritze mit einer 21-Gauge-stumpfe Nadel. </li><li> Platzieren Spritzenpumpe in vertikaler Elektrospinnposition gemäß Figur 1. </li><li> Verwenden Sie ein Stahl-Lücke Sammler Edelstahl mit einem offenen Raum von 2 cm x 5 cm für die ausgerichtete Fasersubstrat. Platzieren Sie den Sammler 12 cm von der Nadelspitze. </li><li> Verbinden Sie den Gleichstrom (DC) Hochspannungsnetzteil an dieNadel und erden Sie die Sammler. Stellen Sie sicher, dass der Kollektor ist einzeln ohne Kontakt zur anderen Laborgeräten geerdet. </li></ol> 3. Das Elektro <ol><li> Set Spritzenpumpe auf 1,50 ml / h, bis die Tröpfchen bilden an der Nadelspitze sofort ersetzt werden, wenn entfernt. Dann stellen Sie die Durchflussrate auf 0,50 ml / h. </li><li> Schalten Sie die Spannung Betreiber bis 12 kV. </li><li> Elektrospinnen, bis die uniaxial ausgerichteten Fasern vollständig zu bedecken die Lücke auf dem Sammler. </li><li> Leim auf die Kanten einer Glasplatte und Übertragung der Fasern von dem Spalt Kollektor mit der Glasplatte. Legen der Glasplatte auf der Oberseite von einem Stück Aluminiumfolie, die die gleiche Größe wie die Glasplatte und ist geerdet. </li><li> Positionieren Sie die zweite Spritze Kollektor nach 3. </li><li> Bringen Sie die Kunststoffmaske zum zweiten Spritzenpumpe und positionieren 2 mm oberhalb des Kollektors. </li><li> Hinzufügen Coumarin 6 bei 1% (w / w) in der PCL-Lösung, wenn nanoencapsulation ist desired- und mische bis die Lösung durchlässig ist. </li><li> Laden Sie den PCL oder PCL / Cumarin 6 Lösung in eine 5 ml Nadel mit einem stumpfen 21-Gauge-Nadel. Stellen vertikale Pumpen bis 0,50 ml / h und horizontal auf 9 ml / h oder bei einer ungefähren Geschwindigkeit von 1 mm / min zu ziehen. </li><li> Elektrospinnen, bis die Maske fast vollständig aus dem Kollektor mit dem Randbereich nach wie vor unter der Maske bewegt, aber. </li></ol> 4. Fasercharakterisierung <ol><li> Prüfmuster mit doppelseitige leitende Band an der metallischen Bolzen und Mantel mit Platin für 40 sec mit einem Sputter-Coater bei 40 mA. <ol><li> Untersuchen Fasern durch Rasterelektronenmikroskop (SEM) nach unseren früheren Studien 17,18. </li><li> Sammeln Bilder bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV. </li></ol></li><li> Durchführen von schnellen Fourier-Transformation (FFT) auf einem getrennten Faserprobe die Faserausrichtung zu messen. Die detaillierten Angaben zum Messfaserausrichtung durch FFT kann beziehen to früheren Studien 19,20. </li></ol> 5. Seeding Stammzellen. <ol><li> Sterilisation der Faserproben durch Eintauchen in eine 70% Ethanollösung für 2 Std. Dann waschen die Fasern mit destilliertem Wasser, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Erhalten menschlichen ADSCs und Kulturzellen in einem 25 cm 2 -Kolben bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95% Luft / 5% CO 2. Ändern Sie jeden zweiten Tag 10 das Zellkulturmedium. </li><li> Trypsinieren die Zellen und die Anzahl der Zellen. Genauer gesagt, nehmen Sie das Kulturmedium aus der Zellkulturflasche und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zweimal. Dann fügen Sie 1 m l einer 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (pre-warm im Wasserbad auf 37 ° C), um die Zellschicht zu bedecken und die Flasche in der Zellkulturbrutschrank inkubieren für 2-3 Minuten. 4 ml Kulturmedium und waschen Sie alle Zellen von der Oberfläche durch Pipettieren des Mediums über die gesamte Oberfläche. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und redispergieren the Zellpellet in Kulturmedium. Count-Zellen über Hämazytometer. Seed etwa 1 × 10 4 Zellen zur Nanofasergerüst in einem 35 mm -Kultur Schale gelegt und Inkubation für 3 und 7 Tagen. </li><li> Stain-Zellen unter Verwendung von Fluoresceindiacetat (5 mg / ml in Aceton) (FDA) dann bild die Proben unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops. Genauer gesagt, werden 100 ul des FDA-Lösung in die Kulturschale pipettieren und 30 min. Dreimal vor Fluoreszenzabbildung waschen Zellen mit PBS. Analysieren Zellorientierung durch eine kundenspezifische Matte-lab-Programm auf der Grundlage unserer bisherigen Studien 10. </li></ol>

<ol><li>Xie, J., Li, X., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+electrospun+nanofibers+to+work+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research.</a> Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).</li>
<li>Genin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+grading+of+mineral+and+collagen+in+the+attachment+of+tendon+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone.</a> Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).</li>
<li>Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fiber+orientation+at+the+tendon+to+bone+insertion+and+its+influence+on+stress+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations.</a> J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).</li>
<li>Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+biomechanical%2C+structural%2C+and+compositional+properties+along+the+tendon+to+bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site.</a> J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).</li>
<li>Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+morphogenesis+of+the+tendon-to-bone+insertion+-+What+development+can+teach+us+about+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing.</a> Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).</li>
<li>Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+mineral+content+for+mimicking+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site.</a> Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).</li>
<li>Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+study+of+osteoblast+response+to+nanotopography+by+means+of+nanoparticle-density+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients.</a> Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).</li>
<li>Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizable+nanomorphology+gradients+via+colloidal+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly.</a> Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Aligned-to-random%27+nanofiber+scaffolds+for+mimicking+the+structure+of+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site.</a> Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).</li>
<li>Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+fiber+organization+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications.</a> Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).</li>
<li>James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+tissue+engineering%3A+adipose-derived+stem+cell+and+GDF-5+mediated+regeneration+using+electrospun+matrix+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems.</a> Biomed. Mater. 6 (2), 025011(2011).</li>
<li>Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+in+functional+bone+tissue+engineering%3A+lessons+from+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).</li>
<li>Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+%28hASCs%29+in+a+porous+three-dimensional+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).</li>
<li>Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+characterization+and+current+application+in+orthopaedic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair.</a> Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stem+cells%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiation+of+embryonic+stem+cells+seeded+on+electrospun+nanofibers+into+neural+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages.</a> Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+nanofiber+scaffolds+with+different+orders%2C+structures%2C+and+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties.</a> ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+anisotropy+in+electrospun+tissue+engineering+scaffolds%3A+analysis+of+fiber+alignment+by+the+fast+Fourier+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform.</a> Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fiber+alignment+in+electrospun+scaffolds%3A+a+user%E2%80%99s+guide+to+the+2D+fast+Fourier+transform+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Poly.+Ed%22%5BJournal%5D)">Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach.</a> J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der kritischste Teil des Protokolls ist die Generierung des Gradientengerüsts. Es ist zwingend erforderlich, dass sich die Maske, die den Kollektor abdeckt, mit einer konstanten Geschwindigkeit bewegt, damit sich das Fasergerüst allmählich verändert. Die richtige Zubereitung der PCL-Lösung ist ebenfalls wichtig, um den Erfolg des Elektrospinnens zu gewährleisten. Es ist empfehlenswert, die Fasermorphologie vor dem Elektrospinnen zu überprüfen, insbesondere nach der Verkapselung von Cumarin-6, die möglicherweise eine höhe...

Nanofasern sind eine beliebte Dienstprogramm für das Tissue Engineering die aufgrund ihrer Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix in der Struktur und der relativen Größe 1 nachahmen. Jedoch können einige native Gewebe Schnittstellen wie die Sehne-Knochen-Insertionsstelle, enthält Kollagenfasern, das eine variable Organisationsstruktur, die in Ausrichtung hin zunimmt Sehne und nimmt an der Knochenstelle 2-5 aufweisen. Also, für eine effektive Regeneration der Gewebe gibt es eine Notwendigkeit, ein Gerüst, das diesen strukturellen Gradienten effektiv nachahmen herzustellen. Zuvor hat es Forschung zu langsamen Veränderungen in der Fasermasse durchgeführt, und zwar, Mineralgehalt 6. Allerdings, wieder die Strukturkomponente des Bindegewebes bleibt weitgehend unerforscht. Eine frühere Studie geprüft morphologischen Gradienten durch die Untersuchung der Wirkung der Oberflächen Siliciumdioxid Teilchendichte auf die Proliferation von Ratten-Schädel Osteoblasten und fanden ein inverse Verhältnis zwischen Kieselsäure Teilchendichte und Zellproliferation 7. Aber die morphologischen Veränderungen, die in früheren Arbeiten vermittelten Zellproliferation waren meist verwandten Oberflächenrauhigkeit fehlt die Fähigkeit, in Nachahmung Faser organisatorische Veränderungen 7,8. Eine neuere Studie versucht, ein Gerüst, das die einzigartigen Kollagenfaserorientierungen durch die Verwendung eines neuartigen Kollektor zum Elektro 9 nachgeahmt herzustellen. Während dieser Studie gelungen, ein Gerüst mit beiden ausgerichtet und Wirrfasern, versäumt es, die schrittweise Veränderung der nativen Geweben ausgestellt imitieren. Auch bei der Herstellung von Einzelkomponenten, mit einem sofortigen Wechsel von der willkürlichen Orientierung ausgerichtet ist, die biomechanischen Eigenschaften dieses Gerüst deutlich zurückgegangen. Keine frühere Arbeit ist es gelungen, zutreffend Nanofasergerüste mit kontinuierlichen Abstufungen in der Faserorientierungen von fluchtenden und zufälligen erzeugen. Unsere aktuelle Studie hat erfolgreiche Erholung der Nanofasergerüste gezeigtmit Abstufungen in Faser-Organisation, die möglicherweise nachahmen kann das native Kollagen Organisation Sehne-Knochen-Insertion 10. Diese Arbeit zielt darauf ab, die für die Herstellung von Nanofasergerüste mit einer Struktur, die sehr ähnlich ist, dass der Faser-Organisation in der Landes Sehnen-Knochen-Gewebe-Grenzfläche verwendeten Protokolle zu präsentieren. Gradient Nanostrukturen möglicherweise weitreichenden Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen. Wir konzentrierten uns auf die Anwendungen auf Tissue Engineering der Sehne-Knochen-Insertionsstelle durch die Kombination unserer Gerüste mit Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die bereits für die Geweberegeneration auf verschiedenen Substraten 11-14 eingesetzt werden. Darüber hinaus sind ADSCs sehr ähnlich in der Natur, um Stammzellen des Knochenmarks hinsichtlich der Multipotenz und ihre Ressourcen reichlich vorhanden ist, die mit einem einfachen Fettabsaugung 15,16 geerntet werden können. Seeding diese Zellen auf Nanofasergerüste abgestuft weitere Verbesserung ihrer tisklagen Ingenieuranwendungen, indem es für die gesteuerte Verteilung der Zellen, die potentiell in verschiedenen Geweben differenzieren können. Zusätzlich zum Impfen Stammzellen können Nanofasern mit Signalmolekülen zur Regulierung der zellulären Antwort eingekapselt werden. Koppeln Nanoverkapselung mit der organisatorischen Gradienten dieser Gerüste ermöglicht die Untersuchung von Zellverhalten oder mögliche Implantatdesigns und Beschichtungen. Verkapselung von funktionellen Molekülen, wie morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2), von dem gezeigt wurde, um die Osteoblasten-Differenzierung 15,16 induzieren könnten weitere Verbesserung der Gewebezüchtung dieser Gerüste 10.

<table><tbody><tr><td>Polycaprolacton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethlyformamid</td><td>Fisher Chemical</td><td>D-119-1</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Fisher Chemical</td><td>AC61093-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cumarin 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546283</td><td></td></tr> aus <tr><td>Fett gewonnene Stammzellen</td><td>Zelltechnik Technologien</td><td>HMSC. AD-100</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceindiacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Modifiziertes Eagle's Medium</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>s25120a</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>VWR International, LLC</td><td>101412-842</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-831-200</td><td>Einzelspritze</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Branson</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungs-Gleichstromnetzteil</td><td>Gamma-Hochspannungsforschung</td><td>ES30</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>FEI</td><td>Nova 2300</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td></td></tr></tbody></table>

elektronanofasergerüste mit abstufungen in fiber-organisation

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

Das Ziel dieses Protokolls ist es, über eine einfache Methode zur Erzeugung von Nanofasergerüsten mit Abstufungen in der Faserorganisation zu berichten und ihre möglichen Anwendungen bei der Kontrolle der Zellmorphologie/-orientierung zu testen. Die Organisation der Nanofasern wird mit einer neuen Fertigungsvorrichtung gesteuert, die eine allmähliche Abnahme der Faserorganisation in einem Gerüst ermöglicht. Die Änderung der Ausrichtung der Fasern wird durch die Verringerung der Abscheidungszeit von zufällig elektrogesponnenen Fasern auf einer einachsig ausgerichteten Fasermatte erreicht. Durch die Abdeckung des Kollektors mit einer beweglichen Barriere/Maske, die sich auf der gleichen Achse wie bei der Faserabscheidung befindet, kann die Organisationsstruktur leicht gesteuert werden. Für die Gewebezüchtung können aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen auf diese Gerüste ausgesät werden. Stammzellen unterliegen aufgrund ihrer Position in der vielfältigen Organisationsstruktur morphologischen Veränderungen und können sich je nach Standort möglicherweise in verschiedene Zelltypen differenzieren. Darüber hinaus verbessert die abgestufte Organisation der Fasern die Biomimikry von Nanofasergerüsten, so dass sie den natürlichen Orientierungen von Kollagen-Nanofasern an der Ansatzstelle von Sehne und Knochen im Vergleich zu herkömmlichen Gerüsten ähnlicher sind. Durch die Nanoverkapselung bieten die gradierten Fasern auch die Möglichkeit, chemische Gradienten in Fasergerüsten zu konstruieren und damit ihre Anwendungsmöglichkeiten beim schnellen Screening der Zell-Material-Interaktion und der Regeneration von Grenzflächengewebe weiter zu stärken. Diese Technik ermöglicht die Herstellung von kontinuierlichen Gradientengerüsten, kann aber auch potenziell Fasern in diskreten Schritten produzieren, indem die Bewegung der beweglichen Barriere/Maske auf diskrete Weise gesteuert wird.

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde eine Fasermatte mit einer organisatorischen Gradienten gebildet. 3 zeigt die REM-Bilder an verschiedenen Stellen auf der Nanofaser-Gerüst entnommen. Qualitativ kann bestimmt werden, dass es einen Übergang von der uniaxial ausgerichteter Fasern mit einem 0 mm (3A) zu einer zufälligen Fasersortiment auf 6 mm (Figur 3D). Die FFT liefert einen quantitativen Wert auf die Faserausrichtung, Einzelheiten über die quantitativen Prozesse s...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Diese Herstellungstechnik ermöglicht die Produktion von Nanofasergeflechten mit einem Gradienten in der Organisation der Fasern. Eine gestufte Organisation bietet eine erhöhte Nützlichkeit von Nanofasergeflechten im biomedizinischen Bereich. Das Elektrospinnen bietet die Möglichkeit, fasrige Gerüste im Nanomaßstab mit großen Oberflächen herzustellen.Die Herstellung erfolgt durch Kombination eines Polymers mit einem flüchtigen Lösungsmittel, wobei diese Lösung mit konstanter Geschwindigkeit durch eine Spritze geleitet wird. Durch Anlegen einer Hochspannung werden die Lösung aufgeladen und das Polymer beim Austritt aus der Nadelspitze gestreckt. Das Ergebnis ist eine trockene polymerbasierte Nanofaser, die auf verschiedene Weisen für unterschiedliche Anwendungen gesammelt werden kann. In diesem Protokoll haben wir ein Polycaprolacton-Polymer auf einen Spaltkollektor aufgesponnen, um ein hochgradig ausgerichtetes Fasersubstrat zu erzeugen.Dann verwendeten wir eine allmählich bewegte Maske, um dieses Substrat abzudecken, während zufällige PCL-Fasern abgeschieden wurden. Hallo, mein Name ist Carl Kalala. Aus dem Labor von Dr. Xing.Wir sind am Department für Pharmazeutische Wissenschaften und am Holland Regenerative Medicine Programm am University of Nebraska Medical Center tätig. Heute werden wir die Anleitung zur Herstellung eines Nanofaserscaffolds mit organisatorischem Gradienten zeigen. Zusätzlich werden wir die biomedizinischen Anwendungen dieser Scaffolds mittels Nano-Einkapselung und Ansiedlung von Stammzellen demonstrieren.Zunächst sicherstellen, dass die richtige Schutzausrüstung getragen wird, wenn mit potenziell gefährlichen Chemikalien gearbeitet wird. Der erste Hauptschritt dieses Verfahrens besteht darin, eine Lösung von Polycaprolacton oder PCL mit einer ungefähren Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Das Polycaprolacton in einer Mischung aus Dichlormethan und Dimethylformamid im Volumenverhältnis vier zu eins für jeden jeweiligen Lösungsmittelanteil unter Erzielung einer Gesamtkonzentration von 10 % Gewicht pro Volumen für die Lösungsmischung auflösen, bis die Lösung durchscheinend und homogen mit einer geeigneten Viskosität ist.Geben Sie die PCL-Lösung in eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel. Bringen Sie eine einzelne Spritzenpumpe in vertikaler Elektrospinn-Position an, wobei der Kollektor direkt unterhalb der geerdeten Spritzenpumpe angeordnet ist. Stellen Sie sicher, dass der Kollektor separat geerdet ist und keinen Kontakt zu anderer Laborausrüstung hat.Stellen Sie für eine effiziente Faserausscheidung die Spritzenpumpe auf eine relativ hohe Flussrate ein, um die Nadel für das Elektrospinnen vorzubereiten. Betreiben Sie die Pumpe, bis sich an der Nadelspitze bildende Tropfen sofort ersetzt werden. Stellen Sie die Pumpe für das Elektrospinnen anschließend auf 0,5 Milliliter pro Stunde ein.Stellen Sie den Spannungsregler auf 12 Kilovolt ein. Vorsicht, da diese Hochspannung sehr gefährlich sein kann; vermeiden Sie jegliche Annäherung. Mit der Nadelspitze verwenden wir eine nichtleitende Verlängerung, um mögliche Verstopfungen oder Fremdfasern an der Nadelspitze oder am Kollektor zu beseitigen.Es sollten sich Fasern über die Lücke am Kollektor hinweg bilden. Setzen Sie das Elektrospinnen fort, bis ein relativ dicker Fasermattenverbund hergestellt wurde. Tragen Sie über der Lücke am Kollektor Klebstoff auf die Ränder einer kleinen Glasplatte auf.Die Plattendimensionen sollten etwas kleiner sein als der Spalt des Kollektors mit den ausgerichteten Fasern, damit das Gerüst effektiv entfernt wird. Entfernen Sie alle überflüssigen Fasern, die sich möglicherweise an der Vorderseite des Kollektors angesammelt haben. Dann stellen Sie den Kollektor auf das Glas, sodass die Fasermatte vollständigen Kontakt mit der Platte hat.Drücken Sie vorsichtig auf das Gerüst, um sicherzustellen, dass die Fasern direkt mit dem Klebstoff in Kontakt stehen. Lassen Sie das Gerüst stehen, bis der Klebstoff getrocknet ist. Sobald der Klebstoff getrocknet ist, schneiden Sie vorsichtig entlang der verklebten Ränder des Gerüsts, sodass ein Abschnitt des ausgerichteten Mates fest auf der Glasplatte verbleibt.Das Ergebnis sollte in etwa wie folgt aussehen, wobei das Faserscaffold an drei Seiten zur sekundären Abscheidung fixiert ist. Falls eine chemische Einschließung gewünscht ist, geben Sie Kumar und sechs hinzu. Geben Sie eine Konzentration von 1 % Gewicht pro Gewicht zur PCL-Lösung hinzu. Rühren Sie, bis die Lösung homogen ist und eine fluoreszierend grüne Farbe für die Gradientenpräparation aufweist.Platzieren Sie die zweite Spritzenpumpe senkrecht zur ersten Pumpe und zum Kollektor. Befestigen Sie eine Kunststoffmaske an der zweiten Spritzenpumpe und positionieren Sie sie etwa zwei Millimeter über dem Kollektor. Bereiten Sie die Nadel mit einer hohen Flussrate vor.Wenn sich Fasern oberhalb des Sammlers abzulagern beginnen, stellen Sie die horizontale Spritzenpumpe so ein, dass sie mit neun Millilitern pro Stunde oder einer ungefähren Bewegungsgeschwindigkeit von einem Millimeter pro Minute zieht. Während das Experiment fortschreitet, sollten immer mehr zufällige Fasern auf dem ausgerichteten Gerüst sichtbar werden. Farbstoffe wie Kumar und sechs verbessern diese visuelle Gradientendarstellung erheblich.Während die Fasern abgelagert werden, beginnen die Nanofasern außerhalb des gewünschten Bereichs des Sammlers abzulagern. Entfernen Sie diese Fasern mit einem nichtleitenden Stab, damit sie die elektrostatische Spinnung des Faserscaffolds nicht stören, bis die Maske fast vollständig vom Sammler abgefahren ist. Stellen Sie sicher, dass eine geringe Menge des ausgerichteten Faserscaffolds unter der Maske verbleibt.Das fertige Gerüst sollte deutlich erkennbare ausgerichtete und zufällig angeordnete Bestandteile aufweisen, die hier mit der grünen zufälligen Ablagerung und den weißen ausgerichteten Fasern dargestellt sind. Im Übergangsbereich des Gerüsts sollte ein gradueller Übergang von zufälliger zu uniaxialer Faseranordnung erkennbar sein. Führen Sie eine Standardzellkultur mit den abgeschiedenen Stammzellen durch. Dann säen Sie die Zellen auf die Fasergitter aus und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.Nach zwei Stunden Inkubation weitere Zellkultur auf die Faserscaffolds aufbringen, bis diese ausreichend mit Medium bedeckt sind. Anschließend zwei Proben jeweils drei und sieben Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dies sind Aufnahmen des Rasterelektronenmikroskops, die in zwei Millimeter-Schritten angefertigt wurden.Auf dem Gerüst. Es zeigt sich ein klarer Übergang von ausgerichteten zu zufällig angeordneten Fasern auf dem Gerüst. Die Muster nach vier Jahren schnellem Transfer bestätigen diesen Übergang, da das Muster bei null Millimetern eine Ausrichtung und das Muster bei sechs Millimetern eine zufällige Orientierung aus der Stammzellkultur anzeigt.Es wurden zwei Sätze fluoreszenzmikroskopischer Bilder aufgenommen. Beide zeigen unterschiedliche Zellorientierungen, die durch die Position der angesiedelten Zellen vermittelt werden. Auf dem Verbundgerüst.70 % der Zellen befinden sich innerhalb von 20 Grad zur Herstellungsachse, im Vergleich zu nur 20 % der Zellen im zufälligen Bereich des Gerüsts. Die Bildung eines chemischen Gradienten durch nano-Encapsulierung wird mittels fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen untersucht. Der Graph der Fluoreszenzintensität zeigt ein lineares Wachstum, was auf eine schrittweise Änderung der chemischen Konzentration durch das Gerüst hinweist.Chemikalien wie das knochenmorphogenetische Protein zwei können auf diese Weise verkapselt werden, um die osteoblastische Differenzierung für das Gewebeengineering zu fördern. Unser endgültiges Ziel ist die Entwicklung eines Gewebekonstrukts, das eine einzigartige Klasse von Gerüsten mit doppelten Gradienten in struktureller Organisation und Mineralgehalt kombiniert. Diese Kombination kann die native Sehnen-bis-Knochen-Einfügestelle vollständig nachbilden. Die Einbringung von D-Post-derivierten Stammzellen sollte eine verbesserte Reparatur von Rotatorenmanschettenverletzungen ermöglichen.Heute haben wir das Protokoll zur Herstellung eines Nanofaserscaffolds mit einem Gradienten in der organisatorischen Struktur vorgestellt und dessen potenzielle biomedizinische Anwendungen erläutert. Der kritischste Teil dieses Protokolls ist die zufällige sekundäre Abscheidung auf dem ausgerichteten Scaffold, um den organisatorischen Gradienten während der Gradientenpräparation zu erzeugen. Achten Sie sorgfältig auf die Nadelspitze und den Kollektor, und entfernen Sie jegliche Tropfen an der Nadelspitze oder überflüssige Fasern am Kollektor, um einen gleichmäßigen Scaffold zu gewährleisten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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