Lepr

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensfähige, lebende Inseln aus den diabetischen LEP R DB-Mäusen zu gewinnen und die Insulinsekretion aus den Beta-Zellen innerhalb der Inseln mittels Live-Cell-to-Photon-Bildgebung zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst Reagenzien wie die Enzymmischung zur Pankreasverdauung, das Kulturmedium zur Inselkultivierung und der extrazelluläre Puffer für den Zwei-Photonen-Assay vorbereitet werden. Anschließend wird der Bauch eines euthanasierten Mäuschens eröffnet und die Enzymmischung in das Pankreas injiziert, um das Organ aufzulösen.

Dann werden die Inseln vom pankreatischen Verdau getrennt und kultiviert. Schließlich wird die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um einzelne Insulin-Granulat-Fusionen aus Beta-Zellen innerhalb der Inseln abzubilden. Letztendlich wird dieses Protokoll Forschern helfen zu verstehen, wie die Insulinsekretion in Gesundheit und Krankheit reguliert wird.

Die wesentliche Verbesserung der Irisolationsmethode ist die Verwendung gemischter Enzyme, um die Ausbeute und Vitalität der Iris zu verbessern. Die Zwei-Photonen-Bildgebung ist derzeit die einzige Methode, um die Insulinsekretion aus mehreren Zellen innerhalb einer intakten Iris aufzuzeichnen. Um die Enzyme zur Isolation von Pankreasiris vorzubereiten, verdünnen Sie ein Gefäß mit fünf Milligramm Liase TL mit 26 Milliliter DMEM und stellen Sie die Kollagenase vom Typ vier in Hank’s-Puffer auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter her, ergänzt durch die folgenden gemischten Liase-TL- und Kollagenase-Lösungen.

Portionieren Sie das Enzymgemisch im Volumenverhältnis vier zu eins zu jeweils 2,5 Milliliter und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Um das RPMI-Isolationsmedium herzustellen, lösen Sie in einem großen kegelförmigen Kolben mit einem Liter Wasser bei Raumtemperatur eine Flasche RPMI 1 6 4 0-Pulver und ergänzen Sie mit zwei Gramm Natriumbicarbonat und 4,02 Gramm HEPES. Stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,4 ein, filtrieren, sterilisieren und lagern Sie bei vier Grad Celsius.

Stellen Sie das RPMI-Kulturmedium her, indem Sie 10 % FBS und 1 % Antibiotika zum RPMI-Isolationsmedium für die Zwei-Photonen-Bildgebung hinzufügen. Bereiten Sie einen natriumreichen extrazellulären Puffer mit den folgenden Reagenzien vor. Um den extrazellulären Farbstoff herzustellen, stellen Sie eine 8 mM-Stammlösung von SRB her, portionieren Sie den extrazellulären Puffer in kleine Röhrchen und lagern Sie bei −20 °C.

Um eine Arbeitskonzentration zu erhalten, frischen extrazellulären Puffer verwenden, um den SRB-Stock im Verhältnis 1 zu 10 zu verdünnen. Nachdem eine Maus getötet wurde und gemäß dem Textprotokoll der Körper der Maus gründlich mit 70 % Ethanol besprüht wurde, das Tier so positionieren, dass der Kopf zum Chirurgen zeigt und der Schwanz vom Chirurgen wegzeigt. Zwei lange seitliche Schnitte durch die Bauchhaut und das Peritoneum führen, um eine V-förmige Klappe zu bilden.

Ziehen Sie die Hautlasche nach oben, um die gesamte Bauchhöhle freizulegen. Legen Sie den Darm beiseite und halten Sie mit dem gefalteten Gewebe die Leber an Ort und Stelle, um den Ductus choledochus freizulegen. Befestigen Sie anschließend eine vaskuläre Klemme am Ambulus an der Duodenumwand, um zu verhindern, dass die injizierten Enzyme in das Duodenum gelangen.

Dies ist ein wichtiger Schritt, der darüber entscheidet, ob die Pankreasenzyme in den Pankreasgang, den Reflux oder die Injektionsstelle gelangen bzw. in das Duodenum übergehen. Verwenden Sie eine 31-Gauge-Nadel, um den Ductus choledochus nahe der Mündungsstelle des Ductus hepaticus communis und des Ductus cysticus zu kanülieren, und lassen Sie Platz für eine zweite Injektion. Falls die Bauchspeicheldrüse beim ersten Mal nicht durchspült wird, injizieren Sie langsam etwa zwei Milliliter kalte Enzymmischung in den Ductus choledochus der Maus.

Wenn sich die Klemme in der richtigen Position befindet, wird die Bauchspeicheldrüse schnell perfundiert. Sobald die Bauchspeicheldrüse perfundiert ist, entfernen Sie das Organ schnell, geben Sie es in ein Glasfläschchen und inkubieren Sie es etwa 19 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie nach der Inkubation den Verdauungsprozess, indem Sie etwa 20 Milliliter kaltes Isolationsmedium hinzufügen.

Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu lösen, und gießen Sie es durch ein normales Sieb mit einer Porengröße von einem Millimeter in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das Röhrchen mit Isolationsmedium auf und zentrifugieren Sie es bei 400 ×g und vier Grad Celsius für eine Minute. Geben Sie nach dem Abbrechen Isolationsmedium zum Palatum hinzu und lösen Sie es auf.

Überführen Sie die Suspension anschließend in zwei 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie ein zweites Mal. Nach dem Absaugen des Überstandes geben Sie je sechs Milliliter Dichtegradienten-Medium für die Zellseparation zu jedem Röhrchen hinzu und pipettieren oder vortexen Sie, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Fügen Sie dann vorsichtig etwa sechs Milliliter Isolationsmedium an der Wandung der Röhrchen oberhalb des Dichtegradienten-Mediums hinzu und zentrifugieren Sie bei 100 × g und 4 °C für 15 Minuten.

Entnehmen Sie nach dem Abbrechen die obere, mittlere und untere Schicht und sammeln Sie sie in drei getrennten Schalen. Anschließend isolieren Sie unter einem Stereomikroskop mit einer Pipette die Augen in den drei Schalen per Hand. Die Mehrzahl befindet sich in der mittleren Schicht, was der Erholung der Augen von der enzymatischen Verdauung dient.

Bereiten Sie Gruppen von 40 Augenlöchern in 25-Zentimeter-Petri-Schalen mit sechs Milliliter RPMI-Kulturmedium, das 10 Millimolar Glukose enthält, vor und kultivieren Sie sie zwei Tage lang. Wechseln Sie das Medium täglich, um eine Zwei-Photonen-Bildgebung als indirekten Test zur Messung der Insulinsekretion durchzuführen. Beginnen Sie mit der Vorinkubation der zweitägig kultivierten Augenlöcher in extrazellulärem Puffer mit drei Millimolar Glukose.

Tragen Sie 30 Minuten lang Fett auf die Mikroskopbühne auf, um ein Auslaufen der Lösung zu verhindern, und befestigen Sie die Wärmekontrollkammer mit einem Objektträger auf der Mikroskopbühne. Danach bedecken Sie die Kammer mit 500 µL extrazellulärem Puffer, der 0,8 mM SRB und verschiedene Glukosekonzentrationen enthält. Anschließend platzieren Sie das vorinkubierte Öhrchen in die Mitte der Kammer und fokussieren drei bis vier Zellschichten tief in das Öhrchen hinein.

Wo bei Nagetierinseln die Immunfärbung für Insulin zeigt, dass die meisten Zellen Beta-Zellen sind. Anschließend mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop und einem 60x-Ölimmersionsobjektiv einzelne exozytotische Ereignisse durch das plötzliche Auftreten eines kleinen fluoreszierenden Flecks identifizieren. Schließlich im Scan-Bild-Software ein Ereignis durch die schnelle Anstiegsphase des Fluoreszenzsignals über einem interessierenden Bereich bei einer Wildtyp-Maus bestätigen.

Etwa 200 Augenlöcher werden erwartet, wenn das in diesem Video demonstrierte Protokoll verwendet wird. Gesunde Augenlöcher erscheinen hell, rund und weisen eine glatte Begrenzung auf. Eine unterverdaute Isolationscharge weist gewöhnlich kleine und verschwommene Augenlöcher sowie an Augenlöchern angeheftete Asar-Zellen auf.

Während eine überverdaute Probe im Zweiphotonen-Assay als Reaktion auf Stimuli wie Glukose oder hohes Kalium weniger Poräole aufweist, dringt ein SRB in die Granula ein, was zur Entstehung eines plötzlichen fluoreszierenden Flecks von etwa 400 Nanometern Durchmesser führt. Innerhalb der aufgezeichneten Zeit werden alle Exo-Ereignisse als Reaktion auf den Reiz identifiziert sowie Ort der Ereignisse, Zeitpunkt des Auftretens, Dauer und Art der Fusion erfasst. Ereignisse wie „KISS“ und „Run“ oder vollständige Fusion werden charakterisiert und sind wertvoll zur Beurteilung möglicher Defekte in der Granulafusion bei Modellen des Typ-2-Diabetes.

Mithilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass der Defekt in diabetischen DB-DB-Augen die fehlende vollständige Granulafusion und keine Veränderung der Kinetik der einzelnen Granulafusion ist. Darüber hinaus ist der wichtigste Faktor, der die verminderte Insulinsekretion bei der Erkrankung beeinflusst, eine Verringerung der Anzahl ansprechender Zellen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der Pankreasperfusion und der Aktivierung von Augen ohne Funktion von linken RDB-Mäusen haben und in der Lage sein, die beiden Zungenassays durchzuführen, um die sekretorischen Reaktionen innerhalb intakter Inseln zu bewerten.