Name: Lepr Db Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Lernen Sie die Isolation von Langerhans-Inseln aus Lepr db Mäusen und die Live-Cell-Zweiphotonen-Mikroskopie zur Untersuchung der Insulinsekretion in Echtzeit. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die Pathophysiologie des Diabetes.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Australian Research Council Grant DP110100642 (an PT) und National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 und APP1059426 (an PT und HYG).

HINWEIS: Alle vorliegenden Experimenten wurden nach den örtlichen Tierethik Verfahren der University of Queensland (von der University of Queensland, Anatomisches Biosciences Ethikkommission genehmigt) durchgeführt. 1. Islet Isolation <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Enzymgemisch, <ol><li> Für die Pankreasverdauung, eine Mischung aus Liberase und Collagenase Typ IV. Verdünnen Liberase TL (Thermo niedrig) 1 Fläschchen 5 mg mit 26 ml DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium). </li><li> Vorbereitung Collagenase Typ IV in Hanks-Puffer bei einer Konzentration von 0,5 mg / ml, mit 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl 2, 0,1 mg / ml DNAse und 1 mg / ml Rinderserumalbumin. </li><li> Mischen den Liberase TL und Collagenase-Lösungen in einem Verhältnis von 4: 1 (nach Volumen), das heißt, 4 ml Liberase TL + 1 ml Kollagenase. Aliquot der Mischung von Enzymen zu jedem und bei -20 ° C 2,5 ml. HINWEIS: Die Gewebe Inkubationszeiten vary ein wenig zwischen den Chargen des Enzyms (30 sec bis 1 min-Differenz). Daher kann ein Batch-Test erforderlich. </li></ol></li><li> RPMI Isolation Medien <ol><li> Lösen Sie eine Phiole mit RPMI 1640-Pulver in 1 l Wasser bei Raumtemperatur und zu ergänzen, mit 2 g NaHCO 3, 4,02 g HEPES. </li><li> Kombinieren Sie die RPMI Isolationsmedien in einer großen Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührer mischen, auf pH 7,4 mit NaOH, Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Kulturmedien </li><li> Verwenden RPMI Kulturmedium, mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika (dh, Penicillin 100 U / ml, Streptomycin 100 ug / ml). </li></ol></li><li> Islet Isolation und Kultivierung <ol><li> Tieropfer <ol><li> Opfern Mäuse durch Genickbruch oder CO 2 Ersticken nach Ethik Verfahren der lokalen Institution. Sprühen Sie die Maus Körper gründlich mit 70% Ethanol. </li></ol></li><li> Pancreatic Perfusion <ol><li> Use 2 lange Schnitte seitlich durch die Bauchhaut und Bauchfell, um eine V-förmige Klappe zu machen. Ziehen Sie die Klappe der Haut bis zu den gesamten Bauchraum aufzudecken, beiseite den Darm und die Leber zu halten anstelle von einem gefalteten Seidenpapier, um den Gallengang zu offenbaren (Abbildungen 1 und 2). Setzen Sie das Tier, so dass der Kopf in Richtung der Chirurg und der Schwanz vom Chirurgen. </li><li> Anwenden einer Gefäßklemme an der Ampulle an der Wand, um den Zwölffingerdarm injiziert, Enzyme aus der Eingabe in das Duodenum (Figur 1) zu blockieren. Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, da sie bestimmt, ob die injizierten Enzyme werden in den Pankreasgang gehen und durchströmen die Bauchspeicheldrüse oder Rücklauf auf die Injektionsstelle (über Klemme) oder gehen Sie in den Zwölffingerdarm (unter Klemme). </li><li> Kanülieren den Gallengang mit einer 31 G-Nadel in der Nähe der Kreuzung der Ductus hepaticus und cysticus (Abbildung 1) und lassen Raum für eine zweite Injektion, wenn the Pankreas versagt, das erste Mal durchströmen. Langsam (~ 10 sec) zu injizieren etwa 2 ml kaltem Enzymgemisch in die Maus Gallengang. ANMERKUNG: Das Pankreas wird schnell perfundiert, wenn sich die Klammer in der richtigen Position ist. </li><li> Stellen Sie die Klemmposition, wenn die Nadel in den Gallengang, sondern kann die Bauchspeicheldrüse nicht Perfusion (dh., Nach oben die Klammer ein wenig weg von der Leber, wenn überspannt oder verschieben Sie sie ein wenig nach unten in die Leber, wenn im Rahmen eingespannt). HINWEIS: Die Nadel geht manchmal in die umgebende Kapsel eher als das Lumen der Leitung. Eine sinnvolle Zeichen zu überprüfen, ob die Nadel innerhalb der Gallengang ist die Erweiterung des Kanals bei der Injektion. Wenn die Bauchspeicheldrüse nicht zu durchströmen, ist eine Alternative die Enzymmischung konnte auf mehrere Standorte der Bauchspeicheldrüse mit geringeren Ausbeute erwartet injiziert werden. Die Perfusion der linken Seite der Bauchspeicheldrüse (Lobus Splenicus) ist wichtig für die Maximierung der Inselausbeute. </li><li> Nachdem der Bauchspeicheldrüse ist perfused, schnell die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, legen Sie sie in einem Fläschchen (~ 20 ml Glas) und Inkubation für ~ 19 min in einem 37 ° C Wasserbad. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann ein wenig abhängig von der Mausstamm und Alter variieren. </li><li> Nach der Inkubationszeit, stoppen die Verdauung durch Zugabe von ~ 20 ml kaltem Isolationsmedien. Schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu stören und gießen Sie sie durch eine normale Teesieb (Porendurchmesser von 1 mm) in ein steriles 50 ml Tube. Füllen Sie das Rohr mit Isolierung Medien und Zentrifuge bei 400 xg für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab. </li><li> Lösen Sie das Pellet in der Isolierung Medium erneut und übertragen, um zwei 15-ml-Röhrchen, dann bei 400 xg zentrifugieren für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab. Nach dem Absaugen der Überstand, mischen Sie die beiden Pellets auch mit 6 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium (Histopaque 1077 Lösung) pro Röhrchen durch Vortexen oder Auf-und Abpipettieren. Dann vorsichtig hinzu ~ 6 ml der Isolierungsmedien zur Seite des Rohres überDer Dichtegradient Trennmedien und zentrifugiert bei 100 g für 15 min bei 4 ° C mit Bremse ausgeschaltet. </li><li> Sammeln Sie den Überstand in der oberen (Isolationsmedien), mittleren und unteren (Dichtegradienten Zelltrennmedien) Schicht in 3 separate Küche. Interpreten Sie die Inseln in diesen 3 Gerichte, mit einer Pipette unter einem Binokular. HINWEIS: Die mittlere Schicht die meisten der Inseln enthält. Inseln werden als kompakte Strukturen von ~ 50 bis 500 um in der Größe (Figur 3) erkannt wird. Wir erhalten ~ 200 Inseln in WT-Mäusen und 300- &lt;100 Inseln in db / db-Mäusen. </li></ol></li><li> Islet Kultivierung <ol><li> Um die Inseln zu gewinnen aus dem Enzymverdau Kulturgruppen von 40 Inseln in einer 25 cm Petrischale mit 6 ml RPMI-Kulturmedium (10 mM Glukose) bei 37 ° C, 5% / 95% CO 2 / O 2 für 2 Tage vor der Live -Zelle 2-Photonen-Bildgebung. Ändern Sie den Kulturmedien täglich. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Live Cell 2-Photonen-Imaging <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Extrazelluläre Puffer <ol><li> Vorbereitung der extrazellulären Natriumpuffer für die 2-Photonen-Assay mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 und 10 mM HEPES. </li></ol></li><li> Extrazelluläre Dye <ol><li> Für die 2-Photonen-Test vorbereiten stock SRB 8 mM in extrazellulären Puffer, aliquoten in kleine Rohre und bei -20 ° C. Von der Stamm SRB 1:10 in frischem extrazellulären Puffer auf eine Arbeitskonzentration von 0,8 mm zu erhalten. </li></ol></li></ol></li><li> Photonen-Imaging <ol><li> Erste, vorge inkubieren 2 Tage kultivierte Inseln in 3 mM Glucose extrazelluläre Puffer für 30 min. HINWEIS: Wir verwenden Inselchen zwischen 2 und 5 Tagen in Kultur. </li><li> Dann legen Sie eine Objektträger auf die auf dem Mikroskoptisch montiert thermo-Steuerkammer. Verwenden Sie Fett auf das Austreten von Lösung zu verhindern. </li><li> Decken Sie die Kammer mit 500 ul extradere Puffer, enthaltend 0,8 mM SRB mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen (3 mm, 6 mm, 15 mm und 20 mM Glucose). </li><li> Als nächstes legen Sie die vorinkubierten kleine Insel in der Mitte der Kammer und konzentrieren sich auf 3-4 Zellschichten in der kleinen Insel, wo, in Nagetier Inselchen, Immunfärbung für Insulin zeigt, dass die meisten Zellen sind beta-Zellen. HINWEIS: Die SRB alle die Zellmembran der Insel schnell zu skizzieren und die kleine Insel ist bereit, image. </li><li> Verwenden Sie eine 2-Photonen-Mikroskop mit einem 60x Ölimmersionsobjektiv (NA 1,42) und Imaging-Software (z. B. scanimage 11). Abbildung 4 zeigt eine typische Anordnung Mikroskopie. Bild Exozytose-Ereignisse mit SRB als Membran impermeante Fluoreszenzextrazellulären Marker durch Femtosekundenlaserpulsen bei 880 nm angeregt, mit Fluoreszenz bei 550-650 nm detektiert. Notieren Sie die Antworten auf die Insel Stimulation. </li><li> Identifizieren Sie einzelne Exozytose-Ereignisse durch das plötzliche Erscheinen eines kleinen fluoreszierenden Flecks (Auflösung 10 Pixel /1, m) und bestätigen Sie mit der schnell ansteigenden Phase des Fluoreszenzsignals über einen Bereich von Interesse (~ 0,78 um 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der wichtigste Faktor für die Inselisolierung ist die anfängliche Durchblutung des Pankreas; ein unter perfundierten Pankreas führt zu einem erheblich niedrigeren Inselausbeute. Andere Faktoren, die auch Auswirkungen auf die Isolierung Qualität wie die Aufschlusszeit und der Höhe der Erschütterung, die teilweise für die Höhe der Durchblutung zu kompensieren könnte. Zum Beispiel wird ein voll durchströmten Bauchspeicheldrüse müssen bei 37 ° C für ~ 18 min 30 sec inkubiert werden unter leichtem Schütteln im Gegensatz eine...

Die Rolle der Betazelldysfunktion bei Krankheiten ist allgemein anerkannt, 3,4. Zelllinien, wie der MIN6 und INS-1 sind nützliche Werkzeuge, um die Biologie von Beta-Zell-Verhalten zu verstehen. Allerdings ist die physiologische Kontrolle der Insulinsekretion findet innerhalb der Langerhans-Inseln. Diese Inseln enthalten Tausenden eng gepackten Beta-Zellen, sowie Blutgefäße und anderen endokrinen Zelltypen. Diese Umgebung innerhalb des Insel beeinflusst Insulinsekretion und dürfte bei Diabetes wichtig. Um daher die physiologischen Kontrolle der Insulinsekretion und die Pathophysiologie der Erkrankung zu verstehen, ist es wichtig, intakte Inseln studieren. Inselisolierung Live menschlichen Inselchen und insbesondere menschlichen Inselzellen vom Typ 2-Diabetes-Patienten sind schwer zu bekommen. Darüber hinaus haben die menschliche Inselzellen begrenzte Möglichkeiten für experimentelle molekulare Manipulation. Forscher haben daher eingesetztekönnen aus Tieren und Tiermodellen des Typ 2 Diabetes. Ein solcher Krankheitsmodell ist der db / db-Maus. Dies ist eine spontane Mutation, die Models Typ-2-Diabetes mit einem Phänotyp Progression, die menschliche Krankheit 5,6 eng Parallelen. Die für die Inselisolierung aus diabetischen db / db Mäusen hier vorgestellten Protokoll hat viele Schritte gemeinsam mit anderen Gruppen mit einigen Verfeinerungen für bessere Ausbeute, Reinigung und verbesserte Insellebens. 2 Photonen-Imaging Die Live-cell 2-Photonen-Assay hier beschriebenen ermöglicht es Forschern, um die Anzahl zu quantifizieren und zu bewerten die Merkmale der einzelnen insulinhaltigen Granulat aus vielen Zellen der diabetischen 7 und Wildtyp-Inselchen 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td></td> <td>Roche-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>zur Herstellung von Isolationsmedien</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>zur Herstellung von kultivierten Medien</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>zur Herstellung von kultivierten Medien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>zur Herstellung von kultivierten Medien</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>zur Verdünnung der Liberase</td></tr><tr><td>Metamorph Programm</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>zur Analyse der 2-Photonen-Bilder</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; mausmodell des typ-2-diabetes: pancreatic islet isolation und live-cell 2-photonen-imaging von intakten inseln

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Typ 2-Diabetes ist eine chronische Krankheit, die 382 Millionen Menschen im Jahr 2013 und wird voraussichtlich bis zu 592 Mio. im Jahr 2035 1 steigen. In den letzten 2 Jahrzehnten die Rolle der Beta-Zell-Dysfunktion bei Typ 2 Diabetes wurde klar festgelegt 2. Forschung Fortschritte Methoden zur Isolierung von Langerhans-Inseln erforderlich. Das Protokoll der Inselisolierung hier präsentierten viele gemeinsame Schritte mit Protokollen von anderen Gruppen, mit einigen Änderungen, um die Ausbeute und Qualität der isolierten Inseln sowohl aus dem Wildtyp und diabetischen Lepr db (db / db) Mäusen zu verbessern. Ein Live-Zelle der 2-Photonen-Abbildungsverfahren wird dann präsentiert, die verwendet werden können, um die Kontrolle der Insulinsekretion in Inseln zu untersuchen.

Islet Ausbeute und Reinigung Für eine normale Wildtyp-Maus, werden etwa 200 kleine Inseln erwartet. Gesunde Inseln aussehen hell, rund geformt und haben einen glatten Rand. Eine Über verdaut Isolierung Charge hat in der Regel klein und Fuzzy-Inseln, während ein Unter verdaut Charge hat weniger kleine Inseln und Inselchen Azinuszelltumoren angebracht (Abbildung 3). Für diabetischen db / db-Mäuse, die kleine Insel Ausbeute und Aussehen abhängig von der Krankheitsprogression mi...

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensfähige, lebende Inseln aus den diabetischen LEP R DB-Mäusen zu gewinnen und die Insulinsekretion aus den Beta-Zellen innerhalb der Inseln mittels Live-Cell-to-Photon-Bildgebung zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst Reagenzien wie die Enzymmischung zur Pankreasverdauung, das Kulturmedium zur Inselkultivierung und der extrazelluläre Puffer für den Zwei-Photonen-Assay vorbereitet werden. Anschließend wird der Bauch eines euthanasierten Mäuschens eröffnet und die Enzymmischung in das Pankreas injiziert, um das Organ aufzulösen.Dann werden die Inseln vom pankreatischen Verdau getrennt und kultiviert. Schließlich wird die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um einzelne Insulin-Granulat-Fusionen aus Beta-Zellen innerhalb der Inseln abzubilden. Letztendlich wird dieses Protokoll Forschern helfen zu verstehen, wie die Insulinsekretion in Gesundheit und Krankheit reguliert wird.Die wesentliche Verbesserung der Irisolationsmethode ist die Verwendung gemischter Enzyme, um die Ausbeute und Vitalität der Iris zu verbessern. Die Zwei-Photonen-Bildgebung ist derzeit die einzige Methode, um die Insulinsekretion aus mehreren Zellen innerhalb einer intakten Iris aufzuzeichnen. Um die Enzyme zur Isolation von Pankreasiris vorzubereiten, verdünnen Sie ein Gefäß mit fünf Milligramm Liase TL mit 26 Milliliter DMEM und stellen Sie die Kollagenase vom Typ vier in Hank’s-Puffer auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter her, ergänzt durch die folgenden gemischten Liase-TL- und Kollagenase-Lösungen.Portionieren Sie das Enzymgemisch im Volumenverhältnis vier zu eins zu jeweils 2,5 Milliliter und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Um das RPMI-Isolationsmedium herzustellen, lösen Sie in einem großen kegelförmigen Kolben mit einem Liter Wasser bei Raumtemperatur eine Flasche RPMI 1 6 4 0-Pulver und ergänzen Sie mit zwei Gramm Natriumbicarbonat und 4,02 Gramm HEPES. Stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,4 ein, filtrieren, sterilisieren und lagern Sie bei vier Grad Celsius.Stellen Sie das RPMI-Kulturmedium her, indem Sie 10 % FBS und 1 % Antibiotika zum RPMI-Isolationsmedium für die Zwei-Photonen-Bildgebung hinzufügen. Bereiten Sie einen natriumreichen extrazellulären Puffer mit den folgenden Reagenzien vor. Um den extrazellulären Farbstoff herzustellen, stellen Sie eine 8 mM-Stammlösung von SRB her, portionieren Sie den extrazellulären Puffer in kleine Röhrchen und lagern Sie bei −20 °C.Um eine Arbeitskonzentration zu erhalten, frischen extrazellulären Puffer verwenden, um den SRB-Stock im Verhältnis 1 zu 10 zu verdünnen. Nachdem eine Maus getötet wurde und gemäß dem Textprotokoll der Körper der Maus gründlich mit 70 % Ethanol besprüht wurde, das Tier so positionieren, dass der Kopf zum Chirurgen zeigt und der Schwanz vom Chirurgen wegzeigt. Zwei lange seitliche Schnitte durch die Bauchhaut und das Peritoneum führen, um eine V-förmige Klappe zu bilden.Ziehen Sie die Hautlasche nach oben, um die gesamte Bauchhöhle freizulegen. Legen Sie den Darm beiseite und halten Sie mit dem gefalteten Gewebe die Leber an Ort und Stelle, um den Ductus choledochus freizulegen. Befestigen Sie anschließend eine vaskuläre Klemme am Ambulus an der Duodenumwand, um zu verhindern, dass die injizierten Enzyme in das Duodenum gelangen.Dies ist ein wichtiger Schritt, der darüber entscheidet, ob die Pankreasenzyme in den Pankreasgang, den Reflux oder die Injektionsstelle gelangen bzw. in das Duodenum übergehen. Verwenden Sie eine 31-Gauge-Nadel, um den Ductus choledochus nahe der Mündungsstelle des Ductus hepaticus communis und des Ductus cysticus zu kanülieren, und lassen Sie Platz für eine zweite Injektion. Falls die Bauchspeicheldrüse beim ersten Mal nicht durchspült wird, injizieren Sie langsam etwa zwei Milliliter kalte Enzymmischung in den Ductus choledochus der Maus.Wenn sich die Klemme in der richtigen Position befindet, wird die Bauchspeicheldrüse schnell perfundiert. Sobald die Bauchspeicheldrüse perfundiert ist, entfernen Sie das Organ schnell, geben Sie es in ein Glasfläschchen und inkubieren Sie es etwa 19 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie nach der Inkubation den Verdauungsprozess, indem Sie etwa 20 Milliliter kaltes Isolationsmedium hinzufügen.Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu lösen, und gießen Sie es durch ein normales Sieb mit einer Porengröße von einem Millimeter in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das Röhrchen mit Isolationsmedium auf und zentrifugieren Sie es bei 400 ×g und vier Grad Celsius für eine Minute. Geben Sie nach dem Abbrechen Isolationsmedium zum Palatum hinzu und lösen Sie es auf.Überführen Sie die Suspension anschließend in zwei 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie ein zweites Mal. Nach dem Absaugen des Überstandes geben Sie je sechs Milliliter Dichtegradienten-Medium für die Zellseparation zu jedem Röhrchen hinzu und pipettieren oder vortexen Sie, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Fügen Sie dann vorsichtig etwa sechs Milliliter Isolationsmedium an der Wandung der Röhrchen oberhalb des Dichtegradienten-Mediums hinzu und zentrifugieren Sie bei 100 × g und 4 °C für 15 Minuten.Entnehmen Sie nach dem Abbrechen die obere, mittlere und untere Schicht und sammeln Sie sie in drei getrennten Schalen. Anschließend isolieren Sie unter einem Stereomikroskop mit einer Pipette die Augen in den drei Schalen per Hand. Die Mehrzahl befindet sich in der mittleren Schicht, was der Erholung der Augen von der enzymatischen Verdauung dient.Bereiten Sie Gruppen von 40 Augenlöchern in 25-Zentimeter-Petri-Schalen mit sechs Milliliter RPMI-Kulturmedium, das 10 Millimolar Glukose enthält, vor und kultivieren Sie sie zwei Tage lang. Wechseln Sie das Medium täglich, um eine Zwei-Photonen-Bildgebung als indirekten Test zur Messung der Insulinsekretion durchzuführen. Beginnen Sie mit der Vorinkubation der zweitägig kultivierten Augenlöcher in extrazellulärem Puffer mit drei Millimolar Glukose.Tragen Sie 30 Minuten lang Fett auf die Mikroskopbühne auf, um ein Auslaufen der Lösung zu verhindern, und befestigen Sie die Wärmekontrollkammer mit einem Objektträger auf der Mikroskopbühne. Danach bedecken Sie die Kammer mit 500 µL extrazellulärem Puffer, der 0,8 mM SRB und verschiedene Glukosekonzentrationen enthält. Anschließend platzieren Sie das vorinkubierte Öhrchen in die Mitte der Kammer und fokussieren drei bis vier Zellschichten tief in das Öhrchen hinein.Wo bei Nagetierinseln die Immunfärbung für Insulin zeigt, dass die meisten Zellen Beta-Zellen sind. Anschließend mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop und einem 60x-Ölimmersionsobjektiv einzelne exozytotische Ereignisse durch das plötzliche Auftreten eines kleinen fluoreszierenden Flecks identifizieren. Schließlich im Scan-Bild-Software ein Ereignis durch die schnelle Anstiegsphase des Fluoreszenzsignals über einem interessierenden Bereich bei einer Wildtyp-Maus bestätigen.Etwa 200 Augenlöcher werden erwartet, wenn das in diesem Video demonstrierte Protokoll verwendet wird. Gesunde Augenlöcher erscheinen hell, rund und weisen eine glatte Begrenzung auf. Eine unterverdaute Isolationscharge weist gewöhnlich kleine und verschwommene Augenlöcher sowie an Augenlöchern angeheftete Asar-Zellen auf.Während eine überverdaute Probe im Zweiphotonen-Assay als Reaktion auf Stimuli wie Glukose oder hohes Kalium weniger Poräole aufweist, dringt ein SRB in die Granula ein, was zur Entstehung eines plötzlichen fluoreszierenden Flecks von etwa 400 Nanometern Durchmesser führt. Innerhalb der aufgezeichneten Zeit werden alle Exo-Ereignisse als Reaktion auf den Reiz identifiziert sowie Ort der Ereignisse, Zeitpunkt des Auftretens, Dauer und Art der Fusion erfasst. Ereignisse wie „KISS“ und „Run“ oder vollständige Fusion werden charakterisiert und sind wertvoll zur Beurteilung möglicher Defekte in der Granulafusion bei Modellen des Typ-2-Diabetes.Mithilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass der Defekt in diabetischen DB-DB-Augen die fehlende vollständige Granulafusion und keine Veränderung der Kinetik der einzelnen Granulafusion ist. Darüber hinaus ist der wichtigste Faktor, der die verminderte Insulinsekretion bei der Erkrankung beeinflusst, eine Verringerung der Anzahl ansprechender Zellen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der Pankreasperfusion und der Aktivierung von Augen ohne Funktion von linken RDB-Mäusen haben und in der Lage sein, die beiden Zungenassays durchzuführen, um die sekretorischen Reaktionen innerhalb intakter Inseln zu bewerten.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video beschreiben wir die intravitale Bildgebung einer Bauchspeicheldrüse einer Maus durch ein stabilisiertes Fenster zur Langzeitvisualisierung der zellulären Dynamik.

Intravitale Bildgebung: Eine Methode zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse der Maus auf zellulärer Ebene durch ein stabilisiertes Bildgebungsfenster

Dieses Video demonstriert eine bildgebende Methode zur Visualisierung transplantierter Luciferase-exprimierender Betazellen in einer nicht adipösen diabetischen immundefizienten Maus. Die Einführung von Splenozyten aus einer diabetischen Maus führt zu einer fortschreitenden Zerstörung der Betazelle, die visuell durch eine abnehmende Lumineszenz nach Substrateinführung bestätigt wird.

Bildgebung transgener Betazellen in einer immundefizienten Maus, die mit diabetischen Splenozyten konfrontiert war

Ein neuer Ansatz, der intraokularen Transplantation und konfokale Mikroskopie ermöglicht Längs-, non-invasive Bildgebung in Echtzeit mit Single-Cell Auflösung innerhalb gepfropft...

Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Wir beschreiben ein Protokoll für die Visualisierung von Insulin Exozytose in intakte Inseln mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein. Isolierte Inseln sind mit Adenoviren Codierung gekoppelt an die Vesikel Fracht Neuropeptid Y pHluorin infiziert. Dies ermöglicht für den Nachweis von Insulin Granulat Fusion Veranstaltungen konfokalen Mikroskopie.

Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Diese Studie präsentiert die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten auf die Untersuchung der Inselphysiologie und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Lernen Sie die Isolation von Langerhans-Inseln aus Lepr db Mäusen und die Live-Cell-Zweiphotonen-Mikroskopie zur Untersuchung der Insulinsekretion in Echtzeit. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die Pathophysiologie des Diabetes.

Lepr

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