Name: Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Leukozyten-Untergruppen im Tumor-Mikromilieu mittels Durchflusszytometrie in einem subkutanen Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Charakterisierung immunologischer Zellpopulationen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01-CA169354 unterstützt &#160; und R01-047822 &#160; von den National Institutes of Health und Merit Award aus dem Department of Veterans Affairs (EZB). RKP wurde vom NIH T32 CA009287-30A1, einem ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship, und ein American Cancer Society Mentorierte Forschung Scholar Grants unterstützt; BAZ wurde vom NIH Zuschusses AI079320 unterstützt. JM wurde von Stipendien von NIH T-32 Ausbildungsförderung T32-AI07290- 25. T32-AI07290-24 und American Cancer Society Post-Doc-Stipendium PF-12-052-01-CSM unterstützt.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Stanford, Palo Alto VA HCS und National Institutes of Health Institutional Animal und Verwenden Ausschuss Leitlinien. 1. Vorbereiten der Probengewinnung und Verarbeitung (Zeitaufwand: ~ 10-15 min) <ol><li> Inokulieren murine B16F0-Melanomzellen (0,5-1 x 10 6) subkutan an oder nahe der Mittellinie des Bauches in weibliche C57BL / 6-Mäusen, wie zuvor 6 beschrieben. Alternativ inokulieren Tumorzellen an zusätzlichen anatomischen Stellen (zB Flanke Brustfettpolster, etc.). HINWEIS: Eine beliebige Anzahl von Tumoren (implantiert oder spontane) verwendet und ausgewertet werden mit diesem Protokoll. Beispielsweise können andere häufig verwendete syngenen Tumoren in C57BL / 6 sind die Doppelpunkt Linie MC38, Lewis-Lungenkarzinom (LLC) und die Prostata TRAMP-C2 Linie. Während menschlichen Xenotransplantaten in immundefiziente Mäuse inokuliert können auch auf diese Weise ausgewertet werden, sei darauf hingewiesen, dass die profiles der Tumor-infiltrierenden Leukozyten wird notwendigerweise gemß der immundefiziente Zustand des Host-Maus verändert werden. <ol><li> Verwenden Sie Vollmedien (zB RPMI mit 10% FBS und Additive) oder einem anderen geeigneten Protein-Puffer (zB HBSS oder PBS + 1% FBS oder 1% BCS). Chill-Medien oder Puffer auf 4 ° C vor der Euthanasie. </li></ol></li><li> Up Sammelröhrchen und Filter für resezierten Tumoren gesetzt; legen diese auf Eis. <ol><li> Verwenden Sie eine 50 ml konischen Röhrchen pro Tumor reseziert werden. Legen Sie eine 40-70 um Zellsuspension Filter in jedem. Alternativ können Sie auch 15 ml konische Röhrchen mit Metallfiltergewebe. Verwenden Sie ein 5 ml Spritzenkolben oder dicken Stift, um einen becherförmigen Filter an der Spitze der 15-ml-Tube erstellen. </li></ol></li><li> Bereiten Instrumente zur Resektion und Tumor Verarbeitung; benutzen chirurgische Pinzette und einer feinen Schere zu resezieren und Prozess Tumoren. Verwenden Sie 70% Ethanol zu reinigen Instrumente zwischen Resektionen / Tumorproben. Für größere Zahl of Proben (zB&gt; 10), empfehlen wir die gleichzeitige Verarbeitung von Proben, die von mehreren Forschern, signifikante Unterschiede in der Verarbeitungszeit zwischen Tumorproben zu vermeiden. </li></ol> 2. Tumorentfernung (Zeitaufwand: ca. 5 min / Tumor) <ol><li> Euthanize B16 tumortragenden Mäusen einzeln mit Kohlendioxid oder einem anderen zugelassenen Verfahren. </li><li> Sichern Sie die Maus auf eine chirurgische Bühne. Sprühen Sie den Tumorbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie überschüssiges aus; dies hilft, die Verbreitung von gegenwärtigen Haare zu verhindern. Für Nicht-Nacktmäusen, Rasur die Haut Gebiet rund um den Tumor vor der Resektion nach Bedarf. </li><li> Mit einer Pinzette und Schere, Resektion des subkutanen Tumor en bloc, einschließlich darüber liegenden und der umgebenden Haut. Die Höhe der &quot;margin&quot; Haut aufgenommen variiert werden kann, aber in der Regel 2-3 mm reseziert der Haut um den Tumor. <ol><li> Wiegen resezierten Tumoren (+/- umgebende Haut) an dieser Stelle. Legen Sie die reseziert Haut / Tumorbereich im Filter im pl gesichertastic konischen Rohr. </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung einer einzelnen Zelle Tumor Suspension (Zeitaufwand: ~ 5-7 min / Tumor) <ol><li> Verwenden einer Pinzette und Schere, um Tumor und darüberliegenden / umgebende Haut Blatt vor den Mund. Mince die Probe mit einer Schere, bis alle großen Teilen von Gewebe werden in 1-2 mm Abschnitte verarbeitet. Hinweis: In der Regel ganze Tumoren verarbeitet werden; Alternativ kann für größere Tumore, repräsentativen Schnitten von Tumoren konnte zerkleinert und verarbeitet werden. </li><li> Verwendung eines Kolbens aus einem Wegwerf 5 oder 10 ml-Spritze, mechanisch disaggregiert des zerkleinerten Tumorgewebe gegenüber dem gesicherten Filter. </li><li> Mit einer Pipette, waschen Sie die verarbeitet Tumorgewebe mit 5-10 ml kaltem Medium oder Puffer. Dadurch werden die einzelnen Zellen durch den Filter zu spülen. </li><li> Wiederholen der obigen zwei Schritte mehrmals, so dass die Gesamtanzahl und die Mengen der Wasch etwa gleich sind für ähnlich großen Tumoren. <ol><li> Nach dem Waschen der verarbeiteten Tumorgewebe beobachtenkleine Fragmente von Haut und / oder anderes Bindegewebe, sollte bei dem Filter verbleiben. </li><li> Alternativ für Tumore, bei denen mechanische Disaggregation allein nicht ausreichend sein, die Verdauung mit Collagenase und / oder andere Enzyme können vor dem Zerkleinerungsverfahren durchgeführt werden. Dies wird für eine gründlichere Einzelzellsuspension zu ermöglichen. Es sollte jedoch angemerkt, dass derartige Verdauung Protokolle können Oberflächenantigen-Expression 20 beeinflussen, so dass Vorsicht ist bei der Interpretation dieser Ergebnisse gemacht werden kann. </li></ol></li><li> Waschen und Pellet die Zellen durch Zugabe von Medien / Puffer und Zentrifugation bei 4 ° C 500 xg für 5 min. </li></ol> 4. FACS Färbung der Einzelzellsuspension (Zeitaufwand: ~ 30-60 min) <ol><li> Die Zellen in eiskaltem FACS-Puffer (PBS + 1% FBS). </li><li> Graf lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Hämozytometer oder automatisierten Zellzählers. </li><li> Bestimmen Sie die Gesamtkeimzellausbeute pro Volumen. Diese Daten können verwendet werden, um zu extrapolierenabsolute Zahlen tumorinfiltrierender Leukozyten in Kombination mit FACS-Daten. </li><li> Bestimmen der Anzahl von Zellen, gefärbt und durch FACS analysiert. Dies wird durch verschiedene Faktoren (zB Tumorhistologie Typ, Tumor Alter und Größe, durchschnittliche Prozentsatz der infiltrierenden Leukozyten, etc.) beeinflusst werden. HINWEIS: In B16 Melanom, fanden wir einen geringen Prozentsatz an Tumor-infiltrierenden Leukozyten (TIL, typischerweise &lt;5%) im Vergleich zu Tumorzellen. Somit sind zumindest 1 x 10 6 gesamt (Tumor infiltrierenden Leukozyten +) Zellen wurden typischerweise über FACS zur Analyse gesammelt. <ol><li> Mit Hilfe der Trypanblau gefärbten Zähldaten, um berechnete Volumen von Zellen für FACS gefärbt werden. Wenn zum Beispiel TIL machen typischerweise 5% der Gesamttumorzellen (viele der Tumorzellen tot auf Trypanblau-Färbung sein kann), um Faktor dieses in der Gesamtzahl der Tumoreinzelzellsuspension gefärbt. </li><li> Für weniger häufig Leukozytenuntergruppen zB CCR9 + PDC) verwenden, eine größere Anzahl von insgesamt Tumorzellen (Beispiel 2-3 x 10 6) für die FACS-Färbung, angesichts der relativ geringen Häufigkeit dieser Zellen in der Einzelzellsuspension. </li></ol></li><li> Färben Sie das Tumoreinzelzellsuspension für FACS. <ol><li> Für Live / Dead-Diskriminierung, verwenden Sie eine fixierbare Fleck oder nicht feststellbar Fleck (zB Propidiumiodid) verwendet werden. Wenn Zellen ohne Live / Dead Diskriminierung gebeizt, muss Vorsicht geboten gegeben werden das Potenzial für nicht-spezifische Bindung von Antikörpern. </li><li> Flecken auf der Zellsuspension für spezifische Leukozyten-Untergruppen mit einem Standard-FACS-Färbung Protokoll. Block-Zellen auf nicht-spezifische Antikörperbindung mit PBS / FBS, das 1% Rattenserum und Fc Block (anti-CD16 / 32) für 10 Minuten vor der Antigen-spezifische Antikörper-Färbung zu vermindern. Fügen Sie die richtigen Isotypenkontrolle Antikörper, um sicherzustellen, Färbung spezifisch ist. </li><li> An diesem Punkt, nachdem der FACS-Färbung abgeschlossen ist, zu fixieren Proben mit 4% Formaldehyd oder ähnliche Fixiermittel. Proben bei 4 ° C in der dark (wie zum Abschrecken der Fluorophore zu vermeiden) werden bis zur Sammlung und Analyse. HINWEIS: Speichern fester Proben für lange Zeiträume kann zu einer Veränderung in der Signalstärke und der Fluorophore 21 führen. </li><li> Sammeln Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer. Optimale Durchflusszytometer Einstellungen werden je nach Art des Instruments und Laser / Detektor-Setup ändern. HINWEIS: Zusätzlich kann es Variabilität zwischen Experimenten auch bei Verwendung der gleichen Maschine sein. So führen Sie die entsprechenden Maschineneinrichtung (zB mit der Kalibrierung Perlen) eine angemessene Entschädigung Einstellung vor der FACS Sammlung und Analyse von jedem Versuch zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Analyse leukoctye Teilmengen <ol><li> Mit FACS Datenanalyse-Software, die Daten zu analysieren. Für eine lebend / tot-Färbung, starten durch Gating aus toten Zellen. Verwenden Sie Antikörpers gegen ein Leukozyten-spezifischer Marker (zB Anti-CD45) auf Leukozyten innerhalb der lebenden Zellen zu identifizieren. <ol><li> Danach verwenden verschiedene gating Systemen an bestimmte Untergruppen zu identifizieren, in Abhängigkeit von dem Färbungsprotokoll. Um beispielsweise CD4 + T-Zellen zu identifizieren, wählen Sie die SSC lo Region aus der CD45 + Population und wählen Sie die CD19-CD3 + Zellen; aus dieser CD4 + T-Zellen identifiziert werden, 22. </li></ol></li><li> Analysieren von Daten und präsentieren sie in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, um die Konsistenz zu gewährleisten und bestimmte Muster oder Trends (dh, Gesamtzahlen, Prozentsätze oder Verhältnisse auf Teilmengen zu quantifizieren). HINWEIS: Zum Beispiel haben wir uns mit Gesamtlebend CD45 + Zellen in Prozent der Gesamttumorzellen gesammelt (Abbildung 1). Zusätzlich haben wir dann den prozentualen Anteil der einzelnen Leukozyten-Untergruppe (beispielsweise CD4 + T-Zellen) innerhalb des Tumors berechnet und diese als Verhältnisse zwischen den Kontroll- und Testgruppen (Abbildung 3). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Darstellende detaillierte Analyse der Tumor-Mikroumgebung ist kritisch bei der Bestimmung der Mechanismen und Wirkungen der Immunmodulation. Mit der zunehmenden Anwesenheit von Immuntherapeutika in der menschlichen klinischen Bereich, das Verständnis der Auswirkungen dieser Mittel auf die Tumor-infiltrierenden Leukozyten immer erforderliche in ihrem Wirkmechanismus definieren. Beim Menschen gibt oft existieren klinische und / oder logistischen Schwierigkeiten bei der Beschaffung und Analyse von Tumorgewebe für die Leuko...

Die Balance zwischen Tumorwachstum und die Förderung und Regression ist, teilweise abhängig von der Balance zwischen pro- und anti-Tumor-infiltrierenden in der Mikroumgebung 1,2 vorhanden Leukozyten. Um die Tumorumgebung zu studieren (TME) und spezifisch identifizieren infiltrierenden Leukozyten-Subpopulationen, ein Verfahren zur Auswertung von subkutanen Tumoren entwickelten wir in einem Mäusetumormodell. Die Bedeutung der Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung ist gut bekannt und in der Literatur gestützt. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Gleichgewicht von pro- und anti-Tumor-infiltrierenden Immunzellen können die Ergebnisse der das Tumorwachstum nicht nur in der Maus, sondern auch Studien am Menschen (in 3,4 prüft) auswirken. B. Curiel et al. Zeigten, dass verschlechterten klinischen Ergebnisse bei Eierstockkrebspatienten wurden mit der Anwesenheit von steigenden Prozent tumorinfiltrierender regulatorischen CD4 + T-Zellen (Treg) 5 korreliert. Unsere eigene Arbeit zeigte auch die Wirkung eines nichtvel Leukozyten Chemolockstoff auf dem Verhältnis der Leukozyten-Untergruppen in einem Maus-Melanom-Modell 6, die ebenfalls korreliert mit verringerten Tumorwachstum. Somit werden die detaillierten Analysen der Leukozyten-Untergruppen innerhalb eines Tumors nun allgemein anerkannt und mehr an Bedeutung. Es gibt viele Möglichkeiten, um die Tumor-Mikroumgebung für das infiltrierende Leukozyten zu bewerten; zB Gruppen transgenen Mäusen entwickelt, um verschiedene fluoreszierende Proteine, um Bild die TME 7, klassische Immunhistochemie und Immunfluoreszenz der erhaltenen Abschnitte 8, einschließlich der verschiedenen bildgebenden Verfahren wie MRI, PET, konfokale Mikroskopie 9-11 Ausdruck bringen - einige mit der Möglichkeit, intravital 10,12 überwachen. Diese können mit verschiedenen molekularen Bildgebungsmittel, wie Nanopartikel 13 oder neuartige Kontrastmittel 14, die Immunzellen Etikett verwendet werden. Unsere Methode ist eine Durchflusszytometrie-basierten Ansatz und hat mehrere Vorteile.Erstens kann der gesamte Tumor-Mikro abgetastet werden; bei der Analyse wird das gesamte subkutane Tumor und dem umgebenden Peripherie operativ zum Verarbeiten reseziert. Dies beseitigt jegliche potentiell Abtasten Bias innerhalb eines einzigen Tumor und gibt eine &quot;globale&quot; Analyse des Tumors als Ganzes. Zweitens, mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie, um die Leukozyten-Untergruppen analysieren, ermöglicht es uns, genauer zu messen den Phänotyp infiltrieren Leukozyten. Abhängig von der Anzahl der verwendeten Farben können sehr spezifische Untergruppen identifiziert werden. Dies ist wichtig, da es mehrere Leukozyten-Untergruppen in einem bestimmten Zelltyp - oder gar in einem allgemeinen Untertyp Klassifizierung - die unterschiedlichen Funktionen, die bei der Bestimmung des Schicksals des Tumors potenziell signifikante sind zu haben. Zum Beispiel haben plasmacytoid dendritischen Zellen (PDC) in Tumorimmunität 15 in Verbindung gebracht. Jedoch ist die CCR9 + Untergruppe von pDCs wurde gezeigt tolerogenen 16 sein, und Verschieben des baLanze einer solchen Untergruppe kann einen Einfluss auf das Tumorwachstum. Unsere Methode ist für die subkutane oder andere Tumoren, die en bloc reseziert werden können, geeignet. In unseren Händen, wurden Tumoren einheitlich zum Zeitpunkt der Euthanasie reseziert. Jedoch ist es denkbar, wie in einigen Studien durchgeführt worden, daß eine subkutane Tumor konnte vollständig Verschluss der umgebenden Haut in einem Überlebens Operation 17 reseziert werden, was eine zusätzliche Auswertung des Tieres. Die Analyse wird dann an der resezierten Tumorgeführt. So sind die Ergebnisse stellen einen einzigen Zeitpunkt in der Entwicklung des Tumors. Während dies ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Mikroumgebung, es ist auch ein statisches Bild von dem, was ist ohne Zweifel ein dynamischer Prozess. Jedoch isolierten Leukozyten (zB über magnetische Trennung oder Dichtegradientenzentrifugation) können dann separat von der Tumor Epithel und Stroma analysiert werden, oder in anderen, funktionelle Assays verwendet werden, um ihr Erscheinungsbild weiter zu definieren, wie bereits Previ hatlaufend beschrieben 18. Dieses Verfahren wäre dann nützlich irgendeinem Forscher interessiert die Analyse der Zusammensetzung der Leukozyten innerhalb der Tumormikroumgebung zu einem gegebenen Zeitpunkt zu sein, ob die Einstellung des natürlichen Krankheitsverlaufs oder nach einer bestimmten therapeutischen Störung. Obwohl nicht von uns durchgeführt, könnte Variationen dieses Verfahrens möglicherweise auch verwendet, um bestimmte Abschnitte eines Tumors in Isolation zu analysieren. Beispielsweise in Anbetracht der Größe des Tumors, die Randzone (n) kann von der zentralen, ggf. nekrotischen Kern des Tumors präpariert eine räumlich getrennte Ansicht der Tumor-Mikroumgebung, die Forscher zu ergeben. In dem aufstrebenden Gebiet der Tumorimmunologie, gibt es keinen Zweifel, eine exponentiell wachsende Anzahl von Studien zur Bewertung neuartiger immunmodulatorischer Wirkstoffe in murinen Tumormodellen sein. Mehrere Berichte haben die Unterschiede in bestimmten Leukozyten-Funktion innerhalb des Tumors gegenüber dem peripheren en hervorgehobenUmwelt. Beispielsweise Shafer-Weaver et al. Zeigten, in einem Mausmodell, das Antigen-spezifischen T-Effektorzellen CD8 + Zellen, während in der Peripherie aktiv, wurden in CD8 + T-Suppressor-Zellen umgewandelt werden, wenn sie in die Tumorumgebung 19 verschleppt. Dies war teilweise auf TGFß, aber andere Faktoren sind wahrscheinlich ebenso beteiligt. Somit Auswerten Leukozytenuntergruppen - Zahlen und Verhältnisse sowie Funktionszustand - im Tumor selbst wird eine genauere Darstellung der Wirkung eines bestimmten Immunmodulation auf Tumor Schicksal. Unsere Technik erlaubt eine detaillierte Analyse des Tumors und stellt dem Forscher die Möglichkeit, Veränderungen in der Leukozyten-Populationen als frühere Ansätze genauer identifizieren.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>http://cellgro.com</td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>40 &#956; m filter</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>5 ml Spritze</td><td>BD</td><td>14-823-35</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>chirurgische Schere/Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>roboz.com</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-030-CM</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Cellgro</td><td>MT-25-900-CI</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Hausser Scientifice&nbsp;</td><td>02-671-54&nbsp;</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>Lebende/tote Flecken</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td>lieftechnologies.com</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>TreeStar, Inc</td><td></td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

bewertung der tumor-infiltrierenden leukozyten-untergruppen in einer subkutanen tumormodell

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Spezialisierten Immunzellen, die Tumorumgebung infiltrieren regulieren das Wachstum und Überleben von Neoplasie. Maligne Zellen müssen entziehen oder zu untergraben Anti-Tumor-Immunantwort, um zu überleben und zu gedeihen. Tumoren profitieren Sie von einer Reihe von verschiedenen Mechanismen der Immun &quot;Escape&quot;, einschließlich der Rekrutierung von tolerogenen DC, immunsuppressive regulatorischen T-Zellen (Tregs) und myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), die zytotoxische Antitumor-Reaktionen hemmen. Umgekehrt können Anti-Tumor-Effektor Immunzellen das Wachstum und die Ausdehnung von malignen Erkrankungen verlangsamen: immunstimulatorische dendritische Zellen, natürliche Killerzellen, die angeborenen Tumorimmunität beherbergen, und zytotoxischen T-Zellen alle in der Tumorsuppression beteiligt. Die Balance zwischen pro- und anti-Tumor-Leukozyten letztlich bestimmt das Verhalten und das Schicksal der transformierten Zellen; eine Vielzahl von klinischen Studien am Menschen haben dies getragen heraus. Somit detaillierte Analyse Leukozytenuntergruppen innerhalbder Tumor-Mikroumgebung ist zunehmend wichtig geworden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Analyse infiltrierenden Leukozyten im Tumormikromilieu in einem Maus-Tumormodell vorhandenen Teilmengen. Maus-B16-Melanomtumorzellen wurden subkutan in C57BL / 6-Mäuse inokuliert. Zu einem bestimmten Zeitpunkt, wurden Tumoren und der umgebenden Haut en bloc reseziert und in Einzelzellsuspensionen, die dann für die Multi-Farb wurden Durchflusszytometrie verarbeitet. Mit einer Vielzahl von Leukozyten-Untergruppe Marker, konnten wir die relativen Prozentsätze der zu infiltrieren Leukozyten-Untergruppen zwischen Kontrolle und Chemerin-exprimierenden Tumoren zu vergleichen. Forscher kann ein solches Werkzeug zu verwenden, um die Immun Anwesenheit im Tumor-Mikroumgebung und als mit herkömmlichen Sattelgrößenmessungen von Tumorwachstum in Verbindung, wird möglicherweise damit sie die Auswirkungen von Veränderungen der Immunzusammensetzung auf das Tumorwachstum zu erhellen studieren. Eine solche Technik kann auf jede Tumormodell angewendet werden, in dem der Tumor und seiner Mikro cein reseziert und verarbeitet werden.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression von Chemerin in murine B16-Tumoren gezwungen Augmented den Prozentsatz an Tumor-infiltrierenden Leukozyten (TILs). Zusätzlich Änderungen des relativen Verhältnisses der Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung Chemerin Expression assoziiert dargestellt wurden identifiziert. Re-Print mit Erlaubnis von Pachynski et al. 6. 1 zeigt, dass es eine signifikante Zunahme der gesamten CD45 + Zellen (T...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur detaillierten Bewertung von Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung in einem Maustumormodell. Chemerin-exprimierende B16-Melanomzellen wurden subkutan in syngene Mäuse implantiert. Zellen aus der Tumormikroumgebung wurden dann gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, was eine detaillierte Analyse der Leukozyten-Untergruppe ermöglichte.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine detaillierte Analyse der infiltrierenden Leukozyten in einem murinen subkutanen Tumormodell durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst murine B16-F0-Melanomzellen von weiblichen C57BL/6-Mäusen inoculiert werden, um das Tumorwachstum in vivo zu etablieren. Anschließend werden die mit B16-Tumoren belasteten Mäuse euthanasiert und der subkutane Tumor en bloc reseziert, einschließlich der darüberliegenden und umgebenden Haut.Anschließend wird eine Einzelzell-Suspension aus Tumorzellen und tumorinfiltrierenden Leukozyten isoliert, die dann mittels Durchflusszytometrie analysiert werden kann. Schließlich wird die Anzahl lebensfähiger Zellen pro Volumen bestimmt und die Zahl der Zellen berechnet, die zur Analyse mittels FACS gefärbt und untersucht werden sollen. Letztendlich dient die Durchflusszytometrie dazu, die Häufigkeit und die Art von Leukozyten-Teilpopulationen im Tumormikromilieu darzustellen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie oder Diagnose von Krebs, da man die Wirkungen einer Therapie auf die Leukozyten im Tumormikromilieu bewerten kann. Es ist das Gleichgewicht zwischen Effektor- und Suppressorzellen, das hilft zu bestimmen, ob der Tumor wächst oder regressiert. Um das Tumorwachstum zu induzieren, impfen Sie murine B16F0-Melanomzellen subkutan in einem physiologischen Puffer, wie beispielsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung, entlang oder nahe der Bauchmitte bei weiblichen C57BL/6-Mäusen gemäß dem Textprotokoll ein. Sieben bis 14 Tage später, unmittelbar vor der Tumorresektion, bereiten Sie je einen 50-Milliliter-Konischkolben pro Tumor vor und stellen ihn auf Eis.Bringen Sie einen Zellfiltersuspensionsfilter mit einer Porenweite von 40 bis 70 Mikron in jedes Röhrchen ein. Bereiten Sie chirurgische Pinzetten vor und besorgen Sie eine Schere zur Resektion sowie 70 %igen Ethanol zur Reinigung der Instrumente zwischen den Tumorproben, nachdem eine B16-Tumorträgermaus gemäß dem Textprotokoll euthanasiert wurde. Sichern Sie die Maus auf einem chirurgischen Präparierrahmen, besprühen Sie den Tumorbereich mit 70 %igem Ethanol und wischen Sie überschüssiges Haar ab, um eine Verbreitung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass der topisch aufgetragene Ethanol vollständig abgewischt und verdunstet ist, bevor Sie den Tumor mithilfe von Pinzette und Schere resektieren. Entfernen Sie den subkutanen Tumor im Block, einschließlich der darüberliegenden Haut und etwa zwei bis drei Millimeter umgebender Haut.Wiegen Sie die resezierten Tumoren mit und ohne umgebende Haut und geben Sie jeden Abschnitt in ein Filter in einem kegelförmigen Reagenzglas. Um eine Einzelzell-Tumor-Suspension herzustellen, zerkleinern Sie den Tumor sowie die darüberliegende und umgebende Haut mithilfe von Pinzette und Schere, bis alle größeren Gewebestücke in Abschnitte von ein bis zwei Millimetern Länge zerkleinert sind. Danach dispergieren Sie das zerkleinerte Tumorgewebe mechanisch, indem Sie es mit einem Stößel einer Einwegspritze mit fünf oder 10 Milliliter Volumen gegen das fixierte Filter drücken.Danach mit einer Pipette fünf bis 10 Milliliter kaltes Medium oder Puffer auf das verarbeitete Tumorgewebe geben, um es zu waschen. Dadurch werden die Einzelzellen durch den Filter gespült.Wiederholen Sie die Disaggregations- und Waschschritte mehrmals, wobei die Gesamtanzahl und die Volumina der Waschungen für ähnlich große Tumore ungefähr gleich sein sollten. Nach dem Waschen des Gewebes überprüfen Sie, ob kleine Fragmente von Haut und/oder anderes Bindegewebe im Filter zurückbleiben. Um die Zellen zu waschen und als Pellet abzuzentrifugieren, geben Sie Medium hinzu und zentrifugieren bei 500 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Für die FACS-Analyse verwenden Sie eiskalte FACS-Pufferlösung, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen.Danach mit Trypanblau und einem Hämozytometer die lebensfähigen Zellen zählen, um die Gesamtanzahl lebensfähiger Zellen pro Volumeneinheit zu bestimmen, die zur Extrapolation der absoluten Zahlen tumorinfiltrierender Leukozyten oder TIL in Kombination mit FACS verwendet wird. Aus den Zählwerten der mit Trypanblau gefärbten Probe berechnen Sie das Zellvolumen, das für die Färbung mittels FACS benötigt wird. Wenn beispielsweise TIL typischerweise 5 % der Gesamtanzahl der Tumorzellen ausmachen, berücksichtigen Sie dies bei der Gesamtanzahl der in Suspension vorliegenden Tumorzellen, die gefärbt werden sollen.Um die Zellen für die Unterscheidung von lebenden und toten Zellen zu färben, verwenden Sie eine fixierbare oder nicht fixierbare Färbung wie Propidiumiodid. Anschließend blockieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit FBS in PBS, ergänzt mit 1 % Rattenserum und FC-Block, bevor Sie eine Standard-Immunfärbung durchführen, um die Zellsuspension für spezifische Leukozyten-Subpopulationen zu markieren.Nach der Färbung die Proben mit 4 % Paraformaldehyd fixieren und bis zur Sammlung und Analyse bei vier Grad Celsius im Dunkeln lagern. Die Proben mithilfe eines Durchflusszytometers unter Verwendung von Fakten sammeln. Die Datenanalyse-Software beginnt damit, tote Zellen auszuschließen, und identifiziert anschließend mithilfe eines Antikörpers gegen einen Leukozyten-spezifischen Marker wie anti-CD45 die Leukozyten innerhalb der lebenden Zellen.Verwenden Sie anschließend verschiedene Gating-Strategien, um spezifische Zellsubpopulationen gemäß dem Textprotokoll zu identifizieren. Analysieren Sie die Daten und stellen Sie sie auf verschiedene Weisen dar, um Konsistenz sicherzustellen und Muster oder Trends wie hier gezeigt zu erkennen. Die erzwungene Überexpression von kein in murinen B16-Tumoren, die am Tag 17 entfernt wurden, führte in dieser Abbildung, basierend auf Immunfluoreszenz an kryoseziierten B16-Tumoren, im Vergleich zu Kontrollen zu einem signifikanten Anstieg der gesamten CD45-positiven Zellen.Es wurde eine Zunahme infiltrierender CD45-positiver Zellen aus Tumoren bestätigt. Eine weitere Analyse der Fax-Daten zeigt eine relative Zunahme im Durchschnitt von NK-Zellen, T-Zellen und konventionellen CD11c-positiven dendritischen Zellen. In den Tumoren, in denen kein überexprimiert war im Vergleich zu den Kontrolltumoren, war ebenfalls eine relative Abnahme des Prozentsatzes an immununterdrückenden Leukozyten festzustellen, einschließlich myeloisch abgeleiteter Suppressorzellen und plasmazytoider dendritischer Zellen.Studien haben gezeigt, dass das Verhältnis von Leukozyten-Subpopulationen innerhalb des Tumors ein wichtiger Faktor hinsichtlich Tumorwachstum und klinischer Ergebnisse sein kann. In Übereinstimmung damit waren die Anzahlen von CD-drei-positiven T-Zellen und NK-Zellen pro Tumor in den kein-exprimierenden Tumoren im Vergleich zu Kontrollen stärker vertreten. Diese Abbildung zeigt, dass bei einem direkten Vergleich der Effektor- und Suppressorzellpopulationen innerhalb des Tumormikromilieus signifikante Zunahmen der Verhältnisse von Effektor- zu Suppressorzellpopulationen in den kein-exprimierenden Tumoren erkennbar waren. Im Vergleich zu Kontrollen folgen Sie diesem Verfahren.Andere Methoden wie die Zellsortierung oder die Zellisolierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Funktionalität tumorinfiltrierender Leukozyten zu beantworten.

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Research

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Medicine

Medizin

In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von hochreinem Populationen von Leukozyten, die Tumore infiltrieren. Dieses Protokoll wird aus der Miltenyi Biotech-Protokoll geeignet ist, Ausbeute und Reinheit zur Isolierung von Zellen aus komplexen Tumorgewebe zu verbessern.

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle nicht-enzymatische Dissoziation von frischen menschlichen Gewebefragmenten zur qualitativen und quantitativen Beurteilung von CD45+ Zellen (Lymphozyten/Leukozyten), die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorhanden sind. Zusätzlich kann der aus dem primären Gewebehomogenat gewonnene Überstand gesammelt und für weitere Analysen oder Experimente gelagert werden.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

Hier beschreiben wir eine Methode zum Trennen und Bestandteil der Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebung in etablierte subkutane Tumoren zu bereichern. Diese Technik ermöglicht die separate Analyse der Tumor immun infiltrieren und nicht-immunen Tumor Fraktionen die umfassende Charakterisierung der Tumor immun Mikroumgebung ermöglichen können.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.

Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

Es wird ein Standardprotokoll beschrieben, um die Antitumoraktivität und die damit verbundene Toxizität von IL-1α in einem syngenen Mausmodell von HNSCC zu untersuchen.

Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln

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Diese Arbeit konzentriert sich auf die in vivo subkutane Induktion von lumineszierenden kolorektalen Karzinomzellen in einem Mausmodell und die anschließende Lumineszenzmessung mit Hilfe eines bildgebenden Systems. Das Verfahren zielt darauf ab, ein reproduzierbares Tumorwachstumsmodell für das Echtzeit-Monitoring und die therapeutische Bewertung zu etablieren.

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Mit dem wachsenden Interesse an intratumoraler Immuntherapie ist es unerlässlich, Tumormodelle auszuwählen, die zugänglich und praktisch sind. Subkutane Tumore sind leicht zu etablieren, aber schwer zu visualisieren und zu manipulieren. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von intradermalen Tumoren, die eine verbesserte Sichtbarkeit und Zugänglichkeit bieten.

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Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

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