Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein 3D-Tissue-Engineering-Modell des menschlichen Ösophagepithels für die Verwendung als experimentelle Plattform herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst normale humane Fibroblasten und Epithelzellen der Speiseröhre aus menschlichen Gewebeproben der Speiseröhre isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die Fibroblasten auf ein deepitheliales azelluläres Gerüst, ein Porenzeichen und ein Speiseröhrengerüst ausgesät und sieben Tage lang kultiviert.

Als nächstes wird das Gerüst umgedreht und die isolierten humanen Epithelzellen der Speiseröhre werden für vier Tage in die Kultur gegeben. Im letzten Schritt wird das Modell für weitere fünf Tage an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gebracht, wodurch sich ein reifes geschichtetes Epithel entwickeln kann. Letztendlich wird die Immunhistochemie verwendet, um Schlüsselmarker für Proliferation und Differenzierung zu charakterisieren, die von den Modellepithelzellen exprimiert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen 2D-Zellkulturen besteht darin, dass sie es den Zellen ermöglicht, die Zell-, Zell- und Zellmatrix-Interaktionen zu haben, die sie in vivo haben würden. Und mit dieser Technik können wir ein reifes, geschichtetes Plattenepithel herstellen, das der normalen Speiseröhre ähnelt. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aus drei Gründen Schwierigkeiten haben.

Erstens kann es eine Herausforderung sein, sicherzustellen, dass sich die Mehrheit der Epithelzellen nicht differenziert, bevor sie in das Gerüst aufgenommen werden. Zweitens muss darauf geachtet werden, dass während der Reifezeit des Epithels die richtige Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche bereitgestellt wird. Und drittens kann es eine Herausforderung sein, die Stabilität während der gesamten Kulturperiode aufrechtzuerhalten.

Um menschliche Epithelzellen der Speiseröhre zu isolieren, legen Sie das entnommene Plattenepithelgewebe der Speiseröhre in eine sterile Petrischale und schneiden Sie das Gewebe mit einem ethanolsterilisierten Skalpell in 0,5 Zentimeter große Streifen. Dann inkubieren Sie das Gewebe in 0,1 % Tryin bedeckt bei 37 Grad Celsius und stoppen Sie die Verdauung nach einer Stunde mit fünf Millilitern FCS. Halten Sie dann die Streifen mit einer Pinzette fest und kratzen Sie die Epitheloberfläche vorsichtig mit der Skalpellklinge für ein bis zwei Minuten pro Streifen, um die Epithelzellen in das umgebende Medium zu entfernen. Wenn alle Streifen abgekratzt wurden, übertragen Sie das Medium mit den abgelösten Epithelzellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, entsorgen Sie die Senna und resuspendieren Sie das Pellet in 12 Millilitern Epithelmedium. Entsorgen Sie dann das Medium aus einer Fesselzellkultur und verwenden Sie eine sterile Pipette, um die Epithelzellen auf den Feederzellen zu plattieren, um die menschlichen Fibroblasten der Speiseröhre zu isolieren. Übertragen Sie die geschabten Gewebestreifen in eine sterile Petrischale und zerkleinern Sie das Gewebe abschließend mit dem Skalpell.

Verdauen Sie die Stücke in 10 Millilitern 0,5%iger Kollagenase, einer Lösung, die bei 37 Grad Celsius und 5%Kohlendioxid bedeckt ist, mit einer befeuchteten Atmosphäre über Nacht. Am nächsten Tag geben Sie den Aufschluss in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schleudern die Zellen herunter. Reanimation, die den Gaumen in 10 Millilitern Fibroblastenkulturmedium suspendiert.

Die Kultur in einem T 75-Kolben in einem Zellkultur-Inkubator. Um die dezellularisierten Schweineösophagusgerüste vorzubereiten, beginnen Sie damit, mit einer Schere und einer Pinzette einen Schweineösophagus in Längsrichtung aufzuschneiden. Waschen Sie anschließend die Speiseröhre in einem sterilen 180-Milliliter-Topf mit 100 Millilitern sterilem PBS für 10 Minuten unter leichtem Schütteln, um alle Rückstände des Tages zu entfernen, während das Gewebe gespült wird.

Sprühen Sie ein Kork-Präparierbrett mit 70%igem Ethanol auf, wenn der Korken in der Speiseröhre trocken ist, mit der Schleimhautseite nach oben. Fassen Sie nun mit einer sterilen Pinzette die Schleimhautoberfläche an einem Ende der Speiseröhre an und ziehen Sie das Gewebe von der Platte weg, um die Schleimhaut von der darunter liegenden Submukosa zu trennen. Präparieren Sie dann mit einer sterilen Skalpellklinge die Speiseröhre in Längsrichtung entlang der Lanarpropria und entfernen Sie die Stifte, während die Dissektion fortschreitet, damit die Schleimhaut angehoben werden kann.

Entsorgen Sie die darunterliegende Submukosa und schneiden Sie die verbleibende Schleimhaut mit einem Skalpell in fünf Zentimeter große quadratische Stücke. Waschen Sie die Stücke in 150 Millilitern sterilem PBS unter leichtem Rühren, wie gerade gezeigt. Nach fünf Minuten wird das Gewebe in einen 180-Milliliter-Topf mit 150 Millilitern einer molaren Natriumchloridlösung umgefüllt.

Ergänzt mit Antibiotika bei 37 Grad. Nach 72 Stunden überführen Sie das Gewebe in 150 Milliliter steriles PBS, woraufhin das Epithel begonnen hat, sich sichtbar vom darunter liegenden Gewebe zu lösen. Verwenden Sie eine sterile Pinzette und eine Skalpellklinge, um das ablösende Epithel zu entfernen, und legen Sie das restliche Gewebe in einen frischen Topf mit 150 Millilitern sterilem PBS mit drei fünfminütigen Waschgängen unter sanftem Rühren, das Gewebe muss nun mindestens vier Monate in Glycerin gelagert werden.

Um das Gerüst vollständig zu sterilisieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung des Ösophagusschleimhautmodells, indem Sie Stücke von Schweinegerüsten rehydrieren, die mindestens vier Monate lang in Glycerin sterilisiert wurden. In 100 Millilitern sterilem PBS für fünf, 10 Minuten Rühren. Ersetzen Sie das Supinat bei jeder Wäsche durch frisches PBS.

Nach dem fünften Rührtest die Sterilität des Gerüsts mit einer Inkubation über Nacht in 100 Millilitern DMEM bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen werden die Gerüste mit der submukösen Seite nach oben in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte überführt. Legen Sie dann einen sterilen Ring aus medizinischem Edelstahl auf die Mitte jedes Gerüsts und drücken Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig auf die Ringe, um eine ausreichende Abdichtung mit dem Gewebe zu gewährleisten.

Zentrieren Sie die fünf humanen Fibroblasten der Speiseröhre in 0,2 Millilitern Fibroblastenmedium in der Mitte jedes Rings. Fluten Sie dann den Bereich um die Außenseite des Rings mit mindestens zwei weiteren Millilitern Fibroblastenmedium und inkubieren Sie die Gerüste in einem Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie nach 24 Stunden die Ringe und ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch mindestens fünf Milliliter frische Fibroblasten.

Mittel, wobei darauf geachtet wird, dass die Gerüste vollständig eingetaucht sind. Entsorgen Sie nach einer Woche das Medium und verwenden Sie eine Pinzette, um die Schleimhautoberfläche des Gerüsts mit der Vorderseite nach oben umzudrehen. Setzen Sie die Ringe wieder auf die Gerüste und fügen Sie dann ein Zeitzentrum der sechs Epithelzellen in 0,2 Millilitern Verbundmedium hinzu, eines in die Mitte jedes Rings.

Verstopfen Sie den Bereich außerhalb des Rings mit etwa zwei Millilitern Verbundmedium eins und geben Sie die Konstrukte wieder in den Inkubator zurück. Entfernen Sie nach 24 Stunden die Ringe und ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch mindestens fünf Milliliter frisches Verbundmedium, eins, und stellen Sie sicher, dass die Gerüste vollständig untergetaucht sind. Ersetzen Sie das Medium nach weiteren 24 Stunden durch mindestens fünf Milliliter Kompositmedium. Zwei.

Platzieren Sie am vierten Tag sterile Netzgitter aus medizinischem Edelstahl in den Vertiefungen einer neuen Sechs-Well-Platte und übertragen Sie die Konstrukte mit der Schleimhautseite nach oben auf die Gitter. Fügen Sie schließlich genügend Verbundmedium drei hinzu, um die Unterseite des Komposits zu erreichen, während die Oberfläche der Luft ausgesetzt bleibt, um sicherzustellen, dass die Probe an einer Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit gehalten wird. Der kniffligste Teil des Verfahrens ist die Einrichtung der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche.

Wenn nicht klar ist, ob sich das Gitter in Flüssigkeit befindet, berühren Sie es mit einer sterilen Rohrspitze, da es leichter zu erkennen ist, ob das Rohr untergetaucht ist. Alternativ können Sie versuchen, die Platte vorsichtig zu schaukeln, da die Flüssigkeit leichter zu sehen ist, wenn sie sich bewegt, und überprüfen, ob sich Flüssigkeit auf dem Gitter befindet und Ihre Probe nicht bedeckt. Dies, die logische Beurteilung des Epithels, stellt ein reifes, mehrschichtiges, geschichtetes Plattenepithel dar, ähnlich, aber dünner wie das, das bei der normalen menschlichen Speiseröhre beobachtet wird, wobei die Zellen zunehmend flacher und schließlich zu einem Kern werden, wenn sie zur Oberfläche wandern.

Die immunhistochemische Charakterisierung der Schlüsselmarker für Proliferation und Differenzierung zeigt, dass die Mikroanatomie des Modellepithels der des normalen menschlichen Ösophagepithels ähnelt. Zum Beispiel wird eine vergleichbare Cytokeratin-14-Expression sowohl in der nativen Speiseröhre als auch im Modellepithel beobachtet, wobei die Färbung auf die Zellen in der Basalschicht beschränkt ist. Dieses Modell wurde erfolgreich modifiziert, um Tumorzellen einzubeziehen, indem die primären Epithelzellen durch Karzinomzellen ersetzt wurden, was die Flexibilität des Modells demonstriert.

Zum Beispiel produzieren Plattenepithelzellen ein Epithel, das auf dem Konstrukt als definierte gelbe Region mit großen Spalten innerhalb des Epithels sichtbar ist, was wahrscheinlich das Vorhandensein von dysfunktionalen Cellia-Molekülen, einschließlich Adenokarzinomzellen der Speiseröhre, widerspiegelt. Das Modell führt zu einer großen Menge an Gerüstabbau, der für das Auge als Ausdünnung des Gerüsts sichtbar ist. Nach zweiwöchigem Wachstum an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, das in der h- und e-Analyse als offensichtliche Verringerung der Dicke des Gerüsts im Bereich unterhalb der Zellen bestätigt wurde. Nach diesem Verfahren können andere Methoden der Genexpression wie Northern oder Western Blotting auf dasselbe Gewebe angewendet werden, um Fragen zu beantworten wie: Wie reagiert das Epithel auf Umwelteinflüsse? Dies bietet also eine wirklich wertvolle Ressource, um nach seiner Entwicklung weitere Fragen eingehender zu betrachten.

Diese Technik ebnete Forschern, die sich für die Barrett-Metaplasie interessierten, den Weg, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber spezifischen Refluxkomponenten auf die Genexpression in der normalen menschlichen Speiseröhre zu untersuchen.