Name: HPLC-Messung der DNA-Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2-Desoxyguanosin, in kultivierten Zellen und tierischen Geweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Lernen Sie die HPLC-ED-Methode zur Quantifizierung von 8-oxo-dGuo als DNA-Oxidationsbiomarker in kultivierten Zellen und tierischen Geweben. Dieses Protokoll minimiert artefaktuelle Oxidation während der Probenaufbereitung.

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Diese Arbeit wurde von der Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) und der kanadischen Regulierungsstrategie für die Biotechnologie (CRSB) gefördert. Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

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<li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice%3A+A+model+for+studying+mutations+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li>
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Es wurden keine Interessenkonflikte oder konkurrierende finanzielle Interessen erklärt.

Obwohl 8-oxo-dGuo wurde als nützlicher Biomarker von DNA-Oxidation berichtet, kann seine zuverlässige Quantifizierung eine Herausforderung darstellen. Obwohl mehrere veröffentlichte Verfahren existieren, gibt es einen Bedarf für eine umfassende, beschreibende Übersicht der Protokoll den Forschern ermöglichen, das Verfahren in ihren Laboratorien bereitstellen. Hier präsentieren wir Ihnen einen detaillierten Überblick über eine HPLC-basiertes Protokoll, das neue Benutzer erlauben, ein wirksames Verfahren für 8-oxo-dGuo Na...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS), dessen stationäre Ebenen können während viele pathologische Zustände und xenotoxic Stoffwechsel zu erhöhen, tragen zu einer erhöhten Häufigkeit der oxidative DNA-Schäden. Unter mehreren möglichen Nukleobasen Oxidationsprodukte können oxidative DNA-Schädigung leicht unter Verwendung der stabilen Marker gemessen werden 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo), die eine der oxidierten Formen 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ist das am häufigsten vorkommende DNA-Läsion 2, und deshalb wurde auf größerem Detail als DNA Oxidations Biomarker trotz der Existenz von mehreren DNA-Oxidationsprodukte 3 untersucht. Beim Menschen kann dieser Schaden über Basenexzisionsreparatur von 8-Oxoguanin Glycosylase 1 (hOGG1) 4 repariert werden. Wenn unbe unrepaired können 8-oxo-dGuo zur Bildung von Basenpaar-Substitutionsmutationen (dh G-Trans V) beitragen 4. Wichtig ist, dass 8-oxo-dGuo ein etablierter Marker for DNA-Schaden in Bezug auf die Initiierung und Förderung der Karzinogenese 2. Daher genaue Quantifizierung von 8-oxo-dGuo ist eine nützliche und wünschenswerte Biomarker für oxidativen DNA-Schädigung 5. Es gibt weit verbreitete Verwirrung in der Literatur über den richtigen Namen für oxidativ beschädigte Formen der 2-Desoxyguanosin und darüber hinaus der richtige Name der Verbindung (en) routinemäßig als Biomarker für oxidative DNA-Schäden 6 gemessen. Die 6,8-Diketo-und 6-Enol, 8-keto tautomeren Formen der 8-oxo-dGuo (in 1 gezeigt), sind die beiden wichtigsten Tautomere in der Literatur diskutiert 5,7. Der 6,8-Diketo-Form ist das Hauptproblem bei einem physiologischen pH-Wert von 7,4 und ist das bekannteste DNA Oxidationsprodukt 7. Deshalb 8-oxo-dGuo ist nicht 8-Hydroxy-dGuo die am besten geeignete Namen für diese Oxidationsprodukt 6. Es ist auch wichtig zu beachten, dass 2-Desoxyguanosin (dGuo) anstatt nucleobase Guanin (Gua) oder Ribonukleosid Guanosin (Guo) verbunden sind, wird von den meisten Verfahren 6 erfaßt. Genaue Detektion und Quantifizierung von 8-oxo-dGuo ist schwierig aufgrund: i) Schwankungen bei der Verdauung der DNA-Probe, ii) Eine zufällige Oxidation dGuo bis 8-oxo-dGuo, die während der Probenvorbereitung erfolgen kann, und iii) die Notwendigkeit für eine effektive Überprüfung der analytischen HPLC-ED Methode 8. In diesem Protokoll zur Erreichung i) durch das Bereitstellen von Bedingungen, günstig für vollständige DNA-Verdauung und ii) durch die Aufnahme Metallchelatbildner und Chelator-behandelten Lösungen und einer speziellen DNA-Isolierung Reagenz, während iii) nur teilweise durch die Aufnahme von adressierten gerichtet wir positive Kontrollen und somit vorausgesetzt, daß die Methode zum Aufspüren von 8-oxo-dGuo in biologischen Proben ist. Weitere Bestätigung über den Rahmen dieses Dokuments. Wir sind jedoch zuversichtlich, dass dieses Protokoll wird den Interessenten helfenBenutzer bestimmen, in welchem ​​Ausmaß die sie benötigen, um das Protokoll formal validieren, abhängig von ihren Zwecken. Eine Liste der Schritte für die formale Validierung des Verfahrens erforderlich ist ferner vorgesehen. Während der Entwicklung und Bereitstellung eines Verfahrens zur 8-oxo-dGuo Erkennung, veröffentlicht wurden Methoden überprüft und konsolidiert. Somit beseitigt dieses Verfahren die Notwendigkeit, Informationen aus verschiedenen veröffentlichten Quellen, die oft fehlen wichtige experimentelle Details während sie auch eine schnelle und einfache Methode zur Messung, wenn das Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von 8-oxo-dGuo wurde erfolgreich angenommen sammeln. Diese angepasste Verfahren wurde eingesetzt, um DNA-Proben erfolgreich analysieren aus kultivierten Zellen und murinen Gewebe. Dieses Video Artikel werden andere Gruppen die Schaffung eines wirksamen Verfahrens zur sicheren Erkennung und Quantifizierung von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED unterstützen.

<table><tbody><tr><td>8-Oxo-dGuo-Standard</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>Fälschlicherweise als "8-Hydroxy-2'-desoxy Guanosin" bezeichnet; siehe Abb. 1 und Text für Details.</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>Aus E. coli</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Chelate Schwermetalle</td></tr><tr><td>Desferoxamin Mesylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>Dibasisches Natriumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>DNA aus Lachsspermien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>Natriumsalz</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>TypII, aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Die Verbindung löst sich erst vollständig auf, wenn der pH-Wert der Lösung auf 8,0 (z. B. mit NaOH)</td></tr><tr><td>F12-K Medien</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Vorsäule</td><td>Chromatographische Spezialitäten</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>Schützt die Säule vor Kontamination; kann auch zu Druckaufbau führen</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>Phosphodiesterase-I-Enzym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>Typ II aus Crotalus adamaneus Gift</td></tr><tr><td>Teflon-Homogenisator</td><td>Thomas Scientific</td><td>7724T-1 oder 7724T-5 für 1 bzw. 5 mL, bzw. Das</td><td>Volumen (Haltekapazität) hängt von der Menge der zu verarbeitenden Probe ab.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>YMC-BASIC Säule mit gebundener sphärischer Kieselsäure</td><td>Chromatographische Spezialitäten</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

hplc-messung der dna-oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-desoxyguanosin, in kultivierten zellen und tierischen geweben

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidativer Stress ist mit vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie auch Fremdstoffmetabolismus assoziiert, was zur Oxidation von Biomakromolekülen, einschließlich DNA. Daher ist eine effiziente Detektion von DNA-Oxidation wichtig für eine Vielzahl von Forschungsbereichen, einschließlich der Medizin und Toxikologie. Eine gemeinsame Biomarker oxidativ geschädigten DNA 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo; oft fälschlicherweise bezeichnet als 8-Hydroxy-2&#39;-Deoxyguanosin (8-OH-dGuo oder 8 oxo-dG)). Mehrere Protokolle für 8-oxo-dGuo Messung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ED) sind beschrieben worden. Diese wurden jedoch in erster Linie um gereinigte DNA mit Prooxidantien behandelt angewendet. Darüber hinaus aufgrund methodischer Unterschiede zwischen Labors, vor allem aufgrund der Unterschiede in Analysegeräten, die Annahme von veröffentlichten Verfahren zum Nachweis von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED erfordert eine sorgfältige Optimierung von jedem Labor. EINumfassendes Protokoll, wie einen Optimierungsprozess beschreiben, fehlt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Erfassung von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED aus kultivierten Zellen oder tierische Gewebe beschrieben, in DNA. Sie veranschaulicht, wie die DNA-Aufreinigung kann leicht und schnell optimiert, um unerwünschte DNA-Oxidation, die während der Probenvorbereitung erfolgen kann minimiert werden. Dieses Protokoll zeigt, wie zu erkennen 8-oxo-dGuo in kultivierten menschlichen alveolaren Adenokarzinomzellen (dh, A549-Zellen) mit dem Oxidationsmittel KBrO 3 behandelt und aus der Milz von Mäusen, die polycyclische aromatische Kohlenwasserstoff Dibenzo (DEF, p) ausgesetzt Chrysen (DBC, früher bekannt als Dibenzo (a, l) pyren bekannt, DALP). Insgesamt zeigt diese Arbeit, wie ein HPLC-ED-Methodik kann leicht für die Erfassung von 8-oxo-dGuo in biologischen Proben zu optimieren.

dGuo wurde beobachtet, dass eine Retentionszeit von 4,7 min wohin 8-oxo-dGuo hatte eine Retentionszeit von etwa 6,4 min (2A und B). Es gibt etwa 1000-facher Unterschied in den Peakhöhen der beiden Analyten, wie in 2C zu sehen. Voltammogramme für 8-oxo-dGuo und dGuo wurden durch Ausführen von Standards bei einer Arbeitsspannung im Bereich von 0,2 bis 1,1 V. erhaltene optimale Arbeitspotential für 8-oxo-dGuo bestimmt wurde auf +0,5 V und +0,9 betragen V für dGuo (...

Das Ziel des Protokolls ist die Detektion der DNA-Oxidation Marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo) durch HPLC-ED, in DNA aus kultivierten Zellen oder tierische Gewebe.

HPLC-Messung der DNA-Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-Desoxyguanosin, in kultivierten Zellen und tierischen Geweben

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das DNA-Oxidationsprodukt 8-OXO-dG in biologischen Proben mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ED) nachzuweisen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem eine DNA-Probe aus biologischem Material isoliert und anschließend vollständig verdaut wird, wobei unerwünschte DNA-Oxidationen, die während der Probenvorbereitung auftreten können, durch Zugabe eines Metallchelators und eines speziellen DNA-Isolierungsreagenz minimiert werden. Danach werden die HPLC-ED-Laufbedingungen optimiert und Standardkurven für 8-OXO-dG sowie für 2'-desoxyguanosin erstellt.Der letzte Schritt besteht darin, verdautes DNA in Serie mit reinem acht OD DG und zwei Prime Desoxyguanin über HPLC laufen zu lassen, um die Verhältnisse von acht OD DG zu zwei Prime Desoxyguanin in den untersuchten verdauten DNA-Proben zu ermitteln. Letztendlich wird die Detektion und Quantifizierung von acht OD DG mittels H-P-L-C-E-D verwendet, um das Ausmaß der DNA-Oxidation in biologischen Proben zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren liegt darin, dass sie alle relevanten Informa

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zum quantitativen Nachweis oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen mittels ELISA-Technologie.

Quantifizierung des 8-Oxo-dG-Gehalts mittels ELISA-Assay zur Bewertung oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen

Zeit Kurse für die glycosylase Aktivität von 8-oxoguanine DNA glycosylase sind zweiphasige ausstellenden ein Platzen der Produkt-Bildung und einer linearen steady-state-Phase. Verwendung Quench-Flow-Techniken, die platzen und die Steady-State-Raten gemessen werden können, die Exzision von 8-oxoguanine und Freisetzung des glycosylase DNA aus dem Produkt entsprechen.

Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität

DNA-Origami ist eine leistungsfähige Methode zur Herstellung präziser nanoskaliger Objekte durch Programmierung der Selbstorganisation von DNA-Molekülen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Faltung eines bioresponsiven Roboters aus DNA-Origami, seine Aufreinigung und Negativfärbung für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare Methode dar, die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) verwendet, um den Purinstoffwechsel an chronischen lymphatischen Leukämie (CLL)-Zellen zu messen, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.

HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

Ein Protokoll zur Vermeidung der Oxidation von metallischen Substraten während des Probentransfers von einer inhibierten sauren Lösung zu einem Röntgen-Photoelektronenspektrometer wird vorgestellt.

Die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Corrosion Inhibitor / Metal-Schnittstellen mit XPS: Minimierung Beitrag Tauch Oxidation

Wir beschreiben den Prozess der Herstellung und Prüfung von photonischen Thermometer.

Herstellung und Prüfung von photonischen Thermometer

Das vorliegende Verfahren dient der Isoform-spezifische Inhibitoren der Histon Deacetylases (HDAC) in HeLa-Zellen durch die UHPLC-MS-Analyse von mehreren Substraten zu identifizieren. Dies ist ein Antikörper-freie Methode entwickelt, um HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit im Wohnzimmer wiedergeben Zelle Umgebung, im Gegensatz zu Single-Isoform zellfreie Assays.

Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von magnetischen Partikeln und Bewertung ihrer DNA-bindende Eigenschaften über dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung. Diese Methode konzentriert sich auf die Überwachung von Änderungen der Partikelgröße, ihre Polydispersität und Zeta-Potential der Partikeloberfläche die spielen wichtige Rolle bei der Bindung von Materialien wie DNA.

DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

Lernen Sie die HPLC-ED-Methode zur Quantifizierung von 8-oxo-dGuo als DNA-Oxidationsbiomarker in kultivierten Zellen und tierischen Geweben. Dieses Protokoll minimiert artefaktuelle Oxidation während der Probenaufbereitung.

HPLC-Messung der DNA-Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-Desoxyguanosin, in kultivierten Zellen und tierischen Geweben

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