Name: Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Isolation und Transplantation muriner Thymus von Spendern unterschiedlichen Alters in immunodefiziente Empfänger. Diese Methode ermöglicht die in vivo Analyse der T-Zell-Entwicklung und thymischen Selektion.

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Diese Arbeit wurde mit Mitteln der National Institutes of Health (1R01AI083269) unterstützt.

Die Maus-Studien wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der University of North Carolina in Chapel Hill und alle genehmigten Tierpflege wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien IACUC. 1. Herstellung von Neugeborenen und Erwachsene Thymi <ol><li> Bereiten Sie alle Reagenzien und Geräte vor euthanizing Spendermäusen. </li><li> Sterilisieren chirurgischer Instrumente durch Autoklavierung oder andere geeignete Verfahren. Alle chirurgischen Verfahren müssen unter einer Haube mit laminarer Strömung, um sterile Bedingungen aufrecht zu erhalten und eine Verunreinigung zu vermeiden, durchgeführt werden. Montieren Sie die Werkzeuge für die Gewinnung von Thymi von Spendermäusen benötigt. </li><li> Füllen Sie einen 60-mm-Schale mit steriler 1x PBS (pH 7,4) und auf Eis in der Kapuze. Dies wird zu kurz store Thymi von Spendermäusen vor der Transplantation entnommen werden. </li><li> Nach ethischen Richtlinien, einschläfern Neugeborenen Spendermäusen durch Enthauptung und erwachsene Spendermäusen durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte. </li><li> Für removal des Thymus: Legen Sie die Maus in einer dorsalen Rückenlage auf einem sterilen saugfähigen Papiertuch und sprühen mit 70% Ethanol vor der einen Einschnitt. </li><li> Setzen Sie die Bauch- und Brusthöhle, indem Sie einen Mittelschnitt durch die Haut. Falten Sie die Haut über der Brust und Vorderbeine, um die Brusthöhle zu offenbaren. </li><li> Machen Sie zwei seitliche Schnitte durch das Zwerchfell und Brustkorb, den oberen Mediastinum aussetzen und vorderen Brusthöhle. Der Thymus ist als zwei weißen Lappen unmittelbar über sichtbare und neben dem Herzen sein. </li><li> Necken neben der rund um die Thymusdrüse mit feinen Pinzette Bindegewebe, so dass bestimmte nicht, um die Kapsel zu stören. Während den Brustkorb mit einer Pinzette zurückhalten, verwenden Sie eine zweite Zange, um die zwei Lappen des Thymus durch die Positionierung einer gebogenen Pinzette unter der Orgel und vertikal ziehen zu extrahieren. Dies kann unter Verwendung eines Binokular zur Extraktion Thymi von neugeborenen Mäusen durchgeführt werden. </li><li> Setzen Sie den Thymus in der 60 mm dish, die steriles 1x PBS (pH 7,4) auf Eis und separater Thymus Lappen durch Durchtrennen des Bindelandenge. Entfernen Sie alle Fremdkörper aus dem Thymus Lappen mit dem bestimmte nicht, um die Kapsel beschädigt werden, und schneiden Sie die Thymus in die entsprechende Anzahl von Abschnitten für die Transplantation. </li><li> Manipulieren Sie nicht den von neugeborenen Mäusen erhalten Thymi. HINWEIS: Wird für maximal zwei Empfängermäuse (1 Lappen pro Empfänger). </li><li> Transplantation die aus erwachsenen Mäusen erhalten Thymi in maximal 4-6 Empfängermäuse. Mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig greifen ein Erwachsener Thymus Lappen, wie in Abbildung 1 dargestellt ist, schneiden Sie den Thymus in drei gleiche Abschnitte mit chirurgische Scheren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,4 für jede Spendermaus. Um die Zeit zu begrenzen Thymi ausgesetzt sind, bereiten 1 Spender Thymus zu einem Zeitpunkt. </li></ol> 2. Thymus Implantation unter die Nierenkapsel <ol><li> Montieren Sie den pre-sterilisiert Ausrüstung in Tabelle 1 aufgeführt. AseptischeTechnik sollte im Verlauf des Verfahrens Belichten Transplantatrezipienten kontaminierte Werkzeuge oder Reagenzien zu verhindern, verwendet werden. </li><li> Vor der Transplantation wiegen und etikettieren jeden Empfänger der Maus. </li><li> Einrichten des Binokular und Anästhesie-Schaltung in der Sterilbank. </li><li> Mit einem elektrischen Rasierer, rasieren Sie die linke Seite der Empfängermaus und sicherzustellen, dass keine Haare rund um die verwendet werden, um den Schnitt zu machen Bereich bleibt. </li><li> Schalten Sie Isofluoran Verdampfer und betäuben die Maus mit einer Dosis von zwischen 1-2%. Ermitteln ordnungsgemäße Betäubung vor Beginn des chirurgischen Eingriffs durch Prüfen auf die Abwesenheit von reflex folgenden toe Prise. </li><li> Nachdem die Maus ordnungsgemäß betäubt wird, gelten veterinär Salbe auf den Augen der Maus, um Trockenheit zu verhindern und bereiten Sie die Maus für die Transplantation, wie folgt: </li><li> Bewegen Sie die Maus unter dem Binokular in einer rechten Seitenlage, so dass die rasierte Seite nach oben zeigt. Starting in der Mitte der OP-Bereich, verzichten in einer kreisförmigen Bewegung mit einem Einmaltransferpipette 70% Ethanol, gefolgt von PVP-Jod (Betadine). Wiederholen Sie die Ethanol / betadine Behandlung 3 mal vor einen Einschnitt. </li><li> Verwendung Präparierscheren einen 1-2 cm Flankenschnitt direkt über die Niere. </li><li> Verwendung Medium Pinzette fassen Bindegewebe neben der Niere und heben die Nieren, so dass es oben auf der Muskulatur liegt. Um die Niere freigelegt und an Ort und Stelle über die Muskulatur zu halten, legen Sie einen Arm des Mediums Zange unterhalb der Niere, wobei besonderes Augenmerk nicht auf die Nieren ilium stören. </li><li> Um Gewebeaustrocknung zu verhindern, zu bewässern die Niere mit sterilem 1x PBS (pH 7,4) bei jedem Schritt, bis Manipulation der Nieren und Nierenkapsel ist abgeschlossen. </li><li> Verwenden feinen Pinzette kneifen und heben Sie die Kapsel in der Nähe der Kante des Nieren meisten distal zu den Nebennieren, um es von der Niere zu trennen. </li><li> Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um einen Einschnitt groß genug, um das vorbereitete Stück Spender Thymus (2A) einfügen zu machen. Stellen Sie sicher, um die Kapselinzision so klein wie möglich zu Dislokation der Prothese im Laufe der Zeit zu verhindern. </li><li> Während die Kapsel löste sich von der Niere, verwenden Sie ein zweites Paar von feinen Pinzette, um das Transplantat unter der Kapsel einlegen und drücken Sie den Thymus so weit nach vorne aus dem Kapselinzision wie möglich (2B). </li><li> Entfernen Sie die Zange von unterhalb der Niere, und sanft die Niere wieder zurück an seinen Platz durch den Einschnitt. </li><li> Schließen Sie die Muskulatur durch Annähen der Bauchwand und die Anwendung betadine einmal geschlossen. Nach der vollständigen Naht ist, gelten Wundklammern, um die Dermis zu schließen und betadine in die Umgebung. </li><li> Gibt die Maus in einen Käfig mit einer Wärmelampe, die aufgewärmt hat. </li><li> Überwachen sich postoperative Maus, bis es volle Bewusstsein und Mobilität gewinnt und stellen Sie keine Mäuse that wurden nicht nach Betäubung in einen Käfig mit anderen Tieren gewonnen. </li><li> Behandlung von Mäusen mit postoperativen Schmerztherapie Medikamente nach Bedarf. Stellen Mäuse mit postoperativen Schmerzmittel wie Paracetamol im Trinkwasser in einer Konzentration von 1,6 mg / ml. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,9 für jeden Empfänger der Maus. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Mäuse, den normalen Aktivitäten innerhalb 1 Stunde nach der Operation. Überwachen Sie die postoperative Gewicht, Motorik, sowie das Tränken und Futter Aktivität jeder Maus, um Komplikationen, die sich als Folge der Transplantation zu bestimmen. HINWEIS: Post-operative Gewichtsverlust im Vergleich zu präoperativen Gewicht sowie veränderte Mobilität oder Misserfolg zu essen oder trinken können Komplikationen hinweisen. </li><li> Überwachen T Zellrekonstitution im peripheren Blut durch Ausbluten Mäusen über die Schwanzvene nick gefolgt von der Abtrennung der Lymphozyten mit Lympholyte Zelltrennungsmedien nach den Angaben des Herstellers. Erreichen T-Zell-characterization durch Anfärben Lymphozyten mit fluoreszenz konjugierte Antikörper spezifisch für T-Zellen-Marker CD3, CD4, CD8, sowie eine Live toten Diskriminator wie einem fluoreszenz aktivierte Succinimidylester 8. Analyse, wie in Figur 3 gezeigt ist über Gating Singuletts, lebenden Zellen und mit CD3-positiven Zellen erreicht werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Ereignisse, die die Thymusselektion regulieren, sind nur unzureichend verstanden. Neuere Studien haben ontogene Veränderungen in der Effizienz der Selektion gezeigt. Die Kopplung dieses Ansatzes mit verschiedenen transgenen Thymusspender- und Empfängermäusen wird Studien zur Identifizierung der Ereignisse und Parameter, die die Thymusselektion regulieren, weiter erleichtern. Insbesondere wird die Thymustransplantation zur Behandlung und Behandlung von T-Zell- und Thymuserkrankungen eingesetzt, die beispielsweise bei athy...

Der Thymus ist ein Organ, in dem kritische Ereignisse in T-Zell-Entwicklung entstehen 1. Resident Thymozyten auf Umlagerung des T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β-Gene, durchlaufen eine Reihe von Interaktionen mit lymphostromal und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Rinde und Mark Regionen des Thymus 2. Thymus-positive Selektion durch kortikale Thymusepithelzellen (TEC) vermittelte, um Thymozyten, die antigene Peptide im Kontext der Host Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I und II-Moleküle erkennen 2-3 herzustellen. Nachfolgende Thymus negative Selektion bringt Spülen von autoreaktiven Thymozyten, durch eine Wechselwirkung mit Mark TEC oder dendritischen Zellen (DC), die vorhanden Peptide aus Selbstproteine ​​durch MHC-Klasse-I und II-Moleküle gebunden 3 abgeleitet angetrieben. Das Ergebnis dieser Prozesse ist die Einrichtung eines Pools von reifen CD4 + und CD8 + T-Zellen in der Lage, ein breites Spektrum reagierenFremdgene während sie eine minimale Reaktivität mit Eigenproteine ​​4. Die Effizienz des Thymus Auswahlereignisse durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich Thymus-Reifung, die Häufigkeit der Mark und kortikaler TEC Teilzusammensetzung Thymus DC, und die Source des Thymus Vorstufen 3 beeinflusst. Bemerkenswert ist, können abweichende Thymus-Auswahl bei Autoimmun 5 oder immundefizienten Pathologien, die von eingeschränkter negative oder positive Selektion entstehen beziehungsweise führen. Die molekularen Ereignisse regulieren Thymus Auswahl, sind jedoch kaum verstanden. In vitro-Ansätze wie reaggregieren Thymus-Organkulturen (RTOC) 6, haben sich als nützlich für die Analyse von Basisereignissen mit Thymus Auswahl zugeordnet ist, aber nicht, um die Dynamik der laufenden vollständig rekapitulieren In-vivo-Veranstaltungen. Als Folge wurde dieses Thymus-Transplantation-basierten Ansatz für eine bessere Studien thymocyte Auswahl Veranstaltungen in vivo 7 fest </sup&gt;. Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation Thymi von Neugeborenen und erwachsenen Spendermäusen in immundefiziente SCID-Empfängermäuse. Diese Technik erlaubt die Untersuchung der Mechanismen, die positive und negative Selektion Thymus sowie Thymusfunktion verschiedener T-Zell-Teilmengen während der Ontogenese regulieren. In jüngster Zeit wurde dieser Ansatz verwendet, um zu zeigen, dass die Effizienz des Thymus Auswahl früh nach der Geburt in Mäusen führt zu einer erhöhten Entwicklung von autoreaktiven T-Zellen, und für die Fremdantigene 7 eine reduzierte T-Zell-Repertoire spezifisch.

<table><tbody><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Betadin-Lösung</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td></td></tr><tr><td>18-Gauge-Nadel</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Nähte (1,0 metrisch)</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>18" (45cm)</td></tr><tr><td>AUTOCLIP Wundclips (9mm)</td><td>Clay Adams&reg; Marke</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Einweg-Maus Anti-CD3 Ab</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-85</td><td>Klon: 1452C11</td></tr><tr><td>Maus Anti-CD4 Ab</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td>Klon: RM4-5</td></tr><tr><td>Maus Anti-CD8 Ab</td><td>eBioscience</td><td>25-0081-82</td><td>Klon: 53-6.7</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Medipoint</td><td>Goldenrod 4 mm</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidylester, Triethylammoniumsalz</td><td>Invitrogen</td><td>P30253</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Rundbodenplatten aus Polypropylen</td><td>Corning</td><td>3365</td><td></td></tr><tr><td>1,2 ml Polypropylen-Cluster-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>4401</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>BD</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>40uM Nylonzelle Sieb</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd-Lösung, EM-Qualität</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>15710</td><td>Gefährliche</td></tr><tr><td>Puralube Optische Salbe</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138063</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>430196</td><td>60 mm x 15 mm, steril</td></tr></tbody></table>

isolation und transplantation von different aged murine thymic grafts.

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Die Mechanismen, die die Wirksamkeit von Thymus Auswahl, zu regeln schlecht definiert. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht in vivo-Analysen von der Entwicklung und Auswahl bestimmter für Selbst- und Fremdantigene T-Zellen. Der Ansatz beinhaltet die Implantation von Thymus-Transplantate aus verschiedenen alten Mäusen in immundefiziente SCID-Empfänger ab. Über einen relativ kurzen Zeitraum die Empfänger sind mit T-Zellen aus dem Thymus implantierten Transplantats abgeleitet rekonstituiert. Nur Thymozyten Impfen der Thymus zum Zeitpunkt der Trennung zu unterziehen Auswahl und entwickeln sich zu reifen T-Zellen. Als solches können Änderungen in der Art und Spezifität der transplantierten T-Zellen als Funktion der altersabhängigen Thymus Ereignisse bewertet werden. Obwohl technische Know-how für erfolgreiche Thymus-Transplantation erforderlich ist, stellt dieses Verfahren eine einzigartige Strategie, um in vivo zu untersuchen eine breite Palette von Krankheiten, die durch oder aufgrund der abweichenden Thymus-Funktion und / oder sind homeostasist.

Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von minimalen chirurgischen Traumas sowie die genaue Positionierung der Prothese unterhalb der Nierenkapsel. Der Thymus Transplantat sollte geschnitten angemessen sicherzustellen bemessen Thymus Abschnitte für eine nachfolgende Transplantation, wie in Abbildung 1 dargestellt. Nach der schematischen Darstellung in Figur 1 kann Thymi aus neugeborenen oder erwachsenen Mäusen für eine erfolgreiche Transplantation subkapsuläre mit eindeutigen und reproduzie...

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung der Transplantation von murinem Thymian von verschiedenen gealterten Spendermäusen unter die Nierenkapsel von immundefizienten Mausempfängern. Das Ziel dieses Ansatzes ist es, die T-Zell-Entwicklung und das Thymus-Selektionsereignis in vivo zu modellieren.

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die in vivo-Analyse der negativen Selektion von T-Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt während der T-Zell-Ontogenese zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Thymus einer Spendertau aus einem Mäuschen im gewünschten Alter entnommen wird. Im zweiten Schritt wird die Niere einer empfänglichen Skid-Tau freigelegt und der Spenderthymus chirurgisch unter die Nierenkapsel implantiert.Im letzten Schritt wird der Empfänger verschlossen. Letztlich kann die erfolgreiche Rekonstitution des peripheren T-Zell-Kompartiments mittels Durchflusszytometrie evaluiert werden. Diese Methode ermöglicht die zeitliche Untersuchung der thymischen Selektion und der T-Zell-Produktion und liefert im Wesentlichen eine Momentaufnahme der T-Zell-Produktion zu einem bestimmten Zeitpunkt von Interesse während der T-Zell-Antigenantwort. Um den Thymus von einer erwachsenen Maus oder einem neugeborenen Tier zu entfernen, legen Sie das Tier zunächst in Rückenlage auf ein steriles, saugfähiges Papierhandtuch und besprühen Sie das Fell mit 70 %igem Ethanol.Anschließend wird ein medianer Schnitt durch die Haut gemacht, um die Bauch- und Brusthöhle frei

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu...

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Dieses Video zeigt die Induktion der Darmtransplantat-gegen-Wirt-Krankheit, GvHD, bei einer tödlich bestrahlten Empfängermaus unter Verwendung von allogenen hämatopoetischen Stammzellen und GvHD-induzierenden Milz-alloreaktiven T-Lymphozyten. Dieses Protokoll hilft bei der Etablierung eines schweren akuten intestinalen GvHD-Modells, um den Mechanismus der Krankheit zu verstehen und innovative Therapieoptionen zu entwickeln.

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Die Schwanzhauttransplantation ist ein leistungsfähiges Modell zur Untersuchung der T-Zell-abhängigen Abstoßung und Toleranzinduktion während allogener Immunantworten bei Mäusen. Die Vorteile dieses Protokolls sind kleinere invasive Eingriffe und eine einfache Überwachung, ohne dass die Empfängermaus geopfert werden muss.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Dieser Artikel beschreibt in vivo und in vitro Methoden zur Charakterisierung der thymusabsetzenden Vorläuferzellen durch die Analyse der Kinetik der Erzeugung, des Phänotyps und der Anzahl ihrer T-Zell-Nachkommen.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Um die kombinierte Allotransplantation von soliden Organen und vaskularisierten Kompositen zu untersuchen, beschreiben wir ein neuartiges heterotopes En-bloc-Modell für Brustwand-, Thymus- und Herztransplantationen bei Mäusen unter Verwendung einer zervikalen Non-Sewure-Manschettentechnik.

A Novel Mikromodell für Heterotope, En Bloc Brustwand, Thymus und Herz-Transplantation bei Mäusen

Murine Vollhauttransplantation ist ein gut etabliertes Modell Ablehnung in einer alloimmune Einstellung zu studieren. Hier bieten wir ein Tutorial von jedem Schritt beteiligt bei der Durchführung einer Balb / c -&gt; C57BL / 6 Vollhauttransplantation.

Murine Vollhauttransplantation

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

Wir bieten eine einfache und effiziente Methode, um 2'-Deoxyguanosin behandelt E18.5 Thymus in die Nierenkapsel einer Nacktmaus zu transplantieren. Diese Methode sollte bei der Untersuchung sowohl der Funktion der thymischen Epithelzellen als auch der Reifung von T-Zellen helfen.

Renale subkapsuläre Transplantation von 2'-Deoxyguanosin-behandeltem murineembryonenden Thymus bei nackten Mäusen

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Erfahren Sie die Isolation und Transplantation muriner Thymus von Spendern unterschiedlichen Alters in immunodefiziente Empfänger. Diese Methode ermöglicht die in vivo Analyse der T-Zell-Entwicklung und thymischen Selektion.

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