Name: Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Lernen Sie den Weichagar-Kolonienbildungsassay zur Bewertung der Tumorigenität von Brustkrebszellen unter Verwendung des PADI-Inhibitors BB-Cl-amidine. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Zellproliferation in semi-festen Matrices.

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Wir danken Dr. Richard Cerione, Dr. Marc Antonyak und Kelly Sullivan, Cornell University, für ihre technische Beratung, und Dr. Gerlinde Van de Walle, Cornell University, für die Bereitstellung ihres Olympus CKX41 inversen Mikroskops.

1. Herstellung von 3% 2-Hydroxyethyl Agarose <ol><li> In einem sauberen, trockenen 100 ml-Glasflasche, fügen Sie 0,9 g 2-Hydroxyethyl Agarose (Agarose VII), gefolgt von 30 ml destilliertem Wasser. </li><li> Mikrowelle die Mischung für 15 Sekunden und leicht schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens drei weitere Male, bis die Agarose-Pulver vollständig auflöst. </li><li> Autoklavieren der Lösung enthaltende Flasche für 15 min. </li><li> Lassen Sie die Agarose-Lösung auf RT vor der weiteren Verwendung abkühlen. Bewahren Sie die Lösung bei RT. </li></ol> 2. Herstellung der Unterschicht: 0,6% Agarosegel <ol><li> Vorwärmen mehrere 5 ml und 10 ml-Pipetten in einem Inkubator bei 37ºC, um die Agarose erstarrt in der Pipette bei der Handhabung zu verhindern. </li><li> Teilweise lösen Sie die Flaschendeckel und Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. Dann sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec. ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig beim Schwenken des agarose Lösung, da die Lösung erhebt sich an der Luft und können überschwappen. </li><li> Wenn es Rest festes Gel in der Flasche, Mikrowelle für ein paar Sekunden. </li><li> Halten Sie die Flasche mit der Agarose-Lösung in einem 45 ° C Wasserbad während der nächsten Schritte, um die Agarose-Lösung verfestigt vorzeitig zu verhindern. </li><li> Warm MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad. Anmerkung: MCF10DCIS Medien besteht aus DMEM / F12, 5% Pferdeserum, 5% Penicillin-Streptomycin. </li><li> Übertragungs 3 ml der 3% igen Lösung unter Verwendung der vorgewärmten Pipetten in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Sofort im 12 ml warmem MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen das konische Röhrchen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Versuchen Sie nicht, alle Blasen zu bilden, wie es mit der Koloniezahl später stören. </li><li> Vorsichtig 2 ml dieser Mischung in jede Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte hinzufügen, ohne die Bildung von Luftblasen. </li><li> Inkubieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontally auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für 1 Stunde, damit die Mischung zu verfestigen. </li><li> Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für 30 Minuten. Die untere Schicht ist jetzt einsatzbereit. </li></ol> 3. Herstellung der zellhaltigen Schicht: 0,3% Agarosegel <ol><li> Trypsinize MCF10DCIS Zellen und verdünnen, um eine Zellkonzentration von 4 x 10 4 / ml. </li><li> Nehmen Sie 2 ml der 3% igen mit vorgewärmten Pipetten und Überführung in eine sterile 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Sofort an den konischen Rohr 8 ml MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie bilden keine Blasen. </li><li> Nehmen Sie 2 ml der MCF10DCIS Zellen (4 x 10 4 / ml) und behandle mit BB-CLA (0 uM (DMSO) oder 1 &amp; mgr; M). </li><li> In einem 1: 1-Verdünnung, Mischen der Zellen mit 0,6% Agarose. </li><li> Nimm 1 ml der Zelle-Agarose-Mischung und schonend hinzuzufügen auf die untere Schicht der 6-Well-Kultur pspät (2 x 10 4 Zellen / ml). </li><li> Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 Minuten, damit die obere Schicht zu verfestigen. </li><li> Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für eine Woche vor der Zugabe des Fütterungsschicht. </li></ol> 4. Vorbereitung der Feeder-Schicht: 0,3% Agarosegel <ol><li> Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec. </li><li> Äquilibrieren Sie die Agarose-Lösung Flasche in einem 45 ° C Wasserbad. </li><li> Wärmen Sie die MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Mix 1 ml 3% Agarose-Lösung mit 9 ml warmem MCF10DCIS Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen und vorsichtig umgedreht, um die Agarose zu den Medien mischen. Vermeiden Sie Luftblasen bilden. </li><li> Behandlung der Mischung mit BB-CLA (0 &amp; mgr; (DMSO) oder 1 &amp; mgr; M). </li><li> Vorsichtig 1 ml dieser Mischung (ohne fürming Blasen) in jedes Well der 6-Well-Kulturplatte, die den Boden und weichen Schichten. </li><li> Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 min, die Mischung zu verfestigen. </li><li> Nachdem der Feeder-Schicht erstarrt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator. </li><li> Wiederholen Sie diese Prozedur Zufuhr wöchentlich durch Überlagerung von 1 ml 0,3% Agarose / mittel / Behandlungslösung auf den vorhandenen Futterschicht, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet. Hinweis: Agar in den weichen und Feeder-Schichten sehr weich ist, und daher wird die zugesetzten Nährstoffe aus der Feeder-Schicht leicht in die Zellen enthaltende Schicht diffundieren, um die Zellen zu erreichen. </li></ol> 5. Data Collection <ol><li> Nach 2,5 Wochen Zellwachstum in dem weichen Agar, zählen die Anzahl der Kolonien in jeder Vertiefung unter Verwendung eines Lichtmikroskops. Um eine Quantifizierung zu ermöglichen, drucken Sie ein Raster auf eine Transparenz und befestigen Sie das Raster, um die6-Well-Platte, um zu lokalisieren, wo die Zellen während der Zählung sind. Da Koloniegröße (wie durch den Durchmesser jeder Kolonie quantifiziert) variiert vordefinieren eine Referenzkoloniegröße zu bestimmen, welche Kolonien erzielt wird. Beispielsweise umfassen Koloniegrößen von 70 um oder in der Datenanalyse größer. </li><li> Lagern die Proben bei 4 ° C weiter Koloniebildung und für zukünftige Zählung zu verhindern. Verschließen Sie den 6-Well-Kulturplatte mit Parafilm, um die Gele vor dem Austrocknen zu verhindern. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Rate der Koloniebildung in Weichagar in Abhängigkeit von dem Zelltyp 9 abhängig. Daher ist die Anzahl von Zellen mit zu optimieren und entsprechend angepasst werden starten. Eine vorgeschlagene Startbereich liegt zwischen 5 x 2 bis 01 Oktober x 10 4 Zellen pro Vertiefung unter Verwendung einer 6-Well-Platte. Außerdem variiert Koloniegröße von der Wachstumsrate jeder Zelle abhängig. Daher wird ein vordefinierter ein cut-off für die Koloniegröße erforderlich, um einzelne Kolonien für n...

Sowohl nicht transformierte (normale) als auch transformierte Zellen können sich in einer 2D-Monolayer-Kultur leicht vermehren. Diese Form des adhärenten Zellwachstums unterscheidet sich stark von derjenigen, die in vivo stattfindet, wo sich die Zellen in ihrer Mikroumgebung ohne mitogene Stimulation oft nicht schnell teilen. Der Soft-Agar-Assay hingegen unterscheidet sich von 2D-Kultursystemen, da er die Tumorigenität quantifiziert, indem er die Fähigkeit einer Zelle misst, sich zu vermehren und Kolonien in Suspension innerhalb eines halbfesten Agarosegelszu bilden 1. In dieser Umgebung sind nicht-transformierte Zellen nicht in der Lage, sich ohne Verankerung an der extrazellulären Matrix (ECM) schnell zu vermehren und durchlaufen eine Apoptose, ein Prozess, der als Anoikis bekannt ist. Im Gegensatz dazu verlieren Zellen, die eine maligne Transformation durchlaufen haben, ihre Verankerungsabhängigkeit aufgrund der Aktivierung von Signalwegen wie Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)/Akt und Rac/Cdc42/PAK. Daher sind diese Zellen in der Lage, innerhalb der halbfesten Weichagar-Matrix2 zu wachsen und Kolonien zu bilden.
Eine häufige Verwendung des Soft-Agar-Assays besteht darin, zu testen, ob bestimmte Verbindungen, wie z.B. PADI-Inhibitoren, in der Lage sind, das Tumorwachstum in vitro zu unterdrücken. Im Allgemeinen handelt es sich bei der Koloniezahl oder der Koloniegröße um quantitative Messwerte aus dem Assay, die zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen verglichen werden können, um Unterschiede in der zellulären Tumorigenität zu beurteilen. Wenn man also feststellt, dass die Koloniebildung umgekehrt mit zunehmender Wirkstoffkonzentration korreliert, dann könnte man daraus schließen, dass das Medikament in vitro ein wirksamer Inhibitor der Tumorigenität ist. Auf der anderen Seite, wenn das Medikament die Koloniebildung nicht beeinflusst, ist das Medikament entweder nicht in der richtigen Dosierung oder es ist kein wirksamer tumorigener Inhibitor. Neben der Verwendung eines Soft-Agar-Assays zum Testen der Anti-Tumor-Wirkung eines Medikaments kann dieser Assay auch verwendet werden, um die Beziehung zwischen einem bestimmten Gen und der Tumorgenese zu untersuchen. Zum Beispiel kann der Effekt der Unterdrückung der PADI2-Expression auf die Tumorigenität durch eine PADI2-spezifische siRNA-Behandlung behoben werden.
PADIs sind calciumabhängige Enzyme, die Proteine posttranslational modifizieren, indem sie positiv geladene Argininreste in neutral geladenes Citrullin in einem Prozess umwandeln, der als Citrullinierung oder Deiminierung3-5 bekannt ist. Wir haben kürzlich herausgefunden, dass Peptidylarginin-Deiminase 2 (PADI2) als neuartiger Brustkrebs-Biomarker fungieren kann und dass PADI-Inhibitoren Therapiekandidaten für Brustkrebs im Frühstadium darstellen6. Zum Beispiel haben wir bereits gezeigt, dass ein "pan-PADI"-Inhibitor, Cl-Amidin, die Proliferation von Brustkrebszellen mit Hilfe von 2D-Monolayern unterdrückt und dass der Inhibitor das Wachstum von 3D-Tumorsphäroiden unterdrückt6. In diesem Bericht erweitern wir diese Studien und heben den Nutzen des Soft-Agar-Assays hervor, indem wir die Wirksamkeit eines neuen PADI-Inhibitors, BB-CLA, bei der Unterdrückung des Wachstums von MCF10DCIS Brustkrebskolonien testen7. Wir stellen fest, dass wir MCF10DCIS Zellen für dieses Experiment verwendet haben, da es sich um onkogene Derivate von nicht transformierten humanen MCF10A-Zellen handelt und weil sie hohe Steady-State-Spiegel des PADI2-Proteins8 enthalten. Wir vermuten, dass die enzymatische Aktivität von PADI2 eine Schlüsselrolle bei der Tumorigenität dieser Zelllinie spielt und dass die BB-CLA-vermittelte Hemmung der PADI2-Aktivität das Fortschreiten der Krebserkrankung unterdrückt.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Donor Equine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxyethylagarose: Typ VII, niedrige Geliertemperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

nutzung der koloniebildung in weichagar-assay auf inhibitoren der tumorigenität in brustkrebs-zellen zu identifizieren

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Angesichts der inhärenten Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Mechanismen der Tumorprogression in vivo bleiben zellbasierte Assays wie der Soft-Agar-Kolonie-Formations-Assay (im Folgenden als Soft-Agar-Assay bezeichnet), der die Fähigkeit von Zellen misst, sich in halbfesten Matrizen zu vermehren, ein Markenzeichen der Krebsforschung. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen 2D-Monolayer- oder 3D-Sphäroid-Zellkultur-Assays ist die genaue Nachahmung der 3D-Zellumgebung mit der in vivo. Wichtig ist, dass der Soft-Agar-Assay auch ein ideales Werkzeug ist, um die Auswirkungen neuartiger Verbindungen oder Behandlungsbedingungen auf die Zellproliferation und -migration rigoros zu testen. Darüber hinaus ermöglicht dieser Assay die quantitative Bewertung des Zelltransformationspotenzials im Kontext genetischer Störungen. Wir haben kürzlich die Peptidylarginin-Deiminase 2 (PADI2) als potenziellen Biomarker und therapeutisches Ziel für Brustkrebs identifiziert. Hier unterstreichen wir den Nutzen des Soft-Agar-Assays für präklinische Anti-Krebs-Studien, indem wir die Auswirkungen des PADI-Inhibitors BB-Cl-Amidin (BB-CLA) auf die Tumorigenität von humanen duktalen Carcinoma in situ (MCF10DCIS)-Zellen testen.

Die Koloniebildung in Weichagar-Assay kann für eine breite Palette von Anwendungen dokumentieren die Tumorigenität von Krebszellen verwendet werden. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die halbfeste Matrix selektiv begünstigt das Wachstum von Zellen, die in einem verankerungsunabhängigen Weise vermehren können. Diese Eigenschaft wird hauptsächlich durch die Krebszellen, aber nicht von normalen Zellen zeigten. Verwendet werden vor allem diese Technik, um die Wirksamkeit der Hemmung des Tumorwachstums durch Medikame...

Hier dokumentieren wir die Verwendung des Soft-Agar-Koloniebildungsassays, um die Auswirkungen eines Peptidylarginin-Deiminase (PADI)-Enzyminhibitors, BB-Cl-amidin, auf die Tumorigenität von Brustkrebs in vitro zu testen.

Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Effekt einer Behandlung auf die Fähigkeit von Zellen, in semifesten Matrizen zu proliferieren, quantitativ zu bestimmen, da eine verbesserte Fähigkeit ein Kennzeichen der Tumorigenität von Zellen ist. Mithilfe des Weichagar-Assays wird die Tumorigenität anhand der Fähigkeit einer Zelle gemessen, Kolonien innerhalb eines semifesten AROS-Gels zu bilden. Da nicht transformierte Zellen in dieser Umgebung nicht schnell proliferieren können, wird das semifeste AROS-Gel hergestellt, indem zunächst eine 0,6 %ige AROS-Unterschicht angelegt wird. Anschließend wird eine Zell-enthaltende 0,3 %ige AROS-Gelschicht über der Unterschicht hinzugefügt.In diesem Assay werden die experimentellen Zellen mit einem Inhibitor der Peptidyl-Arginin-Desaminase oder PAD-Enzyms behandelt, das von Dr. Subramanian entwickelt wurde. Wöchentlich wird eine zusätzliche Fütterungsschicht hinzugefügt, die aus einem 0,3 %igen Agarosegel mit oder ohne Behandlung besteht. Der letzte Schritt besteht darin, die Anzahl der Kolonien, die größer als 70 Mikrometer sind, zur Analyse zu zählen.Schließlich wird die invertierte Mikroskopie verwendet, um den Unterschied in der Kolonieanzahl zwischen der Kontroll- und der Behandlungsgruppe zu zeigen. Hallo, mein Name ist Achi Huta. Ich bin Doktorandin im Labor von Dr. Scott Kros am Baker Institute for Animal Health.An der Cornell University kann der Soft-Tiger-Koloniebildungs-Assay dabei helfen, zentrale Fragen der Krebsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Tumorgenität einer Vielzahl von Krebszellen hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, Hormonen und zahlreichen anderen Behandlungsbedingungen zu bewerten. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 3 % Two Hydroxyethyl Aros in einer sauberen, trockenen 100-Milliliter-Glasflasche vorbereiten. Geben Sie 0,9 Gramm Two Hydroxyethyl Aros hinzu, gefolgt von 30 Millilitern destilliertem Wasser.Erhitzen Sie die Mischung für 15 Sekunden in der Mikrowelle und schwenken Sie sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das AROS-Pulver vollständig gelöst ist. Anschließend sterilisieren Sie die Flasche mit der Lösung im Autoklaven für 15 Minuten.Lassen Sie die Agros-Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Vor der weiteren Verwendung erwärmen Sie mehrere 5-Milliliter- und 10-Milliliter-Pipetten in einem 37 °C-Brutschrank vor, um die Verfestigung des Aros in der Pipette zu verhindern. Wenn Sie teilweise arbeiten, lösen Sie den Flaschenverschluss und erwärmen die vorgefertigte 3 %ige HYDROXYETHYL-Aro-Lösung im Mikrowellenofen für 15 Sekunden. Danach die Lösung vorsichtig schwenken und weitere 15 Sekunden mikrowellen. Beim Schwenken der ARO-Lösung Vorsicht walten lassen, da die Lösung sich bei Luftkontakt nach oben hin ausdehnt und überschäumen kann, wenn sich noch fester Gelrest im Mikrowellenbehältnis befindet. Um eine vorzeitige Vergelung der Agro-Lösung zu verhindern, das Gefäß mit der ARO-Lösung in den nächsten Schritten noch einige Sekunden in einem 45 Grad Celsius warmen Wasserbad belassen.Als Nächstes übertragen Sie 12 Milliliter vorgewärmtes Medium unter Verwendung der vorgewärmten Pipetten in ein steriles 50-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie sofort 3 Milliliter der 3 %igen Aros-Lösung hinzu und mischen Sie das Aros vorsichtig mit dem Medium, indem Sie das Konischgefäß sanft umdrehen. Anschließend geben Sie vorsichtig 2 Milliliter dieser Mischung in jedes der sechs Wells einer Kulturplatte, wobei keine Luftblasen entstehen dürfen.Die sechs-Well-Kulturplatte eine Stunde lang horizontal auf einer flachen Oberfläche bei vier Grad Celsius inkubieren, damit sich die Mischung verfestigen kann. Nach dem Erstarren der Mischung die Platte 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Die untere Schicht ist nun gebrauchsfertig.Ein schwieriger Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass alle Zellen gleichmäßig verteilt werden und dass das geschmolzene Agaros-Gel nicht vor dem Zugabe in jede Mulde erstarrt, um sicherzustellen, dass sich die Sphäroide im Medium vermischen, bevor das flüssige Agaros-Gel zugegeben wird. Zusätzlich werden die Pipetten vorab erwärmt, um zu verhindern, dass die Lösungen während der Handhabung erstarren. Um die zellhaltige Schicht vorzubereiten, lösen Sie zunächst die MCF-10-DCIS-Zellen mit Trypsin ab und verdünnen sie auf eine Zellkonzentration von 40.000 Zellen pro Milliliter. Entnehmen Sie anschließend acht Milliliter Medium mit vorgewärmten Pipetten und überführen Sie diese in ein steriles 50-Milliliter-Konischglas.Geben Sie sofort zwei Milliliter 3 % Aros in das kegelförmige Reagenzglas und mischen Sie vorsichtig durch vorsichtiges Umstülpen, um das Aros mit dem Medium zu vermengen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Entnehmen Sie anschließend zwei Milliliter der Zellen und behandeln Sie diese mit zwei Mikromolar BB-Chloramin in DMSO oder allein mit DMSO als Kontrolle. Nach der Behandlung mischen Sie die Zellen mit 0,6 % Aros in einer Verdünnung im Verhältnis 1:1, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar BB-Chloramin zu erreichen.Anschießend ein Milliliter der Zell-Aros-Mischung entnehmen und vorsichtig auf die untere Schicht der Sechs-Loch-Kulturplatte geben. Die Sechs-Loch-Kulturplatte horizontal auf eine flache Oberfläche bei vier Grad Celsius für mindestens 15 Minuten stellen, damit die obere Schicht gerinnen kann. Nachdem die Mischung erstarrt ist, die Platte eine Woche lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen, bevor die Fütterungsschicht hinzugefügt wird.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Fütterungsschicht, indem Sie die vorgefertigte 3 %ige two hydroxyethyl aro-Lösung wie zuvor im Mikrowellenherd erwärmen und die Agro-Lösungsflasche in einem Wasserbad mit 45 °C ausgleichen. Geben Sie ein Milliliter der 3 %igen Agro-Lösung mit neun Millilitern warmem Medium in ein 50-Milliliter-Konischglas und mischen Sie vorsichtig durch sanftes Umstülpen, um die Aros mit dem Medium zu vermengen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Nach der Behandlung des Gemischs mit BB-Chloramin fügen Sie vorsichtig ein Milliliter des Gemischs in jedes Brunnen einer 6-Brunnen-Kulturplatte hinzu, die die untere und weiche Schicht enthält.Danach die sechswellige Kulturplatte horizontal auf eine flache Oberfläche bei vier Grad Celsius stellen und mindestens 15 Minuten lang ruhen lassen, damit das Gemisch gerinnen kann. Sobald die Futtererschicht erstarrt ist, die Platte in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Bader, wiederholen Sie dieses Fütterungsverfahren wöchentlich, indem Sie eine Milliliter der 0,3 %igen Agarose-Medium-Behandlungslösung auf die bestehende Futtererschicht auftragen, um die Zellen mit frischem Medium zu versorgen, bis die Koloniebildung beobachtet wird.Nach zweieinhalb Wochen Zellwachstum im weichen Agar wird die Kolonieanzahl in jedem Well gezählt. Um die Quantifizierung zu erleichtern, drucken Sie ein Raster auf eine Folie und befestigen Sie diese am Sechs-Well-Platte, um die Position der Zellen während des Zählens zu bestimmen. Die Koloniengröße wird anhand des Durchmessers jeder Kolonie quantifiziert und variiert; definieren Sie im Voraus eine Referenzkoloniengröße, um festzulegen, welche Kolonien bewertet werden sollen.Beispielsweise werden hier Kolonien mit einer Größe von 70 Mikrometern oder größer in die Datenanalyse einbezogen. Nach der Zählung verschließen Sie die 6-Loch-Kulturplatte mit Parafilm, um zu verhindern, dass die Gele austrocknen. Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius, um eine weitere Koloniebildung zu verhindern und für eine spätere Zählung aufzubewahren.Die Ergebnisse zeigen, dass BB-Chloramin die Bildung von Kolonien aus MC 10 DCIS-Zellen in Gegenwart eines Pad-Inhibitors signifikant hemmt. Im Vergleich zur DMSO-Kontrolle war sowohl die Koloniebildung als auch die Koloniengröße verringert. Die Größe der Kolonien von BB-Chloramin-behandelten MCF 10 DCIS-Zellen lag vorwiegend im Bereich von 20 bis 100 Mikrometern.Während die Größe der Kolonien in der DMSO-Kontrolle nach zweieinhalb Wochen Wachstum einen größeren Bereich von 70 bis 150 Mikrometern aufwies, wurden Kolonien, die größer als 70 Mikrometer waren, gezählt und analysiert. In der DMSO-Kontrolle gab es durchschnittlich etwa 3.500 Kolonien, während in der mit BB-Chloramin behandelten Gruppe nur ungefähr 2.000 Kolonien beobachtet wurden. Nach zweieinhalb Wochen weicher Agar-Kultur entspricht dies einer Abnahme der durchschnittlichen Koloniebildung um 44 % in Gegenwart von einem Mikromolar BB-Chloramin, was eine signifikante tumorhemmende Wirkung des PAD-Inhibitors auf Brustkrebszellen anzeigt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Reagenzien und Geräte vorab anzuwärmen, um zu verhindern, dass die Lösungen beim Umgang erstarren, und vielen Dank fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

Dieses Video beschreibt einen Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien, um die Auswirkungen eines PADI-Enzyminhibitors und BB-Cl-Amidin auf die Tumorigenität von Brustkrebs in vitro zu testen. Dieser Assay ermöglicht auch die quantitative Beurteilung des Zelltransformationspotenzials im Rahmen genetischer Störungen.

Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien: Eine Methode zum Testen der Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen

Dieses Video beschreibt den Koloniebildungs-Assay, der hilft, die Fähigkeit von Lungenkrebszellen zu bestimmen, sich unbegrenzt zu vermehren und einzelne Kolonien zu bilden. Wir können die Wirkung eines Antikrebsmittels auf die koloniebildenden Zellen analysieren, indem wir die Veränderungen in der Anzahl und/oder Größe der resultierenden Kolonien analysieren.

Colony Formation Assay: Bewertung der Wirksamkeit von Antikrebsmitteln auf koloniebildende Lungenkrebszellen

Dieses Video beschreibt das Protokoll für Methylcellulose-basierte Koloniebildungseinheiten oder CFU-Assays, die helfen, die Anzahl der Kolonien zu identifizieren und zu zählen, die von leukämischen Zellen als Reaktion auf die Behandlung mit Antikrebspräparaten gebildet werden.

CFU-Assay auf Methylcellulose-Basis: Eine Methode zur Bestimmung der Wirkung von Anti-Krebs-Wirkstoffen auf die Koloniebildung in leukämischen Zellen

Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine Methode, die verwendet wird, um zelluläres Verankerungsunabhängiges Wachstum in vitro zu bestätigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine stringente Methode zum Nachweis des tumorigenen Potenzials transformierter Zellen und der tumorsuppressiven Wirkung von Proteinen auf transformierte Zellen zu veranschaulichen.

Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Dieses Verfahren wird zeigen, wie wir die Anti-NFκB- und Anti-Krebs-Stammzellaktivität eines Aspirin-Fumarat-Prodrugs synthetisiert und charakterisiert haben.

Synthese und Charakterisierung eines Aspirin-Fumarat Prodrug, die NFkB-Aktivität hemmt und Brustkrebs-Stammzellen

Es ist oft notwendig, die potenzielle Zytotoxizität einer Reihe von Verbindungen auf kultivierten Zellen zu bewerten. Hier beschreiben wir eine Strategie, um auf toxische Verbindungen zuverlässig im 96-Well-Format zu überprüfen.

Eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum und das Überleben in kultivierten Säugetierzellen bei niedrigem bis moderatem Durchsatz beeinflussen

Der In-vitro-Zellinvasionstest wird verwendet, um das Potenzial von Krebsmetastasen zu messen, indem das zelluläre Potenzial für Invasion und Migration mithilfe von Zellkultureinsätzen, die Proteinmatrix enthalten, quantifiziert wird. Die Zellen werden herausgefordert, durch die Proteinmatrix und eine poröse Membran in Richtung eines Chemoattractants zu wandern und dann durch Lichtmikroskopie quantifiziert zu werden.

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

Dieses Protokoll bietet experimentelle In-vitro-Werkzeuge zur Bewertung der Transformation menschlicher Brustzellen. Detaillierte Schritte zur Nachverfolgung der Zellproliferationsrate, der verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität und der Verteilung von Zelllinien in 3D-Kulturen mit Kellermembranmatrix werden beschrieben.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Dieses experimentelle Protokoll bietet eine stabile, kosteneffiziente und effiziente Methode, die lncRNA-Knockdown mit koloniebildenden Assays kombiniert, um die Wirkung von lncRNA auf die Proliferation von Osteosarkomzellen zu quantifizieren.

Kolonienbildungsassay zur Erkennung der Proliferationskapazität von LncRNA-Knockdown-Osteosarkomzellen

Lernen Sie den Weichagar-Kolonienbildungsassay zur Bewertung der Tumorigenität von Brustkrebszellen unter Verwendung des PADI-Inhibitors BB-Cl-amidine. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Zellproliferation in semi-festen Matrices.

Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

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