Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Effekt einer Behandlung auf die Fähigkeit von Zellen, in semifesten Matrizen zu proliferieren, quantitativ zu bestimmen, da eine verbesserte Fähigkeit ein Kennzeichen der Tumorigenität von Zellen ist. Mithilfe des Weichagar-Assays wird die Tumorigenität anhand der Fähigkeit einer Zelle gemessen, Kolonien innerhalb eines semifesten AROS-Gels zu bilden. Da nicht transformierte Zellen in dieser Umgebung nicht schnell proliferieren können, wird das semifeste AROS-Gel hergestellt, indem zunächst eine 0,6 %ige AROS-Unterschicht angelegt wird. Anschließend wird eine Zell-enthaltende 0,3 %ige AROS-Gelschicht über der Unterschicht hinzugefügt.

In diesem Assay werden die experimentellen Zellen mit einem Inhibitor der Peptidyl-Arginin-Desaminase oder PAD-Enzyms behandelt, das von Dr. Subramanian entwickelt wurde. Wöchentlich wird eine zusätzliche Fütterungsschicht hinzugefügt, die aus einem 0,3 %igen Agarosegel mit oder ohne Behandlung besteht. Der letzte Schritt besteht darin, die Anzahl der Kolonien, die größer als 70 Mikrometer sind, zur Analyse zu zählen.

Schließlich wird die invertierte Mikroskopie verwendet, um den Unterschied in der Kolonieanzahl zwischen der Kontroll- und der Behandlungsgruppe zu zeigen. Hallo, mein Name ist Achi Huta. Ich bin Doktorandin im Labor von Dr. Scott Kros am Baker Institute for Animal Health.

An der Cornell University kann der Soft-Tiger-Koloniebildungs-Assay dabei helfen, zentrale Fragen der Krebsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Tumorgenität einer Vielzahl von Krebszellen hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, Hormonen und zahlreichen anderen Behandlungsbedingungen zu bewerten. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 3 % Two Hydroxyethyl Aros in einer sauberen, trockenen 100-Milliliter-Glasflasche vorbereiten. Geben Sie 0,9 Gramm Two Hydroxyethyl Aros hinzu, gefolgt von 30 Millilitern destilliertem Wasser.

Erhitzen Sie die Mischung für 15 Sekunden in der Mikrowelle und schwenken Sie sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das AROS-Pulver vollständig gelöst ist. Anschließend sterilisieren Sie die Flasche mit der Lösung im Autoklaven für 15 Minuten.

Lassen Sie die Agros-Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Vor der weiteren Verwendung erwärmen Sie mehrere 5-Milliliter- und 10-Milliliter-Pipetten in einem 37 °C-Brutschrank vor, um die Verfestigung des Aros in der Pipette zu verhindern. Wenn Sie teilweise arbeiten, lösen Sie den Flaschenverschluss und erwärmen die vorgefertigte 3 %ige HYDROXYETHYL-Aro-Lösung im Mikrowellenofen für 15 Sekunden.

Danach die Lösung vorsichtig schwenken und weitere 15 Sekunden mikrowellen. Beim Schwenken der ARO-Lösung Vorsicht walten lassen, da die Lösung sich bei Luftkontakt nach oben hin ausdehnt und überschäumen kann, wenn sich noch fester Gelrest im Mikrowellenbehältnis befindet. Um eine vorzeitige Vergelung der Agro-Lösung zu verhindern, das Gefäß mit der ARO-Lösung in den nächsten Schritten noch einige Sekunden in einem 45 Grad Celsius warmen Wasserbad belassen.

Als Nächstes übertragen Sie 12 Milliliter vorgewärmtes Medium unter Verwendung der vorgewärmten Pipetten in ein steriles 50-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie sofort 3 Milliliter der 3 %igen Aros-Lösung hinzu und mischen Sie das Aros vorsichtig mit dem Medium, indem Sie das Konischgefäß sanft umdrehen. Anschließend geben Sie vorsichtig 2 Milliliter dieser Mischung in jedes der sechs Wells einer Kulturplatte, wobei keine Luftblasen entstehen dürfen.

Die sechs-Well-Kulturplatte eine Stunde lang horizontal auf einer flachen Oberfläche bei vier Grad Celsius inkubieren, damit sich die Mischung verfestigen kann. Nach dem Erstarren der Mischung die Platte 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Die untere Schicht ist nun gebrauchsfertig.

Ein schwieriger Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass alle Zellen gleichmäßig verteilt werden und dass das geschmolzene Agaros-Gel nicht vor dem Zugabe in jede Mulde erstarrt, um sicherzustellen, dass sich die Sphäroide im Medium vermischen, bevor das flüssige Agaros-Gel zugegeben wird. Zusätzlich werden die Pipetten vorab erwärmt, um zu verhindern, dass die Lösungen während der Handhabung erstarren. Um die zellhaltige Schicht vorzubereiten, lösen Sie zunächst die MCF-10-DCIS-Zellen mit Trypsin ab und verdünnen sie auf eine Zellkonzentration von 40.000 Zellen pro Milliliter. Entnehmen Sie anschließend acht Milliliter Medium mit vorgewärmten Pipetten und überführen Sie diese in ein steriles 50-Milliliter-Konischglas.

Geben Sie sofort zwei Milliliter 3 % Aros in das kegelförmige Reagenzglas und mischen Sie vorsichtig durch vorsichtiges Umstülpen, um das Aros mit dem Medium zu vermengen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Entnehmen Sie anschließend zwei Milliliter der Zellen und behandeln Sie diese mit zwei Mikromolar BB-Chloramin in DMSO oder allein mit DMSO als Kontrolle. Nach der Behandlung mischen Sie die Zellen mit 0,6 % Aros in einer Verdünnung im Verhältnis 1:1, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar BB-Chloramin zu erreichen.

Anschießend ein Milliliter der Zell-Aros-Mischung entnehmen und vorsichtig auf die untere Schicht der Sechs-Loch-Kulturplatte geben. Die Sechs-Loch-Kulturplatte horizontal auf eine flache Oberfläche bei vier Grad Celsius für mindestens 15 Minuten stellen, damit die obere Schicht gerinnen kann. Nachdem die Mischung erstarrt ist, die Platte eine Woche lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen, bevor die Fütterungsschicht hinzugefügt wird.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Fütterungsschicht, indem Sie die vorgefertigte 3 %ige two hydroxyethyl aro-Lösung wie zuvor im Mikrowellenherd erwärmen und die Agro-Lösungsflasche in einem Wasserbad mit 45 °C ausgleichen. Geben Sie ein Milliliter der 3 %igen Agro-Lösung mit neun Millilitern warmem Medium in ein 50-Milliliter-Konischglas und mischen Sie vorsichtig durch sanftes Umstülpen, um die Aros mit dem Medium zu vermengen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Nach der Behandlung des Gemischs mit BB-Chloramin fügen Sie vorsichtig ein Milliliter des Gemischs in jedes Brunnen einer 6-Brunnen-Kulturplatte hinzu, die die untere und weiche Schicht enthält.

Danach die sechswellige Kulturplatte horizontal auf eine flache Oberfläche bei vier Grad Celsius stellen und mindestens 15 Minuten lang ruhen lassen, damit das Gemisch gerinnen kann. Sobald die Futtererschicht erstarrt ist, die Platte in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Bader, wiederholen Sie dieses Fütterungsverfahren wöchentlich, indem Sie eine Milliliter der 0,3 %igen Agarose-Medium-Behandlungslösung auf die bestehende Futtererschicht auftragen, um die Zellen mit frischem Medium zu versorgen, bis die Koloniebildung beobachtet wird.

Nach zweieinhalb Wochen Zellwachstum im weichen Agar wird die Kolonieanzahl in jedem Well gezählt. Um die Quantifizierung zu erleichtern, drucken Sie ein Raster auf eine Folie und befestigen Sie diese am Sechs-Well-Platte, um die Position der Zellen während des Zählens zu bestimmen. Die Koloniengröße wird anhand des Durchmessers jeder Kolonie quantifiziert und variiert; definieren Sie im Voraus eine Referenzkoloniengröße, um festzulegen, welche Kolonien bewertet werden sollen.

Beispielsweise werden hier Kolonien mit einer Größe von 70 Mikrometern oder größer in die Datenanalyse einbezogen. Nach der Zählung verschließen Sie die 6-Loch-Kulturplatte mit Parafilm, um zu verhindern, dass die Gele austrocknen. Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius, um eine weitere Koloniebildung zu verhindern und für eine spätere Zählung aufzubewahren.

Die Ergebnisse zeigen, dass BB-Chloramin die Bildung von Kolonien aus MC 10 DCIS-Zellen in Gegenwart eines Pad-Inhibitors signifikant hemmt. Im Vergleich zur DMSO-Kontrolle war sowohl die Koloniebildung als auch die Koloniengröße verringert. Die Größe der Kolonien von BB-Chloramin-behandelten MCF 10 DCIS-Zellen lag vorwiegend im Bereich von 20 bis 100 Mikrometern.

Während die Größe der Kolonien in der DMSO-Kontrolle nach zweieinhalb Wochen Wachstum einen größeren Bereich von 70 bis 150 Mikrometern aufwies, wurden Kolonien, die größer als 70 Mikrometer waren, gezählt und analysiert. In der DMSO-Kontrolle gab es durchschnittlich etwa 3.500 Kolonien, während in der mit BB-Chloramin behandelten Gruppe nur ungefähr 2.000 Kolonien beobachtet wurden. Nach zweieinhalb Wochen weicher Agar-Kultur entspricht dies einer Abnahme der durchschnittlichen Koloniebildung um 44 % in Gegenwart von einem Mikromolar BB-Chloramin, was eine signifikante tumorhemmende Wirkung des PAD-Inhibitors auf Brustkrebszellen anzeigt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Reagenzien und Geräte vorab anzuwärmen, um zu verhindern, dass die Lösungen beim Umgang erstarren, und vielen Dank fürs Zuschauen.