Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung der Behandlung auf die Fähigkeit von Zellen, sich in halbfesten Matrizen zu vermehren, quantitativ zu bestimmen, da eine verbesserte Fähigkeit ein Kennzeichen der Geschlechtlichkeit von Zelltumoren ist: Mit dem Soft-Agar-Assay wird die Geschlechtlichkeit des Tumors durch die Fähigkeit einer Zelle gemessen, Kolonien innerhalb eines halbfesten AROS-Gels zu bilden. Da nicht transformierte Zellen in dieser Umgebung nicht in der Lage sind, sich schnell zu vermehren, wird das halbfeste AROS-Gel hergestellt, indem zunächst eine 0,6%ige AROS-Bodenschicht hergestellt wird. Als nächstes wird eine Zelle mit 0,3 % AROS-Gelschicht über der unteren Schicht hinzugefügt.

In diesem Assay werden die experimentellen Zellen mit einem von Dr. Subramanian entwickelten Inhibitor von Peptidyl, Arginin, Dase oder Pad-Enzym behandelt. Jede Woche wird eine zusätzliche Fütterungsschicht hinzugefügt, die aus einem 0,3%Aros-Gel mit oder ohne Behandlung besteht. Der letzte Schritt besteht darin, die Anzahl der Kolonien zu zählen, die für die Analyse größer als 70 Mikrometer sind.

Letztendlich wird die inverse Mikroskopie verwendet, um den Unterschied in der Koloniezahl zwischen der Kontroll- und der Behandlungsgruppe zu zeigen. Hallo, mein Name ist Achi Huta. Ich bin Doktorand im Labor von Dr. Scott Kros am Baker Institute for Animal Health.

An der Cornell University kann der Assay zur Bildung von Soft-Tiger-Kolonien dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Beurteilung der Tumorgenizität einer Vielzahl von Krebszellen im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, Hormonen und einer Vielzahl anderer Behandlungsbedingungen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie 3%zwei Hydroxyethylaros in eine saubere, trockene 100-Milliliter-Glasflasche aufbereiten. Fügen Sie 0,9 Gramm von zwei Hydroxyethylaros hinzu, gefolgt von 30 Millilitern destilliertem Wasser.

Die Mischung 15 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen und vorsichtig schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis sich das AROS-Pulver vollständig aufgelöst hat. Als nächstes autoklavieren Sie die Lösung mit der Flasche für 15 Minuten.

Lassen Sie die Agros-Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Bevor Sie fortfahren, verwenden Sie mehrere Fünf-Milliliter- und 10-Milliliter-Pipetten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um zu verhindern, dass sich die Aros in der Pipette verfestigen. Bei teilweiser Handhabung den Flaschendeckel lösen und die vorgefertigte 3%zwei HYDROXYETHYL aro-Lösung 15 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen.

Dann die Lösung vorsichtig schwenken und weitere 15 Sekunden in die Mikrowelle stellen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die ARO-Lösung schwenken, da die Lösung aufsteigt, wenn sie der Luft ausgesetzt wird, und überlaufen kann, wenn sich feste Gelreste in der Mikrowelle der Flasche befinden. Bewahren Sie die Flasche mit der ARO-Lösung während der nächsten Schritte noch einige Sekunden in einem 45 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, um zu verhindern, dass sich die Agro-Lösung vorzeitig verfestigt.

Übertragen Sie anschließend 12 Milliliter erwärmtes Medium mit den Prewarm-Pipetten in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie sofort drei Milliliter der 3%igen Aros-Lösung hinzu und drehen Sie das konische Röhrchen vorsichtig um, um das Aros mit dem Medium zu vermischen. Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter dieser Mischung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Kulturplatte, ohne Luftblasen zu bilden.

Inkubieren Sie die Sechs-Well-Kulturplatte eine Stunde lang horizontal auf einer ebenen Fläche bei vier Grad Celsius, damit sich die Mischung verfestigen kann. Nachdem die Mischung fest geworden ist, stellen Sie die Platte für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Die untere Schicht ist nun einsatzbereit.

Ein schwieriger Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass alle Zellen gleichmäßig verteilt sind und dass sich die geschmolzene Agra-Hülle vor der Zugabe zu jeder Vertiefung nicht verfestigt, um sicherzustellen, dass das Seltz vor der Zugabe des flüssigen Agrigels in das Medium gemischt wird. Zusätzlich werden die Rohre vorher vorgewärmt, um zu verhindern, dass sich die Lösungen während der Handhabung verfestigen. Zur Vorbereitung der zellhaltigen Schicht werden zunächst MCF 10 DCIS-Zellen mit Trypsin beäugt und auf eine Zellkonzentration von 40.000 Zellen pro Milliliter verdünnt, dann acht Milliliter Medium mit vorgewärmten Pipetten entnommen und in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Geben Sie sofort zwei Milliliter 3%aros in das konische Rohr und drehen Sie es vorsichtig um, um das Aroma mit dem Medium zu vermischen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Als nächstes nehmen Sie zwei Milliliter der Zellen und behandeln Sie sie mit zwei mikromolaren BB-Chloramin in DMSO oder DMSO allein als Kontrolle nach der Behandlung, mischen Sie die Zellen mit den 0,6%aros in einer Eins-zu-Eins-Verdünnung, um eine Endkonzentration von einem mikromolaren BB-Chloramin zu erreichen.

Nehmen Sie dann einen Milliliter der Zellmischung und geben Sie sie vorsichtig auf die untere Schicht der Sechs-Well-Kulturplatte. Legen Sie die Sechs-Well-Kulturplatte mindestens 15 Minuten lang horizontal bei vier Grad Celsius auf eine ebene Fläche, damit sich die oberste Schicht verfestigen kann. Nachdem die Mischung fest geworden ist, legen Sie die Platte für eine Woche in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, bevor Sie die Futterschicht hinzufügen.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Zuführschicht, indem Sie die vorgefertigte 3%zwei-Hydroxyethyl-Aro-Lösung wie zuvor in der Mikrowelle erhitzen und die Agro-Lösungsflasche in einem 45 Grad Celsius warmen Wasserbad äquilibrieren, einen Milliliter 3%ige Agro-Lösung mit neun Millilitern warmem Medium in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mischen und vorsichtig umdrehen, um die Aros mit dem Medium zu vermischen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Nach der Behandlung der Mischung mit BB-Chloramin geben Sie vorsichtig einen Milliliter der Mischung in jede Vertiefung der sechs Vertiefungen der Kulturplatte, die die untere und die weiche Schicht enthält.

Stellen Sie dann die Sechs-Well-Kulturplatte mindestens 15 Minuten lang horizontal bei vier Grad Celsius auf eine ebene Fläche, damit sich die Mischung verfestigen kann. Nachdem sich die Feederschicht verfestigt hat, legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Wiederholen Sie diesen Fütterungsvorgang wöchentlich, indem Sie einen Milliliter 0,3%ige Agros-Medium-Behandlungslösung auf die vorhandene Feeder-Schicht auffüllen, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet wird.

Nach zweieinhalb Wochen Zellwachstum im weichen Agar wird die Koloniezahl in jeder Vertiefung gezählt. Drucken Sie mit einem Lichtmikroskop zur Erleichterung der Quantifizierung ein Gitter auf eine Folie und befestigen Sie das Gitter an der Sechs-Well-Platte, um zu lokalisieren, wo sich die Zellen während der Zählung befinden. Die Koloniegröße wird durch den Durchmesser jeder Kolonie quantifiziert und variiert. Legen Sie eine Referenzkoloniegröße fest, um zu bestimmen, welche Kolonien bewertet werden.

Hier werden beispielsweise Koloniegrößen von 70 Mikrometern oder größer in die Datenanalyse einbezogen. Versiegeln Sie nach dem Zählen die Sechs-Well-Kulturplatte mit Paraform, um ein Austrocknen der Gele zu verhindern. Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius, um eine weitere Koloniebildung zu verhindern und für zukünftige Zählungen.

Die Ergebnisse zeigen, dass BB-Chloramin die Bildung von MC 10 DCIS-Zell-abgeleiteten Kolonien in Gegenwart eines Pad-Inhibitors signifikant hemmt. Es gab eine Verringerung sowohl der Koloniebildung als auch der Koloniegröße im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Die Größe der Kolonien für mit BB-Chloramin behandelte MCF 10 DCIS-Zellen lag überwiegend im Bereich von 20 bis 100 Mikrometern.

Während die Größe der Kolonien für die DMSO-Kontrolle eine größere Bandbreite von 70 bis 150 Mikrometern aufwies, wurden nach zweieinhalb Wochen Wachstum Kolonien größer als 70 Mikrometer gezählt und analysiert. Es gab durchschnittlich etwa 3.500 Kolonien in der DMSO-Kontrolle, während nur etwa 2000 Kolonien in der mit BB Chloramin behandelten Gruppe beobachtet wurden. Nach zweieinhalb Wochen sanfter Landwirtschaft entspricht dies einem Rückgang der durchschnittlichen Koloniebildung um 44 % in Gegenwart von einem mikromolaren BB Chloramin, was auf eine signifikante tumorogene Hemmung von Brustkrebszellen durch den Pad-Inhibitor hinweist.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien und Geräte vorher vorzuwärmen, um zu vermeiden, dass sich die Lösungen bei der Handhabung verfestigen, und danke fürs Zuschauen.