Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Migrationseigenschaften von Zellen in 3D-physiologisch relevanten Umgebungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst in ein inneres Kollagengel eingesät werden, das dann von einem zellfreien äußeren Kollagengel mit den gewünschten Matrixeigenschaften umschlossen wird. Als nächstes werden die Zellen in das äußere Gel eindringen und wandern lassen, während dessen sie überwacht und quantitativ analysiert werden können.

Letztendlich wird dieser konzentrische Gel-Assay verwendet, um zu zeigen, wie das Zellmigrationsverhalten durch die biophysikalischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix beeinflusst wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Transfer-Assay oder dem Scratch-Assay besteht darin, dass die Migration der Zelle in einer physiologisch relevanten Vertragsumgebung stattfindet, deren strukturelle und biophysikalische Eigenschaften sehr einfach zu kontrollieren sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist sehr wichtig, da die Bildung des Konzentrats des inneren Fräsgelsystems sehr heikel ist.

Eine geeignete Gelschnittstelle ist sehr wichtig für den Erfolg dieses Experiments, das manchmal etwas schwierig zu erreichen sein kann. Beginnen Sie mit einer Kultur von MD MBA 2 31 Zellen, die bereit sind, aus T 25-Kolben mit 80 % Co-Flanz zu ernten. Zuerst wird Trypsin von den Zellen mit einem Milliliter Lösung pro Kolben hergestellt.

Sammeln Sie dann die Zellen als Pellet mit einer Kraft von 200 G für vier Minuten, verwerfen Sie die Snat und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Kultur. Medien. Messen Sie nun die Zelldichte mit einem Hämozytometer und bestimmen Sie das Volumen, das für 100 Millionen Zellen pro Milliliter benötigt wird. Schleudern Sie dann die Zellen vier Minuten lang bei 200 g herunter.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet gründlich in das erforderliche Volumen des serumfreien Kulturmediums. Diese Federung hat das 10-fache der endgültigen Sitzkonzentration. Um mit dem Sammeln der erforderlichen Stammlösungen in einem Eiskübel zu beginnen, enthalten sie 10 XPBS milq Wasser und 0,1 molare Natriumhydroxid.

Kühlen Sie auch mehrere Mikrozentrifugenröhrchen unter einer Haube ab, behalten Sie die sterile Technik bei und aliquotieren Sie die gewünschte Kollagenmenge für 50 Mikroliter von 2,4 Milligramm pro Milliliter innerer Gellösung. Fügen Sie dann langsam fünf Mikroliter à 10 XPBS zu dem abgemessenen Kollagen hinzu. Schwenken Sie das Rohr, während das PBS hinzugefügt wird, aber vermeiden Sie es, Blasen zu bilden.

Stellen Sie anschließend den pH-Wert der Mischung mit der Basislösung auf 7,4 ein. In der Regel reichen fünf Mikroliter aus. Eine Anleitung zur Fehlerbehebung finden Sie im Textprotokoll.

Erhöhen Sie schließlich das Volumen auf 45 Mikroliter mit serumfreiem Kulturmedium, um Platz für die 10-fache Zellsuspension zu lassen. Geben Sie zu Beginn fünf Mikroliter 10 x Zellsuspension in die Kollagenlösung und resuspendieren Sie die Zellen gründlich in der Lösung, ohne Luftblasen zu bilden. Geben Sie nun auf eine auf Glas vorwärmte Bodenplatte 20 Mikroliter der Suspension in die Mitte.

Nun, es bildet ein kuppelförmiges Tröpfchen, wenn sich eine Blase bildet, reißt sie schnell auf oder saugt sie auf, ohne eine Sauerei zu verursachen. Das Gel richtig zu gießen, kann sehr schwierig sein, insbesondere bei sehr viskosen Lösungen wie Kollagen. Versuchen Sie, Blasenbildung so weit wie möglich zu vermeiden und schwenken Sie die Lösung nicht, sobald sie bereit ist zu polymerisieren, da eine Schwellung zu einer Ausrichtung der Kunstfasern führen kann.

Stellen Sie nun die Schale für 45 Minuten wieder in den Inkubator, um die innere Schicht 15 Minuten vor Ende der Inkubation polymerisieren zu lassen. Bereiten Sie 200 Mikroliter der äußeren Kollagengellösung auf Eis vor. Aliquotieren Sie zunächst das erforderliche Volumen an Stammkollagen.

Zweitens fügen Sie langsam 20 Mikroliter 10 XPBS unter leichtem Schwenken hinzu. Stellen Sie dann den pH-Wert wie bisher auf 7,4 ein und bringen Sie die Lösung mit Milli Q Wasser auf 200 Mikroliter. Nehmen Sie nun die Schale aus dem Inkubator und geben Sie vorsichtig 180 Mikroliter der äußeren Gellösung auf die innere Gelkuppel.

Dies sollte die innere Lösung vollständig bedecken und die Vertiefung füllen. Rühren Sie die Lösung nicht um und vermeiden Sie es, die innere Gellösung zu berühren. Wenn sich beim Ausstoßen der äußeren Lösung eine Blase bildet, zerreißen Sie sie schnell oder saugen Sie sie zurück in die Pipette.

Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass eine geeignete Gelschnittstelle erhalten wird. Der Schlüssel zu diesem Schritt ist die Zugabe der äußeren Gellösung. Wenn das innere Gel noch nicht zertifiziert ist.

Die Gelierungskinetik kann je nach Polymerisationsbedingungen variieren, und es ist wichtig, diesen Zustand vorher zu optimieren: Um das äußere Gel polymerisieren zu lassen, stellen Sie die Schale für 45 Minuten in den Inkubator zurück. Nach 45 Minuten sollte das Gel ziemlich fest sein, kann aber immer noch vorsichtig gelöst werden. Fügen Sie zwei Milliliter warmes Medium hinzu, um das Gel vollständig einzutauchen. Dies vervollständigt die konzentrische Gelkultur, die alle zwei bis drei Tage mit frischem Medium bereitgestellt wird.

Innerhalb weniger Tage beginnen die Zellen in die äußere Matrix zu wandern, um ihre Wanderung zu beobachten und die Zellen mit einem fluoreszierenden Tracker zu färben. Ersetzen Sie die zwei Milliliter des Mediums durch frisches Medium mit fünf Mikrolitern Farbstoff und inkubieren Sie es 30 Minuten lang nach der Inkubationszeit, waschen Sie die Kultur mit einem Milliliter PB S3 zweimal für zwei bis drei Minuten pro Waschgang. Füllen Sie die Schüssel nach dem Waschen wieder mit normalem Medium auf.

Stellen Sie dann die Schüssel auf einem klimakontrollierten Mikroskop auf. Verwenden Sie nun eine Einstellung für das Nutzungsvolumen, um die äußeren Gelbereiche neben der Geloberfläche zu scannen. In der Regel wird in quadratischen Ansichten mit einer Dicke von 647 Mikrometern und einer Dicke von 100 Mikrometern in Intervallen von fünf Mikrometern auf dem ZS-Stapel gescannt.

Scannen Sie dann die Zwischenbereiche und scannen Sie schließlich die Außenränder des Gels. Schließen Sie Bereiche innerhalb von 50 Mikrometern um die untere, obere oder seitliche Oberfläche aus, um Zellen zu vermeiden, die möglicherweise unter einem Kanteneffekt leiden. Um die Bewegung der Zellen aus den gesammelten Daten zu analysieren, öffnen Sie zunächst die Bilddateien in einer Datenanalysesoftware wie imas.

Wählen Sie zunächst den Befehl surpass und dann die Befehlsoberfläche aus. Dadurch wird die Option zum Verfolgen von Oberflächen angezeigt. Wählen Sie im Laufe der Zeit den interessierenden Bereich innerhalb des Datensatzes aus, d. h. die kartesischen Koordinaten und den Zeitrahmen.

Subtrahieren Sie als Nächstes den Hintergrund von der interessierenden Region. Um zu vermeiden, dass eine Zelle durch die Hintergrundeliminierung verloren geht, wählen Sie die größte Kugel aus, die in das Objekt passt. Teilen Sie nun die verbundenen Objekte, indem Sie den Durchmesser des Kernpunkts auswählen, und fahren Sie mit der Klassifizierung aller Kernpunkte fort.

Der nächste Schritt besteht darin, die Oberfläche Jetzt manuell zu klassifizieren. Gruppieren Sie Kernpunkte, die auf dasselbe Objekt verweisen. Tun Sie dies zwischen allen Zeitpunkten im interessierenden Bereich.

Verfolgen Sie abschließend die Objekte, wenn die Nachverfolgung abgeschlossen ist, klassifizieren Sie die Objektverfolgungen und geben Sie dann den quantitativen Datensatz aus, der in einer Tabelle analysiert werden soll. Nach einigen Tagen konzentrischer Gelkulturen durchbrachen die Zellen die innere äußere Gelgrenzfläche und begannen, in das äußere Gel einzudringen. Die Zellpopulation breitete sich überwiegend radial nach außen aus.

Es wurde die Bewegung von Zellen im äußeren Gel verschiedener Kollagendichten verglichen. Die Bildgebung wurde über einen Zeitraum von acht Stunden durchgeführt, und von jeder Probe wurden etwa 200 Zelltrajektorien berechnet. Zellen in der dünnsten Matrix haben die geringste Entfernung zurückgelegt.

Bei dieser Berechnung wurden alle Zellen berücksichtigt, nicht nur die Zellen, die radial nach außen wandern. In allen Fällen war die zurückgelegte Gesamtstrecke größer als die Nettoverdrängung. Als erwartete Persistenz wurde ein Verhältnis zwischen Verschiebung und Entfernung berechnet.

Der Persistenzwert von 0,4 deutet darauf hin, dass diese Zellen eine intrinsisch schwache gerichtete Migration aufwiesen. Berechnungen der mittleren Geschwindigkeit zeigten, dass die Kollagendichte die Geschwindigkeit der Zellen nicht beeinflusste. Es ist möglich, dass die Porengröße der Matrix und die Kollagendichte, die umgekehrt miteinander verbunden sind, den gegenteiligen Effekt auf die Migrationsgeschwindigkeit hatten und sich somit gegenseitig ausglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein konzentrisches Gelsystem aufbaut und wie man diese Migration von Zellen in einer 3D-Umgebung untersucht. Nach diesem Verfahren können Sie viele andere Dinge tun, wie z.B. Zellextraktion und Microarray-Analyse, bei denen Sie versuchen können, zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie viel bestimmte Proteine zu verschiedenen Zeitpunkten der Migration exprimiert werden.