Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Rolle der mechanischen Dehnung auf die Zellmechanobiologie nahezu in Echtzeit zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein System mit flexiblen Membranen konstruiert wird, auf dem Zellen gezüchtet und gestreckt werden. In einem zweiten Schritt wird die Membran gedehnt, um die Motorzahlen mit der Membrandehnung zu kalibrieren.

Als nächstes werden Lungenepithelzellen der Maus gedehnt und Zellkerne abgebildet. Um zu zeigen, dass der Membranstamm auf Zellen übertragen wird, bauten die Stretcher dann in das A FM für die Nanoindentation ein, um die Steifigkeit der einzelnen Zellen vor und nach der Dehnung zu messen. Die Ergebnisse zeigen eine direkte Schädigung der Zellen durch die angewendete Dehnung.

Ebenfalls auf der Grundlage der Fluoreszenzbildgebung wurde gezeigt, dass die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies mit der Dehnung zunimmt. Nun, diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der mechanischen Lungenbiologie beantworten, z. B. ob die Epithelzellen durch mechanische Beatmung verletzt werden können oder nicht. Diese Methode kann Einblicke in die Lungenzelle, die mechanische Biologie und kann auch auf andere Weichteile wie Leber- oder Wachstumsplattenschnitte angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der unkonventionellen Kombination von Werkzeugen, die in diesen Experimenten verwendet werden, wie z. B. dem Rasterkraftmikroskop, Schwierigkeiten haben. Bereiten Sie zunächst eine kollagenbeschichtete PDMS-Membran vor, die für die Verwendung in Zellkulturen modifiziert wurde, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als nächstes säen Sie Lungenepithelzellen von Mäusen mit 2,5 Millionen Zellen pro Vertiefung auf eine sterile, flexible, mit Kollagen beschichtete Membran.

Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, bis die Zellen die Konfluenz erreichen. Stanzen Sie dann mit einem 1,5-Millimeter-Biopsiestanzer jeweils zwei Löcher in jede der sechs Klemmlaschen, 20,5 Millimeter von der Mitte des Konstrukts entfernt, wenn keine Vorspannung gewünscht ist. Und entfernen Sie das Zellkulturmedium.

Stellen Sie sicher, dass sich der mechanische Aktuator in einer Dehnungs-Null-Position befindet, und positionieren Sie die Membran so auf dem Spanner, dass die Stanzlöcher mit den Stiften und den Klemmen übereinstimmen. Setzen Sie die oberen Klemmen ein und ziehen Sie die Schrauben nacheinander an verschiedenen Seiten fest. Fügen Sie einen Milliliter Zellkulturmedium hinzu, bevor Sie das Gerät auf den Mikroskoptisch stellen.

Zentrieren Sie das Gerät auf dem Strahlengang. Befestigen Sie als Nächstes das Gerät an der Bühne. Fokussieren Sie sich auf die Membran, indem Sie die Positionen in der Ebene und in der Vertikalen des mechanischen Geräts mit einem Tischregler des Mikroskops im Zieleingangsblock einstellen.

Geben Sie einen Motoranzahlwert ein, der der gewünschten Dehnungsstufe entspricht, die angewendet werden soll. Stellen Sie als Nächstes den Wert im Geschwindigkeitseingabeblock auf 10 U/min oder weniger ein, um das gleiche Feld vor und nach der Dehnung zu beobachten, da sich das Feld in Bezug auf das Mikroskopobjektiv verschieben kann und es möglicherweise erforderlich ist, den Mikroskoptisch während der Dehnung anzupassen. Sobald alles eingestellt ist, klicken Sie auf Go.

Beginnen Sie mit Anpassungen am Rasterkraftmikroskop. Erhöhen Sie die Höhe des FM-Kopfes auf seine maximale Position in Z-Richtung. Setzen Sie dann Extender auf die Beine, um die Ebene anzuheben, an der ein FM-Ausleger die Probe berührt.

Entfernen Sie anschließend die A FM Scannerplatte und das gewünschte Objektiv aus dem Mikroskop. Bringen Sie einen Abstandshalter am Objektiv an und montieren Sie ihn dann wieder am Mikroskop. Setzen Sie dann die Scannerplatte wieder auf den A FM. Die Höhe des Abstandshalters hängt vom Objektiv und der spezifischen FM-Konfiguration ab, aber es ist notwendig, den Abstandshalter zu verwenden, wenn eine optische Abbildung gewünscht wird, da der Beobachtungsplan in Z-Richtung verschoben wird.

Starten Sie anschließend die A FM Software, die optische Mikroskopsoftware und alle notwendigen Lichtquellen, einschließlich der Lichtquelle für Fluoreszenzmessungen. Montieren Sie einen Chip mit einem Cantilever-Strahl mit einer Steifigkeit von 200 Piko-Newton pro Nanometer oder weniger zur Messung des Elastizitätsmoduls lebender Zellen auf dem A FM. Richten Sie dann den Laser aus, montieren Sie als nächstes eine Glasabdeckung auf das Gerät und kalibrieren Sie damit die Auslegersteifigkeit nach Herstellerangaben. Unmittelbar vor der Montage der Membran an der Streckvorrichtung schneiden Sie die Wände auf eine Höhe von etwa einem Millimeter ab.

Dadurch werden die Interferenzen zwischen den Membranwänden und der Wägezelle reduziert. Entfernen Sie dann das Zellkulturmedium und montieren Sie die Membran auf das mechanische Gerät. Platzieren Sie das mechanische Gerät mit dem Adapter mithilfe der Software auf dem Scanner.

Dehnen Sie die Membran vor der Nanoeindrückung auf das gewünschte Zugdehnungsniveau. Geben Sie 0,5 Milliliter oder weniger Medium auf die Zellen, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen, aber achten Sie auch darauf, dass kein Verschütten entsteht, das den FM-Scanner oder das Mikroskop beschädigen könnte. Greifen Sie dann den Ausleger in die Membran ein.

Befolgen Sie das Protokoll des jeweiligen A FM-Geräts, um interessante Bereiche zu scannen. Wenn ein 20%-Stamm auf Zellen angewendet wurde, die auf der Membran ausgesät waren, verdrängten die Zellen 20%Wie hier gezeigt, wurde der Einfluss von Zellen auf die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies in Bronchialepithelzellen unter Verwendung eines kumulativen mitochondrialen Superoxid-Sensors gemessen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. In Ermangelung einer mechanischen Dehnung stieg die ROS-Produktion über 60 Minuten nicht signifikant an, wenn eine einzige Dehnung von 17 % angewendet und aufrechterhalten wurde.

Es gab einen Anstieg der mitochondrialen ROS, der weitere 60 Minuten anhielt, als der mechanische Stretcher in das Rasterkraftmikroskop eingebaut wurde. Der Elastizitätsmodul, Karten von Lungenepithelzellen der Maus vor und nach einer 10%igen Zugdehnung wurden aus den hier skizzierten Regionen erhalten. Es wurden 300 einzelne forcierte Ablenkungskurven über einen Bereich von 40 x 40 Mikrometern aufgezeichnet, die eine Veränderung der Lokalisation von Bereichen mit hohem Modul unter Anwendung von Dehnung zeigen.

Einmal gemeistert, kann die Zelldehnung in 15 Minuten durchgeführt werden. Während eine FM-Nano-Indentation zwei Stunden ordnungsgemäßer Leistung in Anspruch nehmen kann, ist es wichtig, bei diesem Verfahren daran zu denken, die Zellen vorsichtig und dennoch schnell zu behandeln, da die Ergebnisse durch Unruhe und längere Exposition gegenüber der Raumluft negativ beeinflusst werden können, bevor die Daten gemeldet werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem FM eine große Herausforderung sein kann.

Bei der Durchführung dieses Vorgangs müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. alle Flüssigkeiten vom Scanner fernzuhalten.