Name: Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Lernen Sie Live-Cell-Imaging bei mechanischer Dehnung für die Mechanobiologie mit Maus-Lungenepithelzellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung zellulärer Reaktionen auf mechanische Belastung.

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Die Autoren möchten, dass Fedex Institute of Technology an der Universität von Memphis danken für ihre Unterstützung. Die Autoren bedanken sich bei Studenten der Senior Design-Projekt-Gruppe in der Maschinenbau-Abteilung an der Universität von Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer) anerkennen, Daniel Kohn von der Universität von Memphis Engineering Technology-Abteilung für die Motorsteuerung und Dr. Bin Teng und Frau Charlean Luellen für ihre Hilfe in der Zellkultur. Diese Arbeit wurde von K01 HL120912 (ER) und R01 HL123540 (CMW) unterstützt.

1. Aufbau der Membrane mit Well Walls für Retention von Zellkulturmedien (siehe 1D für das Endprodukt) <ol><li> Verwendung Polydimethylsiloxan (PDMS) Platten mit Collagen I beschichtet sind, schneiden die Kontur der flexiblen Membran mit einem Skalpell oder einer Düse. </li><li> Platzieren Sie jede Membran in einer 60 mm Petrischale für die Lagerung. </li><li> Erstellung von Wänden: <ol><li> Mischungs PDMS bei einem 10: 1-Gewichtsverhältnis von Elastomer A bis B (Härter) Elastomer ist. </li><li> Gießen Sie 5 ml vollständig vermischt PDMS in 50 ml Tuben. </li><li> Zeigen 50 ml Röhrchen mit nicht ausgehärteten PDMS horizontal in einem Hybridisierungsofen. </li><li> Verwenden die Rotorfunktion zur Beschichtung der Innenwände der Rohre bei 8 rpm während der Aushärtezeit. Bei RT wird das PDMS vollständig in 2 Tagen ausgehärtet werden. </li><li> Entfernen Sie die PDMS aus der Röhre in einem sterilen Zellkultur Kapuze. </li><li> Mit Hilfe einer neuen Rasierklinge, partitioniert die Zylinder des PDMS in Abschnitte 4 mm in der Höhe. </li><li> Legen Sie die Abschnitte, die als Membran wa dienen wirdlls, in eine Petrischale Behälter, ohne dass die Wände zu werden erhöht. </li></ol></li><li> Auszuwählen und in der Mitte einer Wand des PDMS an einer Membran, während die beiden in der Petrischale erhalten bleibt. </li><li> Ganz sanft ungehärteten PDMS (Verhältnis 10: 1) auf dem äußeren Umfang der Wand, als Klebstoff verwendet werden. Verhindern die Bildung von Zwischenräumen zwischen der Wand und der Membran, da es dort zu Flüssigkeit zurückzuhalten. </li><li> Platzieren Sie jede Petrischale mit den fertigen Membran und in einem Ofen bedeckt bei 70 ° C für 24 Stunden, um zu heilen. </li></ol> 2. Korrelation der Motorumdrehungen mit Clamp Verschiebung oder radiale Wachstum für Kalibrierung (Abbildung 2) <ol><li> Starten Sie die Software die Steuerung des Motors. </li><li> Verdrängen die Klemmen des Geräts mit der manuellen Einstellung der Motorsoftware. </li><li> Messen des Abstands und Aufzeichnung der Motor Zählposition zwischen gegenüberliegenden Klemmen an beiden minimalen und maximalen Verschiebung der Klammern. </li><li> Berechnen der prozentualen Änderung in der distance zwischen den Klammern in Abhängigkeit von der Motorzählung (~ 0-75k Aktivität). Dadurch wird die maximal mögliche Belastung der Membran erreicht anzuzeigen. </li></ol> 3. Anwendung der Stretch auf Maus Lung Epithelzelllinie (MLE12) <ol><li> Samen MLE12 Zellen 2,5 Millionen Zellen auf der flexiblen Membran (Schritt 1) ​​pro Vertiefung innerhalb von zwei Tagen konfluent werden. Die Aussaatdichte für unterschiedliche Zelltypen variieren. </li><li> Sicherzustellen, dass die mechanische Betätigungseinrichtung in einer vollständig entspannten Position. <ol><li> Entfernen von Zellkulturmedien. </li><li> Verwendung von 1,5 mm Biopsieausstanzungen, Punch zwei Löcher in jeder der sechs Klemm (siehe Figur 1D) Laschen der Membran. Die radiale Anordnung der Löcher bestimmt die Menge der Vorspannung der Membran zunächst Erfahrungen. Ausstanzung der Löcher auf einem Radius von 20,5 mm an den Membranzungen wenn keine Vorspannung erwünscht ist. </li><li> Positionieren Sie die Membran auf dem Keilrahmen mit den gestanzten Löchern Schlange mit den Stiften in den Klammern.Zeigen oberen Klemmen vorhanden. Ziehen Sie die Schrauben ein zu einer Zeit wechselseitig. </li><li> 1 ml Zellkulturmedium. </li></ol></li><li> Platzieren der Vorrichtung auf dem Mikroskoptisch Zentrierung der Mitte der Membran mit dem Lichtweg. </li><li> Verwenden Sie Isolierband oder Magneten (wenn möglich), um das Gerät auf die Bühne zu beheben. Sobald festen, steuern die in der Ebene (parallel zur Membran) und vertikalen (z-Richtung) der mechanischen Einrichtung mit der Tischsteuereinrichtung des Mikroskops. </li><li> Bewerben Strecke mit dem vom Hersteller durch die Position und Geschwindigkeit der Motordrehung 20 manuelle Steuerung zur Verfügung gestellte Software. </li></ol> 4. Messung der Mitochondrial reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) <ol><li> Sobald Zellen konfluent, fügen Sie 1-2 ml RT DMEM mit mitochondrialen Superoxid-Anzeige (5 &amp; mgr; M Endkonzentration) direkt auf die Zellen. </li><li> Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Wasche die Zellen vorsichtig dreimal mit Puffer erwärmt in einem Wasserbad auf37 ° C. </li><li> Sofort platzieren die flexible Membran auf dem Keilrahmen (Schritt 2.2) bereits im Rahmen einer aufrechten konfokalen Mikroskop. </li><li> 1 ml DMEM mit Phenolrot-freiem Medium und 25 mM HEPES. </li><li> Stellen Anregungs- / Emissions Filter können 510/580 nm. </li><li> Bild mehrere Felder alle 15 min, um die gewünschte Zeitverlauf der mitochondrialen Superoxid-Produktion zu schaffen. </li><li> Von aufgenommenen Bildern, Histogramme Aufzeichnung der Fluoreszenzintensität in jedem Zeitintervall unter Verwendung von Software in der Lage ist die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität. </li></ol> 5. Anwendung der Stretch und Rasterkraftmikroskopie (AFM) Hinweis: Diese Schritte werden für eine bestimmte AFM und optischen Mikroskop Kombination (Abbildung 4 und Materialliste) versehen ist. <ol><li> Bereiten Sie das AFM für das Experiment. <ol><li> Erhöhen die Höhe des AFM Kopfes zu seiner maximalen Position in der z-Richtung. </li><li> Gesetzt Extender auf die Beine des AFMHeben Sie die Ebene, bei der AFM Cantilever Kontakten der Probe. Die Probe und das AFM Kopf muss angehoben werden, um die Höhe der mechanischen Vorrichtung aufzunehmen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Lichtmikroskop (falls vorhanden). <ol><li> Entfernen Sie die AFM-Scanner Platte. Entfernen Sie das gewünschte Ziel. </li><li> Fügen Sie einen Abstandshalter auf das Ziel. Die Höhe des Abstandhalters würde die Aufgabe und die spezifische AFM Aufbau abhängen, aber es ist erforderlich, wenn optische Bildgebung erwünscht ist, da Beobachtungsebene verschiebt sich in der z-Richtung um einen Betrag gleich der Trage und Adapterhöhe (Figur sein 5A). Beachten Sie, dass die AFM bietet in der Regel geringer Vergrößerung Bildgebung aus einer optischen Pfad über dem Gerät. </li><li> Montieren Sie die gewünschte Ziel wieder in seine Lage. Stellen Sie den Scanner wieder ein, um die AFM. </li><li> Starten Sie die AFM-Software. Starten Sie alle notwendigen Lichtquellen einschließlich der Lichtquelle für Fluoreszenzmessungen. </li><li> Montieren Sie einen Chip mit einer freitragenden Balken,ist für die gewünschten Messungen geeignet. 200 pN / nm oder weniger Steifigkeit wird bevorzugt, wenn die Messung des Elastizitätsmoduls von lebenden Zellen. </li><li> Richten Sie den Laser und Kalibrierung des freitragenden Steifigkeit nach Hersteller Vorschläge auf einem Deckglas auf dem Gerät angebracht ist. </li></ol></li><li> Vorbereitung einer Membran wie in Schritt 1, jedoch mit folgenden Modifikationen. <ol><li> Unmittelbar vor der Montage der Membran an der Streckvorrichtung, schneiden die Wände bis etwa 1 mm in der Höhe. Dies verhindert, dass die Interferenz zwischen den Membranwänden und dem Last Zelle erfährt. </li><li> Halterung der Membran an der mechanischen Vorrichtung, wie beschrieben, 3.2.1-3.2.3. </li><li> Zellkulturmedium zu entfernen, um eine Beschädigung der AFM-Scanner im Falle eines Austretens verhindern. </li><li> Paar das Gerät mit einem Adapter (5A). Legen Sie die mechanische Vorrichtung mit dem Adapter auf den Scanner. </li><li> Dehnen Sie die Membran auf die gewünschte Dehnung Ebene. </li></ol></li><li&gt; Nano-Eindruck der gestreckten Zellen. <ol><li> Fügen Sie eine begrenzte (&lt;0,5 ml) Volumen von Medien auf die Zellen, um AFM Scanner oder Mikroskop Schäden zu vermeiden aufgrund eines spill. </li><li> Aktivieren Sie den Freiträger mit der Membran. </li><li> Folgen Sie dem Protokoll des jeweiligen AFM-Gerät, um Bereiche von Interesse zu scannen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Ein einzigartiges Gerät für Live Cell Imaging bei mechanischer Dehnung entwickelt; und diese Vorrichtung wurde in einem Protokoll zum Lungen Epithelzellen Mechanobiologie studieren. In Voruntersuchungen wurde festgestellt, dass eine einzige statt Streck stimuliert die Produktion von Superoxid in mitochondrialen bronchiale Epithelzellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erhöhte mechanische Belastung verursacht direkte Beschädigung der Integrität einer Monoschicht von alveolären Epithelzellen. <p class="jove_content...

Zellen werden gegenüber mechanischen Belastungen in vielen Geweben unterzogen, und das mechanische Stimulation wurde gezeigt, dass Veränderungen in den Mustern der Genexpression, die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Umbau der extrazellulären Matrix zu fördern und Zytoskelett 1-4. Die intrazellulären Signale solcher mechanischen Reizen transduziert auftreten durch den Prozess der mechanotransduction 5-7. Im Atmungssystem ist ein Ergebnis der mechanotransduction die Erhöhung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 8,9 und proinflammatorische Zytokine 10 in Lungenepithelzellen in Gegenwart von zyklischen Zugbelastung. Starke Beweise legen auch nahe, dass die übermäßige Zugspannung führt zu Verletzungen der Alveolarepithel direkt neben den biochemischen Reaktionen der Zellen 11-14. Obwohl der Fokus liegt hier vor allem auf die Reaktion der Lungenzellen auf mechanische Verformung, Wege durch Mechanotransduktion induzierte spielen eine Schlüsselrolle in den basic Funktion vieler Gewebe im menschlichen Körper, einschließlich der Regulation des Gefäßtonus 15 und die Entwicklung der Wachstumsplatte 16. Das wachsende Interesse an mechanotransduction hat zur Entwicklung zahlreicher Geräte für die Anwendung von physiologisch relevanten mechanischen Belastungen an kultivierte Zellen und Gewebe geführt. Insbesondere sind Geräte Anlegen einer Zugspannung, die eine häufige Form der mechanischen Belastung durch Gewebe erfahren ist, populär 11,17-19. Jedoch können viele der verfügbaren Geräte werden entweder als Bioreaktor für das Tissue Engineering-Anwendungen entwickelt oder sind nicht förderlich für eine Echtzeitabbildung mit Stretch. Als solches gibt es einen Bedarf an Werkzeugen und Verfahren, die Zellen und Gewebe unter Zugspannung zu visualisieren kann, um die Untersuchung von Wegen von mechanotransduction erleichtern. Dabei wurde eine in der Ebene mechanischen Spannvorrichtung entwickelt und Protokolle wurden entwickelt, um m geltenultiple Formen Stamm zu Geweben und Zellen und ermöglicht die Abbildung der biochemischen und mechanischen Reaktionen in Echtzeit (1A-D). Das Gerät verfügt über sechs in Umfangsrichtung angeordnet, um eine flexible Membran greifen und gelten in der Ebene liegende radiale Ausdehnung von bis zu etwa 20% (1B) gleichmäßig beabstandete Schellen. Die Betätigungsvorrichtung kann in einem Zellkulturbrutschrank über einen längeren Zeitraum gegeben werden, während der Motor (1C) außerhalb des Inkubators angeordnet ist und von proprietärer Software vom Motorlieferanten bereitgestellt gesteuert. Der Motor ist mit einem linearen Antriebsteil, der einen Innennocken dreht, fahren die sechs Trage Klemmen einheitlich in An- und Entspannung verbunden ist. Zusätzlich zu der mechanischen Vorrichtung wurden angepasst flexiblen Membranen aus im Handel erhältlichen Zellkultur bereit Membranen geschaffen, um in dem mechanischen System verwendet werden. Dann kreisförmigen Wände (mit einem Durchmesser von ca.28 mm) wurden hergestellt und auf die flexible Membran, so dass Zellen nur in diesem Bereich der gut beschriebene Spannungsprofil kultiviert werden, befestigt. Um zu bestimmen, ob die Position dieser Membranen innerhalb der Betätigungsvorrichtung würde gleichförmig und isotrop Belastung in der Mitte der flexiblen Membran bereitzustellen, wurde Finite-Elemente-Analyse unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software (1E-F) durchgeführt. Die flexible Membran wurde mit symmetrischen Randbedingungen und die Nutzung aller vierseitigen Elemente zu dem Netz modelliert. Die konzentrischen Ringe in der Konturdiagramm der maximalen Hauptdehnung in 1F gezeigt gesehen zeigen die isotropen Verteilung der Belastung. Der Stamm von der Membran erfahren wurde durch die Aufnahme von Bildern von Markierungen durch Beladung (Figur 2) gemessen. 2D zeigt, dass der durchschnittliche Membran Dehnung in radialer und axialer Richtung gemessen wurde, war annähernd linearenin Bezug auf die angelegte Motor zählt bis zu einer maximalen linearen Dehnung von 20%. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Dehnungsniveaus während Ausdehnung gemessen im Vergleich mit denen beim Zurückziehen wieder in die Ruheposition gemessen wird. Als nächstes wird die Verschiebung der humanen bronchialen Epithelzellen (16HBE) und ihre Kerne auf dem benutzerdefinierten flexible Membran kultiviert wurden, wurden gemessen. Fluoreszenzmarkierten (DAPI) Kerne der 16HBE Zellen wurden mit einem 20x-Objektiv unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird, während ganze Zelle Verschiebung wurde mit Phasenkontrast-Aufnahmen mit einem digitalen Mikroskop aufgenommenen Mess. Wie in Figur 3 zu sehen ist, die Belastung durch die Verschiebung der Kerne gemessen wurde, war ähnlich der durch Verschieben von Markierungen auf der Membran gemessen wird, bis zu ca. 20% linear Belastung. Dies bestätigt, daß der Stamm zu den Membranen aufgebracht wurde zu den adhärenten Zellen übertragen. Die Protokolle, die die Verwendung des benutzerdefinierten Geräte auf einem herkömmlichen Mikroskop und ein Atomkraft microscope werden in den folgenden Schritten.

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34: 3400 Serie</td><td>MOOG Animatics SM3416D</td><td></td><td>Integrierter Motor, Controller, Verstärker, Encoder und Kommunikationsbus</td></tr><tr><td>Flexcell Membrane (Collagen I beschichtet)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3,5"&nbsp; x&nbsp; 5,25" & x&nbsp; 0.020"</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>10:1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td>DAPI-Färbung</td></tr><tr><td>MitoSOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Tiron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7389&nbsp;</td><td>Mitochondriale Superoxid-Markierung</td></tr><tr><td>DMEM-Superoxid-Inhibitor</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td>Jedes Zentrifugenröhrchen kann verwendet werden, um einen Bereich für die Bildgebung zu schaffen.</td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>Maus Lungenepithelzellen &nbsp;</td></tr><tr><td>16HBE-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2741</td><td>Humane bronchiale Epithelzellen</td></tr><tr><td colspan="4">AFM Indentation Experiments</td></tr><tr><td>Cantilever-Strahlen für Nano-Indentation</td><td>Budget Sensoren</td><td>Si-Ni30</td><td></td></tr><tr><td>AFM&nbsp;</td><td>Asylum Research</td><td>MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>Inverses Mikroskop mit 20X und 40X Objektiven.</td></tr><tr><td>AFM Leg Extenders</td><td>Asylum Research</td><td>Nicht verfügbar</td><td>AFM microscope</td></tr><tr><td colspan="4">Finite Element Analyses</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscopes</td></tr><tr><td>Digital Mikroskop</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS XL Core</td><td>Ursprünglich ein eigenständiges Unternehmen, das sich heute im Besitz von Life Technologies befindet.</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>2-Photonen-Standmikroskop</td></tr></tbody></table>

live cell imaging bei mechanical stretch

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Es besteht derzeit ein erhebliches Interesse daran, zu verstehen, wie Zellen und Gewebe auf mechanische Reize reagieren, aber die derzeitigen Ansätze sind in ihrer Fähigkeit, Reaktionen in Echtzeit in lebenden Zellen oder lebensfähigem Gewebe zu messen, begrenzt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, bei dem ein Zellaktuator verwendet wurde, um lebende Zellen, die auf einem elastischen Substrat gewachsen sind, oder Gewebe, die an einem elastischen Substrat befestigt sind, während der Bildgebung mit konfokaler und Rasterkraftmikroskopie (AFM) aufzulösen. Vorläufige Studien zeigen, dass die tonische Dehnung menschlicher Bronchialepithelzellen zu einem signifikanten Anstieg der Produktion von mitochondrialem Superoxid führte. Darüber hinaus wurden mit Hilfe dieses Protokolls alveoläre Epithelzellen gedehnt und abgebildet, was eine direkte Schädigung der Epithelzellen durch Überdehnung zeigte, was eine Form der Lungenverletzung in vitro simulierte. Ein Protokoll zur Durchführung der AFM-Nanoindentation an gestreckten Zellen wird ebenfalls bereitgestellt.

Reaktive Sauerstoffspezies und Deformation Frühere Studien haben Steigerungen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den Atemwegen und alveolare Epithelzellen in Reaktion auf zyklische Dehnung 21 gezeigt. Reaktive Sauerstoffspezies umfassen Moleküle und freie Radikale aus molekularem Sauerstoff mit einer hohen Reaktivität gegenüber Lipiden, Proteinen, Polysacchariden und Nukleinsäuren 22-24 abgeleitet ist. ROS dienen als gemeinsame intrazellulären Signal an Ionen...

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Rolle mechanischer Dehnung auf die Zellmechanobiologie nahezu in Echtzeit zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein System mit flexiblen Membranen aufgebaut wird, auf denen Zellen kultiviert und gedehnt werden. Als zweiter Schritt erfolgt die Dehnung der Membran, um die Motorzähleinheiten mit der Membrandehnung zu kalibrieren.Anschließend werden murine Lungenepithelzellen gedehnt und die Zellkerne abgebildet. Um zu zeigen, dass die Membranspannung auf die Zellen übertragen wird, wurden die Dehnvorrichtungen danach in das A FM für Nanoindention integriert, um die Steifigkeit der einzelnen Zellen vor und nach der Dehnung zu messen. Die Ergebnisse zeigen eine direkte Schädigung der Zellen infolge der angelegten Dehnung.Auch basierend auf der Fluoreszenzbildgebung wird gezeigt, dass die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies mit der Dehnung zunimmt. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der mechanischen Biologie der Lunge beantworten, beispielsweise, ob epitheliale Zellen durch eine mechanische Beatmung verletzt werden können. Die Methode kann Einblicke in die mechanische Biologie von Lungenzellen liefern und ist außerdem auf anderes Weichgewebe wie Leber- oder Wachstumsfugen-Schnitte anwendbar.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da eine unkonventionelle Kombination von Werkzeugen in diesen Experimenten verwendet wird, wie beispielsweise das Rasterkraftmikroskop. Bereiten Sie zunächst eine Kollagen-beschichtete PDMS-Membran vor, die für die Zellkultur modifiziert wurde, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Anschließend werden murine Lungenepithelzellen mit einer Dichte von 2,5 Millionen Zellen pro Vertiefung auf eine sterile, flexible, kollagenbeschichtete Membran ausgesät.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 für zwei Tage, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Verwenden Sie dann einen 1,5 Millimeter großen Biopsiestanzer, um zwei Löcher in jede der sechs Klemmklappen zu stanzen, 20,5 Millimeter vom Zentrum des Konstrukts entfernt, falls keine Vorspannung gewünscht ist. Entfernen Sie anschließend das Zellkulturmedium.Stellen Sie sicher, dass sich der mechanische Aktuator in einer Null-Dehnungs-Position befindet, und platzieren Sie die Membran auf dem Dehngerät, sodass die Lochungen mit den Stiften und den Klammern übereinstimmen. Bringen Sie die oberen Klammern an und ziehen Sie die Schrauben nacheinander fest, wobei Sie abwechselnd die verschiedenen Seiten wechseln. Geben Sie ein Milliliter Zellkulturmedium hinzu, bevor Sie das Gerät auf den Mikroskopständer stellen.Zentrieren Sie das Gerät auf der Lichtbahn. Befestigen Sie das Gerät anschließend am Objekttisch. Fokussieren Sie auf die Membran, indem Sie die laterale und vertikale Position des mechanischen Geräts mit einem Tischregler des Mikroskops im Ziel-Eingabeblock justieren.Geben Sie einen Motorzählerwert ein, der dem gewünschten Dehnungsgrad entspricht, der angewendet werden soll. Stellen Sie anschließend den Wert im Geschwindigkeitseingabefeld auf 10 U/min oder weniger ein, um dasselbe Feld vor und nach der Dehnung beobachten zu können, da sich das Feld relativ zum Mikroskopobjektiv verschieben kann und es möglicherweise notwendig ist, den Mikroskoptisch während der Dehnung nachzuregeln. Wenn alle Einstellungen vorgenommen sind, klicken Sie auf „Go“.Beginnen Sie mit der Justierung des Rasterkraftmikroskops. Erhöhen Sie die Höhe des FM-Kopfes in Z-Richtung auf die maximale Position. Bringen Sie dann Verlängerungen an den Beinen an, um die Ebene anzuheben, in der der FM-Kantilever mit der Probe in Kontakt kommt.Als Nächstes entfernen Sie die A-FM-Scannerplatte und das gewünschte Objektiv vom Mikroskop. Fügen Sie einen Abstandshalter am Objektiv hinzu und montieren Sie es anschließend wieder am Mikroskop. Danach setzen Sie die Scannerplatte wieder auf das A-FM. Die Höhe des Abstandshalters hängt vom Objektiv und der spezifischen A-FM-Konfiguration ab, doch der Einsatz eines Abstandshalters ist notwendig, wenn eine optische Bildgebung gewünscht ist, da die Beobachtungsebene in Z-Richtung verschoben wird.Als Nächstes starten Sie die AFM-Software, die Software des optischen Mikroskops und alle notwendigen Lichtquellen, einschließlich der Lichtquelle für Fluoreszenzmessungen. Befestigen Sie einen Chip mit einem Cantilever, dessen Steifigkeit 200 Pikonewton pro Nanometer oder weniger beträgt, um den elastischen Modul lebender Zellen am AFM zu messen. Richten Sie anschließend den Laser aus, befestigen Sie eine Glasdeckfolie am Gerät und kalibrieren Sie die Cantilever-Steifigkeit gemäß den Herstellerangaben. Unmittelbar vor dem Befestigen der Membran an der Dehnvorrichtung schneiden Sie die Wände auf etwa einen Millimeter Höhe zu.Dadurch wird die Interferenz zwischen den Membranwänden und der Kraftmessdose verringert. Anschließend entfernen Sie das Zellkulturmedium und befestigen die Membran an der mechanischen Vorrichtung. Stellen Sie die mechanische Vorrichtung mit dem Adapter mithilfe der Software auf den Scanner. Dehnen Sie die Membran vor der Nanoindention auf das gewünschte Zugdehnungsniveau. Geben Sie 0,5 Milliliter oder weniger Medium auf die Zellen, um sie hydratisiert zu halten, achten Sie jedoch darauf, ein Verschütten zu vermeiden, das den FM-Scanner oder Mikroskop beschädigen könnte. Bringen Sie dann den Cantileverträger mit der Membran in Kontakt.Befolgen Sie das Protokoll des jeweiligen A FM-Geräts, um interessierende Bereiche zu scannen. Wenn eine Dehnung von 20 % auf Zellen angewendet wurde, die auf der Membran ausgesät waren, verschoben sich die Zellen um 20 %, wie hier dargestellt. Die Wirkung der Zellen auf die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies wurde in bronchialen Epithelzellen mittels eines kumulativen mitochondrialen Superoxid-Sensors gemessen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. In Abwesenheit mechanischer Dehnung stieg die ROS-Produktion innerhalb von 60 Minuten nicht signifikant an, wenn eine einzelne Dehnung von 17 % angelegt und aufrechterhalten wurde.Es kam zu einem Anstieg des mitochondrialen ROS, der noch weitere 60 Minuten andauerte, nachdem der mechanische Dehner in das Atomkraftmikroskop integriert worden war. Elastizitätsmodul-Karten von Maus-Lungenepithelzellen vor und nach einer 10%igen Zugbelastung wurden aus den hier markierten Bereichen gewonnen. Es wurden 300 einzelne Kraft-Deformations-Kurven über einen Bereich von 40 mal 40 Mikrometer aufgezeichnet, wobei sich eine Veränderung in der Lokalisation von Regionen mit hohem Modul unter Belastung zeigte.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann das Dehnen von Zellen innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden. Während eine Kraftmikroskop-Nanoindention dagegen zwei Stunden in Anspruch nehmen kann, um ordnungsgemäß durchgeführt zu werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen sorgfältig, aber dennoch zügig zu behandeln, da die Ergebnisse durch Erschütterungen und längere Exposition gegenüber Raumluft vor der Datenaufnahme negativ beeinflusst werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Kraftmikroskop äußerst anspruchsvoll sein kann.Es müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise darauf zu achten, dass alle Flüssigkeiten vom Scanner ferngehalten werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

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