Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Steigfähigkeit von Wildtyp-Fliegen und Fliegenmutanten für die an der Fortbewegung beteiligten Gene zu quantifizieren. Dazu werden die Fliegen zunächst in einen gläsernen Messzylinder überführt. Der zweite Schritt besteht darin, die Fliegen an den Boden des Zylinders zu verlagern, indem der Zylinder leicht auf die Schaumstoffpolsterung geklopft wird.

Anschließend werden Fliegen, die die Ziellinie überqueren, mit einer Videokamera für eine Dauer von zwei Minuten aufgezeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, die Videos zu analysieren und alle 10 Sekunden die Anzahl der Fliegen oberhalb der Ziellinie darzustellen. Letztendlich wird der Kletterassay verwendet, um Defekte in der Steigfähigkeit mutierter Linien von Fruchtfliegen zu identifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Techniken, wie z. B. der wilden Methode, besteht darin, dass sie in der Lage ist, geringfügige Unterschiede in der Kletterfähigkeit zu erkennen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich neurodegenerativer Erkrankungen zu beantworten, wie z.B. die Rolle bestimmter Gene bei der erblichen spastischen Querschnittslähmung bei der fortschreitenden Gangschädigung. Die Implikation dieser Technik ist tendenziell in Richtung der Entwicklung der Therapie.

IP für neurologische Erkrankungen, da es einen einfachen quantitativen Assay zum Testen des Ansprechens auf Medikamente und Mutanten auf neurodegenerative Kandidatengene bietet: Beginnen Sie mit der Anästhesie von 20 Fliegen mit Kohlendioxid und legen Sie alle Fliegen in ein 25 Millimeter x 95 Millimeter großes Sammelfläschchen, das Nahrung enthält. Bewahren Sie dann das Fläschchen mit den Fliegen horizontal in einer Pappschale auf, um zu vermeiden, dass sie in Flüssigkeit eingeschlossen werden, die sich am Boden des Fläschchens ansammeln könnte. Legen Sie die Fliegen am nächsten Morgen für mindestens 21 Stunden in einen Inkubator unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, richten Sie den Klettertest ein, indem Sie die Fliegen aus dem Fläschchen in einen 250-Milliliter-Messzylinder aus Glas überführen, und versiegeln Sie den Deckel mit Wachsfilm, um das Entweichen von Fliegen zu verhindern.

Führen Sie das Experiment bei Umgebungslicht bei 22 Grad Celsius und 40 % Luftfeuchtigkeit durch. Führen Sie Experimente immer zur gleichen Tageszeit durch, um Verwechslungen mit Schlafzyklen zu vermeiden. Markieren Sie auch die Position des Zylinders auf der Arbeitsplatte, um ihn jeden Tag konstant zu halten.

Zählen Sie die Anzahl der toten Fliegen am Boden des Zylinders und in den Lebensmittelfläschchen, notieren Sie diese Zahl als Sterblichkeit. Stellen Sie als Nächstes die Videokamera auf ein Stativ. Fokussieren Sie die Kamera ganz leicht auf die 190-Milliliter-Linie des 250-Milliliter-Messzylinders.

Klopfen Sie den Zylinder fünf- bis zehnmal mit genügend Kraft gegen ein geschlossenzelliges Schaumstoffpolster, um die Fliegen auf die innere Unterseite zu verschieben. Drücken Sie dann mit der anderen Hand die Aufnahmetaste an der Kamera. Tippen Sie dann sechsmal in einem eindeutigen, nicht rhythmischen Muster auf den Zylinder, während die Kamera aufnimmt.

Führen Sie jeden Versuch zwei Minuten lang ab dem Zeitpunkt durch, an dem die Fliegen zuletzt angetippt wurden. Zum Schluss entsorgen Sie die Fliegen in 95%igem Ethanol. Sobald der Versuch abgeschlossen ist, wiederholen Sie diesen Klettertest 10 Mal mit jeweils 20 frischen Fliegen, um kleine Unterschiede in der Fortbewegung zwischen den Gruppen zu erkennen.

Waschen Sie die Zylinder in der Spülmaschine und trocknen Sie sie über Nacht, um sie nach Abschluss des Experiments wiederzuverwenden, um die Fliegenleistung zu analysieren. Beginnen Sie mit dem Anschauen von Videos von jedem Fliegenversuchsrekord. Die Gesamtzahl der Fliegen, die alle 10 Sekunden die Ziellinie passieren. Wenn eine Fliege wieder herunterklettert oder fällt, notieren Sie diese Fliege als minus eins und zählen Sie die nächste Fliege, die die Ziellinie überquert, mit der gleichen Zahl wie die Fliege, die wieder heruntergeklettert oder gefallen ist.

Wenn beispielsweise die 15. Fliege unter die Ziellinie fällt, wird die nächste Fliege, die die Linie überquert, als 15. Fliege und nicht als 16. gewertet. Subtrahieren Sie dann die Sterblichkeit von der Gesamtzahl der Fliegen, um die Anzahl der Fliegen zu erhalten, die auf der Versuchsparzelle verbleiben. Der Prozentsatz der Fliegen, die zu jedem Zeitpunkt über der Ziellinie liegen, wenn mit schweren Mutationen gearbeitet wird, kann mit verschiedenen Kletterassays unterschiedlich stark ausgeprägt sein.

Hier wurde die Anzahl der acht Tage alten Fliegen, die nach 18 Sekunden auf die Spitze eines leeren Futterfläschchens kletterten, aufgezeichnet, wobei kein signifikanter Unterschied im Kletterverhalten zwischen den beiden Gruppen zu erkennen war. Auf der anderen Seite zeigen die Bastin 17 dash seven over TM three-Mutantenfliegen unter Verwendung des Kletterassays aus diesem Protokoll ein Leistungsdefizit im Vergleich zu den Kontrollen. Da viele Erkrankungen des Fortbewegungsmittels fortschreitend verlaufen, ist es wichtig, die Entwicklung der Fliegen im Laufe der Zeit zu beobachten.

Im Alter von zwei Tagen gibt es einen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Fliegen, die über die Ziellinie klettern. Im Vergleich zu Kontrollen. Diese Steigleistung nimmt mit zunehmendem Alter der mutierten Fliegen von zwei auf Tage weiter ab.

Sobald dieses Experiment und die Analyse gemeistert sind, können sie in drei Stunden abgeschlossen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lokomotivdefekte in Dola-Mutantenmodellen für neurologische Erkrankungen quantifizieren kann.