Name: Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Lernen Sie eine optimierte negative Geotaxis-Methode zur quantitativen Analyse von Kletterdefekten bei Drosophila melanogaster. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Erkennung milder Bewegungsstörungen und hilft bei der Identifizierung genetischer Interaktionen sowie potenzieller Wirkstoffziele für neurodegenerative Erkrankungen.

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Diese Arbeit wird durch ein Team Grant des Canadian Health Research Institute (CIHR) an Dr. Bolduc (Co-PI) und Dr. Guy Rouleau (PI) unterstützt. Wir danken Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, den Mitgliedern des Fly Clubs der University of Alberta und Dr. Clayton Dickson für die Hilfe bei der Entwicklung der Methode und der statistischen Analyse.

Forschung an Drosophila melanogaster wurde in Übereinstimmung mit der Universität Forschungs Richtlinien Albertas. 1. Fly-Sammlung <ol><li> Sammeln Sie 20 Fliegen mit CO 2 (g) Betäubung und in eine 25 mm x 95 mm Sammelgefäß haltige Speisen. </li><li> Shop Stechflaschen mit Fliegen horizontal zu vermeiden Trapping Fliegen in allen Flüssigkeiten, die in den Boden anreichern kann das Fläschchen. </li><li> Entfernt inkubiere für mindestens 21 Stunden bei 22 ° C bei 45% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank für ca. 15 Stunden. Stellen Sie den Inkubator mit einem 12 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus. </li></ol> 2. Climbing Assay <ol><li> Am nächsten Morgen, Transfer 20 Fliegen aus einer Ampulle in einen 250-ml-Glasmesszylinder. Markieren Sie die Position des Zylinders, um sie konstant zu halten jeden Tag. Verwenden Sie einen Glaszylinder pro Genotyp um eine Kreuzkontamination zwischen den Genotypen zu verhindern. Waschen Sie am Ende jedes Experiments und rotate sie zwischen den Genotypen. <ol><li> Führen die Versuche im Umgebungslicht (oder rotes Licht, wenn es einen potentiellen Defekt in Vision) bei der Temperatur und Feuchtigkeit von 22 ° C bzw. 40%. Um zirkadianen Rhythmus verwechseln zu vermeiden, führen Sie immer Experimente zur gleichen Tageszeit. </li></ol></li><li> Verschließen Sie die Oberseite des Zylinders mit einer Sperrfolie (Wachsfilm), um das Entweichen jeglicher Fliegen zu verhindern (Abbildung 2). </li><li> Richten Sie die Videokamera auf einem Stativ. Fokus-Kamera auf der Linie 190 ml der 250 ml-Messzylinder (17,5 cm). </li><li> Die Anzahl der toten Fliegen am Boden des Zylinders und in der Lebensmittelfläschchen. Tragen Sie diese Nummer als die Sterblichkeit. </li><li> Sehr leicht den Zylinder gegen einen geschlossenzelligen Schaumpolster wiederholt tippen mit genügend Kraft, um die Fliegen an der inneren Bodenfläche zu verdrängen. Tippen Sie auf 5 bis 10 mal, während mit der anderen Hand auf Rekord auf der Kamera drücken. </li><li> Drücken Sie die &quot;Record&quot; Taste an der Kamera. </li><li> Starten Sie das video Kameraaufnahme und auf den Zylinder, sechs Mal in einem ausgeprägten nicht-rhythmische Muster. </li><li> Leiten jeden Versuch für 2 min von der Zeit die Fliegen letzten abgegriffen und notieren Sie die Anzahl der Fliegen der Höhe von 17,5 cm (190 ml) zu jedem gewählten Zeitpunkt (zu quantifizieren alle 10 sec) überqueren. Hinweis: Das ml Markierung auf dem Zylinder wird von einem Zylinder-Modell zum anderen variieren je nach Durchmesser. Um Fehler zu vermeiden, messen Sie die Höhe an jedem Zylinder verwendet. </li><li> Sobald die Studie beendet ist, entsorgen Sie fliegt in 95% Ethanol. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,9, bis alle Wiederholungen wurden mit frischen Fliegen jedes Mal getestet. Hinweis: Obwohl 5 Wiederholungen können genug mit einer Mutation, die eine starke Wirkung auf die Fortbewegung ist, wird 10 biologischen Replikate von 20 Fliegen (200 entfernt) empfohlen, um kleinere Unterschiede zu erkennen. </li><li> Bei Beendigung des Versuchs, wäscht die Zylinder im Labor Spül- und Trocken O / N wiederverwendet werden. </li></ol> 3. Analyse <ol><li> Analyze Videos von jeder fliegen Studie. Jede 10 Sekunden, notieren Sie die Gesamtzahl der Fliegen, die die Ziellinie passieren. <ol><li> Wenn eine Fliege klettert wieder nach unten und fällt, Datensatz, der als -1 fliegen und zählen Sie die nächste Fliege, um die Ziellinie als die gleiche Anzahl wie die Fliege, die wieder nach unten stieg oder fiel überqueren. Zum Beispiel, wenn der 15. fly unter die Ziellinie, die nächste Fliege, die Linie (16. Fliegen) gilt als der 15. Fliege und nicht der 16. überqueren. </li></ol></li><li> Subtrahiere die Mortalität aus der Gesamtzahl von Fliegen (20), um die Anzahl der Fliegen, die in der Studie bleiben erhalten. Zu jedem Zeitpunkt, erhalten die Fraktion von Fliegen über der Ziellinie. </li><li> Zeichnen Sie jeden Prozentsatz zu jedem Zeitpunkt (siehe Abbildung 3). </li><li> Analysieren Sie die Leistung am 120 s Datenpunkt und führen Sie Student t-Test bei 2 Gruppen vorhanden sind oder ANOVA und einen Post-Test für multiple Vergleiche (mit Bonferroni Modifikation für geplante und ungeplante Tukey für Zusammenarbeitmparisons). Der Kolmogorov-Smirnov-Tests 17 wird auch durchgeführt, um Normalität und gleiche Varianz zu ermitteln, sondern auch, um die Verteilungen des Mutanten-Gruppe an die Steuerung zu vergleichen. </li><li> Um die Daten über Alterung zu präsentieren, zeichnen den Prozentsatz von Fliegen Klettern bei 120 sec mit Fliegen unterschiedlichen Alters (2 Tage, 1 Woche, 2 Wochen), um zu sehen, ob es eine fortschreitende Defizit (Abbildung 4). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Drosophila hat bereits bewiesen, dass ein ausgezeichnetes Modell der Parkinson-Krankheit 14 und andere neurodegenerative Erkrankungen 1,2 sein. Zusätzlich zu den genetischen Werkzeugen von Drosophila, wird dessen Genom sehr für Gene in neurologischen Erkrankungen beteiligten 19 konserviert. Das Aufkommen der genomweite genetische Screening-Methoden (einschließlich ganze Exoms Sequenzierung) wird sich wahrscheinlich fortsetzen, um eine größere Liste der Kandidatengene mi...

Verheerenden neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose und Spastische Paraplegie werden zunehmend anerkannt. Leider sind die meisten dieser neurodegenerativen Erkrankungen noch ohne Behandlungen. Die weit verbreitete klinische Anwendung von genomweiten, unvoreingenommene Gentests wie Voll Exom-Sequenzierung hat zu einer wachsenden Anzahl von Genen geführt, dass in der menschlichen Bewegungsapparates verwickelt. Trotz dieser Fortschritte die pathologische Progression von früh bis spät Bühnen, in weiter Ferne in dieser Erkrankungen. Drosophila stellt ein mit den genetischen Werkzeuge zum Studium Gen Anforderung in einer kontrollierten Art und Weise räumlich und zeitlich. Darüber hinaus hat Drosophila nützlich beim Screening Medikamenten für neurologische Erkrankungen wie der Parkinson-1, Alzheimer-2, geistiger Behinderung und Epilepsie 3,4 5,6 ua bewährt. Unser Ziel war es, eine kostengünstige Entwicklungund zuverlässigen Assay, der Analyse mit hohem Durchsatz, die noch ausreichend empfindlich gegenüber kleinen Änderungen in der Motorleistung zu detektieren würde ermöglichen würde. Es gibt verschiedene Tests verwendet, um die Effekte der genetischen Mutation und / oder Umgebungsbedingung auf Drosophila Kletterverhalten zu quantifizieren. Die meisten der Tests zu profitieren auf die natürliche Tendenz von Fliegen zu klettern, als negative Geotaxis oder Kletter Assay bekannt. Benzer 7 vorgeschlagen 1967, dass der Gegenstrom-Vorrichtung für die Untersuchung der Phototaxis verwendet könnte auch zur Gravitaxis untersuchen. Seitdem haben Ganetzki 8 und viele andere 9 -12 auf der ersten Test gebaut. Das Prinzip ist, um eine bekannte Anzahl der Fliegen in einem Fläschchen zu stellen und tippen Sie auf die Fläschchen kräftig gegen eine harte Oberfläche, wodurch die Fliegen an den Boden des Fläschchens fällt. Da es ein angeborenes Verhalten, werden die Fliegen versuchen, auf der Oberseite des Fläschchens, der Schwerkraft entgegengesetzt zu klettern. Dieser Test ist quantitativ und measures, wie viele Fliegen haben während einer vorgegebenen Zeit an einer Markierung auf dem Fläschchen kletterte. Messung der Geschwindigkeit anstatt der gesamten Anzahl der Fliegen Steigen zu einem verlässlichen Parameter und in Fällen, wo die Anzahl der Fliegen Kriterien nicht signifikant war 13 gezeigt Defekten. Die Steig Assay in der Studie von vielen neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Parkinson-Krankheit 14 bewährt. Allerdings haben wir festgestellt, dass Lok Mängel möglicherweise nicht nachweisbar sein zum Zeitpunkt, wo Neurodegeneration ist bereits in pathologischen Studien 14 zu sehen. Somit kann die Verwendung des herkömmlichen Assay die Fähigkeit, die frühen Stadien der Krankheit zu untersuchen Pathogenese begrenzen. Das Aussehen der Lokomotive Defekte während späteren Phasen der Pathologie kann eine Krankheit, deren Progression zu fortgeschritten für komplette Rettungs reflektieren. Dies wirft ein mögliches Problem mit der Empfindlichkeit des traditionellen Kletter Assay. Der potenzielle Unfähigkeit des tradinalen Klettern Assay zu mild Lokomotive Mängel erkennen kann, um die Höhe, auf die die Fliegen sind erforderlich, um zu klettern zurückzuführen. Die herkömmlichen Assay 15,16 misst die Anzahl der Fliegen, um erfolgreich über eine Höhe von 2 bis 5 cm steigen in 10 bis 20 Sekunden.

<table><tbody><tr><td>Drosophila-Bestände</td><td></td><td></td><td>Die Bestände werden in Abhängigkeit von den Versuchen ausgewählt. Die Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Raum und im Brutkasten müssen kontrolliert und konstant sein, um zu vermeiden, dass die Fliegen zu statisch oder zu nass werden.</td></tr><tr><td>Videokamera</td><td></td><td></td><td>Jeder digitale Camcorder ist geeignet. Stellen Sie sicher, dass sie auf nahe Objekte fokussieren können.</td></tr><tr><td>Messzylinder</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Verschiedene Modelle von Messzylindern können unterschiedliche Durchmesser haben. Es ist daher wichtig, die Höhe zu messen.</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td>Jedes Modell ist geeignet. Wir benutzten den Computer, um das Klettern der Fliegen zu überwachen und die Anzahl der Fliegen zu jedem Zeitpunkt aufzuzeichnen.</td></tr></tbody></table>

quantitative analyse der kletter defekte in einem drosophila modell von neurodegenerativen erkrankungen

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive Mängel von neurodegenerativen Erkrankungen resultiert, kann ein später Beginn Symptom der Krankheit, nach Jahren der subklinischen Degeneration und damit aktuelle therapeutische Behandlungsstrategien sind nicht kurativ. Durch die Verwendung von Voll Exoms Sequenzierung, eine zunehmende Anzahl von Genen identifiziert worden, eine Rolle in menschlichen Fortbewegung spielt. Trotz der Identifizierung dieser Gene, ist es nicht bekannt, wie diese Gene sind entscheidend für die normale Bewegungsfunktion. Daher ist ein zuverlässiger Test, der Modellorganismen verwendet, um die Rolle dieser Gene, um neue Targets von therapeutischem Interesse zu identifizieren aufzuklären, ist mehr denn je erforderlich. Wir haben eine sensibilisierte Version der negativen geotaxis Assay, der zum Nachweis von Mängeln milder früheren ermöglicht, und die Fähigkeit hat, diese Mängel über der Zeit erfasst gestaltet. Der Test wird in einem Glas durchgeführt Meßzylinder, der mit einem Wachsbarriere-Film abgedichtet ist. Durch die Erhöhung der Schwellenabstand um 17,5 c bestiegen werdenm und die Erhöhung der Versuchsdauer bis 2 Minuten haben wir eine größere Empfindlichkeit beim Nachweis von mild Mobilitätsstörungen beobachtet. Der Test wird kostengünstig und erfordert keine umfangreiche Ausbildung zu hoch reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Dies macht es eine ausgezeichnete Technik für das Screening von Wirkstoffkandidaten in Drosophila-Mutanten mit Bewegungsfehler.

Klettern ist eine starke und reproduzierbare Verhalten. Tatsächlich erreichen einen Tag alt Wildtyp-Fliegen die Zielentfernung Kletterleistung schnell (25-30 sec). Mutierten Fliegen präsentieren ein Leistungsbereich von mild (oder verzögert) die Unfähigkeit, die dem Ziel klettern abzuschließen. Wir veranschaulichen dies hier mit zwei verschiedenen mutierten Allelen. Die erste ist eine schwere Allel des Gens Spastin durch eine vollständige Löschung des Spastin Gen (Spas 5,75) 18 verursacht. In dieser Zeile (Sp...

Wir präsentieren einen optimierten, kostengünstigen und zuverlässigen negativen Geotaxis-Assay in Drosophila melanogaster als Modell für neurodegenerative Erkrankungen. Da dieser Assay empfindlicher auf leichte Defekte des Bewegungsapparates reagiert, hilft er bei der Suche nach potenziellen genetischen Wechselwirkungen und Wirkstoffzielen.

Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kletterfähigkeit von Wildtyp-Fliegen und von Fliegen, die für Gene mutiert sind, die an der Fortbewegung beteiligt sind, zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Fliegen zunächst in einen gläsernen Messzylinder überführt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Fliegen durch vorsichtiges Anklopfen des Zylinders auf eine Schaumstoffunterlage an den Boden des Zylinders zu befördern.Anschließend werden die nächsten Fliegen, die die Zielmarkierung überqueren, mit einer Videokamera über einen Zeitraum von zwei Minuten aufgezeichnet. Im letzten Schritt werden die Videos analysiert und die Anzahl der Fliegen oberhalb der Zielmarkierung alle 10 Sekunden grafisch dargestellt. Letztendlich dient der Klettertest dazu, Defekte in der Kletterfähigkeit von Mutantenlinien der Fruchtfliege zu identifizieren.Der Hauptvorteil dieser oder bestehender Techniken, wie beispielsweise der Wild-Methode, liegt darin, dass sie in der Lage ist, geringfügige Unterschiede in der Kletterfähigkeit zu erkennen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen zu beantworten, etwa die Rolle spezifischer Gene bei der erblichen spastischen Paraplegie im Hinblick auf eine progrediente Gangstörung. Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Tendenz zur Entwicklung von Therapien. IP für neurologische Erkrankungen, da sie einen einfachen quantitativen Test zur Untersuchung der Arzneimittelwirkung und von Mutanten für potenzielle neurodegenerative Gene bietet. Beginnen Sie damit, 20 Fliegen mit Kohlendioxid zu betäuben, und geben Sie alle Fliegen in ein Sammelgefäß mit den Maßen 25 Millimeter mal 95 Millimeter, das Nahrung enthält. Lagern Sie das Gefäß mit den Fliegen anschließend horizontal in einem Kartonträger, um zu verhindern, dass sich die Fliegen in Flüssigkeit, die sich am Boden des Gefäßes ansammeln könnte, verfangen. Stellen Sie die Fliegen mindestens 21 Stunden lang in einen Inkubator unter einem 12-Stunden-Wechsel von Licht und Dunkelheit. Am folgenden Morgen richten Sie den Klettertest ein, indem Sie die Fliegen aus dem Gefäß in einen 250-Milliliter-Glaszylinder umsetzen und die Öffnung mit Parafilm verschließen, um ein Entweichen der Fliegen zu verhindern.Führen Sie das Experiment bei Umgebungslicht bei 22 Grad Celsius und 40 % Luftfeuchtigkeit durch. Führen Sie Experimente immer zur gleichen Tageszeit durch, um Störungen durch Schlafzyklen zu vermeiden. Markieren Sie außerdem die Position des Zylinders auf der Laborbank, um diese jeden Tag konstant zu halten.Zählen Sie die Anzahl toter Fliegen am Boden des Zylinders und in den Nährbodenfläschchen und notieren Sie diese Zahl als Mortalität. Stellen Sie anschließend die Videokamera auf einem Stativ auf. Richten Sie die Kamera vorsichtig auf die 190-Milliliter-Marke des 250-Milliliter-Messzylinders aus.Tippen Sie fünf bis zehn Mal mit ausreichender Kraft gegen ein geschlossenzelliges Schaumstoffpad, um die Fliegen auf die innere untere Oberfläche zu befördern. Drücken Sie dann mit der anderen Hand während der Aufnahme die Aufnahmetaste der Kamera. Tippen Sie anschließend, während die Kamera weiterhin aufnimmt, sechsmal in einem deutlichen, nicht-rhythmischen Muster.Führen Sie jeden Versuch zwei Minuten lang ab dem Zeitpunkt durch, zu dem die Fliegen zuletzt angeklopft wurden. Entsorgen Sie die Fliegen schließlich in 95 % Ethanol. Wiederholen Sie diesen Klettertest nach Beendigung des Versuchs 10-mal mit jeweils 20 frischen Fliegen, um geringe Unterschiede in der Lokomotion zwischen den Gruppen nachweisen zu können.Spülen Sie die Zylinder in einer Spülmaschine und lassen Sie sie über Nacht trocknen, um sie wiederverwenden zu können, sobald das Experiment abgeschlossen ist. Zur Analyse der Flugleistung beginnen Sie mit dem Anschauen der Videos jedes Flugversuchs. Notieren Sie die Gesamtanzahl der Fliegen, die alle 10 Sekunden die Zielmarke überschreiten. Falls eine Fliege rückwärts herunterklettert oder herunterfällt, vermerken Sie diese Fliege mit minus eins und zählen Sie die nächste Fliege, die die Zielmarke überschreitet, mit derselben Zahl wie die Fliege, die rückwärts heruntergeklettert oder heruntergefallen ist.Wenn beispielsweise die 15. Fliege unterhalb der Zielmarke bleibt, gilt die nächste Fliege, die die Marke überquert, als 15. Fliege und nicht als 16. Fliege. Anschließend subtrahieren Sie die Mortalität von der Gesamtanzahl der Fliegen, um die Anzahl der Fliegen zu ermitteln, die im Versuchsareal verbleiben. Der Prozentsatz der Fliegen oberhalb der Zielmarke zu jedem Zeitpunkt lässt bei schweren Mutationen unterschiedliche Ausprägungen des Kletterdefekts erkennen, die mithilfe verschiedener Klettertests sichtbar werden.Hier wurde die Anzahl acht Tage alter Fliegen erfasst, die innerhalb von 18 Sekunden an die Spitze eines leeren Nährmedium-Röhrchens geklettert waren, wobei kein signifikanter Unterschied im Kletterverhalten zwischen den beiden Gruppen festgestellt wurde. Mit dem Klettertest gemäß diesem Protokoll hingegen zeigen die Bastin 17 dash seven over TM three Mutantenfliegen eine verminderte Leistungsfähigkeit im Vergleich zu den Kontrollen. Da viele Bewegungsstörungen progressiv verlaufen, ist es wichtig, die Entwicklung der Fliegen im Zeitverlauf zu beobachten.Zwei Tage nach der Geburt besteht ein signifikanter Unterschied in der Anzahl der Fliegen, die über die Zielmarke klettern, verglichen mit den Kontrollen. Diese Kletterleistung nimmt weiter ab, während die mutierten Fliegen von zwei auf mehr Tage altern.Wenn man den Versuch einmal beherrscht, kann er zusammen mit der Analyse innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bewegungsdefekte in dola-Mutantenmodellen für neurologische Erkrankungen quantifiziert.

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Neurowissenschaften

Behavior-Assays zur Messung der lokomotorischen Funktionen, Lern-und Gedächtnisleistung...

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Dieses Video beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der Fortbewegung von Fliegen und zeigt den durchgeführten Kletter-Assay. Der Fly-Climbing-Assay ist ein allgemeiner Test der motorischen Funktion, der auf einer negativen Geotaxis-Reaktion beruht.

Fly Climbing Assay: Eine Methode zum Testen der allgemeinen Fortbewegung bei Drosophila melanogaster

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu...

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

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Dieses Protokoll stellt einen Assay zur Modellierung von Verstopfung in einem Alpha-Synuclein-basierten Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit vor.

Messung von Verstopfung in einem Drosophila-Modell der Parkinson-Krankheit

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Lernen Sie eine optimierte negative Geotaxis-Methode zur quantitativen Analyse von Kletterdefekten bei Drosophila melanogaster. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Erkennung milder Bewegungsstörungen und hilft bei der Identifizierung genetischer Interaktionen sowie potenzieller Wirkstoffziele für neurodegenerative Erkrankungen.

Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

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