Analysieren der Funktionen von Mastzellen in Vivo mit ' MastCell Knock-in' Mäuse

Das übergeordnete Ziel der folgenden Methode ist es, die Funktionen von Mastzellen in vivo anhand von Mastzell-Knockin-Mäusen zu analysieren. Dies wird durch die erste Erzeugung von aus dem Knochenmark gewonnenen kultivierten Mastzellen (BMC MCs) oder die Transplantation in Mäuse mit Mastzelldefizienz erreicht. Im zweiten Schritt werden die BMC-MCs adoptiv in verschiedene anatomische Stellen in den Mastzell-defizienten Mäusen übertragen, um Mastzell-Knockin-Mäuse zu erzeugen.

Letztendlich werden die Anzahl und die anatomische Verteilung der adoptiv übertragenen Mastzellen durch Durchflusszytometrie und immunhistochemische Analyse untersucht, um zu beurteilen, inwieweit die transplantierten Populationen denen von Wildtyp-Mäusen ähneln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Beurteilung der Funktionen des transplantierten Wandtyps oder genetisch veränderter MA-Zellpopulationen in vivo ermöglicht. Diese Methode kann daher dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der MA-Zellbiologie zu beantworten, z. B. inwieweit MA-Zellen oder ihre Produkte zu den Merkmalen von Mausmodellen physiologischer, immunologischer oder pathologischer Prozesse, einschließlich Modellen menschlicher Krankheiten, beitragen können.

Im Allgemeinen können Personen, die diese Methode erlernen, Schwierigkeiten haben, da die Mastzelltransplantation und der Mastzellmangel je nach der Methode zur Erzeugung von BM-CMCs, der Injektionswurzel, der Anzahl der injizierten BMC-MCs und der Anzahl der Wochen mit einem Gewicht nach der Transplantation variieren können, bevor In-vivo-Experimente durchgeführt werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da Aspekte des Transplantationsverfahrens schwer zu erlernen sind, wenn man nicht genau sieht, wie sie durchgeführt werden. Um zuerst das Knochenmark zu extrahieren, verwenden Sie sterile Präparierwerkzeuge, um den Oberschenkelknochen, das Schienbein und das Wadenbein von Wildtyp-Mäusen zu entnehmen, ohne eine Knochenepiphyse zu verfluchen.

Wenn jeder Knochen präpariert wird, fixieren Sie ihn mit einer Pinzette und kratzen Sie das gesamte Fremdgewebe ab. Legen Sie dann den Knochen in PBS auf Eis, wenn alle Knochen entnommen wurden, übertragen Sie sie in eine sterile Gewebekulturhaube, dann einen nach dem anderen, sichern Sie jeden Knochen mit einer Pinzette und schneiden Sie beide Epiphysen ab, um die Markhöhlen freizulegen. Als nächstes verwenden Sie drei Milliliter-Spritzen, die mit 30-Gauge-Nadeln ausgestattet sind, und spülen das gesamte rote Mark von jedem Knochen in eine neue Petrischale. Wenn alle Knochen gespült wurden, verwenden Sie dieselbe Spritze, um die Knochenmarkzellcluster durch wiederholtes sanftes Aspiration und Ausstoßen zu dissoziieren.

Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem Spülmedium und zentrifugieren Sie die Reanimation der Zellen. Suspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern Nährmedium.

Anschließend werden die Knochenmarkzellen in einen entsprechend großen Gewebekulturkolben überführt. Nach ein bis zwei Tagen der Kultivierung werden die nicht adhärenten Zellen zusammen mit 10 Millilitern frischer Kultur, Medium pro Maus, in den folgenden Wochen in einen neuen Kolben überführt. Die Zellen alle drei bis vier Tage zu füttern, ist gerade demonstriert.

Einmal pro Woche werden die nicht adhärenten Zellen in einen neuen Kolben überführt, bis keine Adhärenzzellen mehr für die intradermale Transplantation in die Ohrpinner Resus übrig sind. Suspendieren Sie die BMC-MCs bei viermal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in kaltem DMEM. Aspirieren Sie dann die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und legen Sie die Spritze auf Eis.

Als nächstes bestätigen Sie die angemessene Anästhesietiefe durch eine obere Prise einer vier bis sechs Wochen alten Empfängermaus mit Mastzelldefizienz und tragen Sie Augensalbe auf, um die Zellen zu injizieren. Verwenden Sie den Zeigefinger, um die ventrale Fläche des Ohrsteckers freizulegen und zu dehnen, wodurch vertikaler Druck auf die dorsale Fläche des Ohrs entsteht. Verabreichen Sie dann 1 25-Mikroliter-Intradermalinjektion von einmal 10 an die sechs BMC-MCs in die Mitte des Ohrs und eine zweite 25-Mikroliter-Injektion desselben in Richtung der Spitze des Pinners.

Bei der intraperitonealen Transplantation resuspendieren Sie die BMC-MCs einmal mal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter in kaltem DMEM. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um zweimal 10 zu den sechs BM-CMCs in 200 Mikrolitern Medium in die Bauchhöhle der Empfänger mit Mastzelldefizienz für die intravenöse Transplantation zu injizieren. Resuspendieren Sie die BM-CMCs im Verhältnis 2,5 mal 10 zu den sieben Zellen pro Milliliter in kaltem DMEM und injizieren Sie dann fünfmal 10 zu den sechs BMC-MCs in 200 Mikrolitern Medium über die Schwanzvene.

Vier bis sechs Wochen nach einer intraperitonealen Transplantation verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um fünf Milliliter kaltes PBS in die Bauchhöhle des Empfängertieres zu injizieren. Massieren Sie den Bauch 20 Sekunden lang, um die Bauchfellzellen zu gewinnen. Verwenden Sie dann eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um die Peritonealspülung langsam zu aspirieren.

Der Mastzellanteil und die Gesamtzellzahl in der Peritonealspülflüssigkeit können dann mittels Durchflusszytometrie oder Histochemie ausgewertet werden. Um die Mastzellen in mesenterialen Fenstern zu beurteilen, schnitt man die Peritonealmembran auf, um den Darmtrakt freizulegen. Ordnen Sie vier bis fünf mesenteriale Fenster pro Maus auf einer Folie an, gefolgt von einer einstündigen Fixierung in Autogeräuschlösung.

Am Ende der Inkubation Raumtemperatur hinzufügen, die Objektträger an der Luft trocknen lassen und den Darm entfernen. Die festen mesenterialen Fenster bleiben an den Rutschen befestigt. Zum Schluss färben Sie die Präparate 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Chaba-Färbelösung, stellen die durchflusszytometrische Analyse und die Oldblau-Färbung von BM-CMCs nach einer 15- und 45-tägigen Kultur dar. In DMEM, ergänzt mit IL, sind drei BM-CMCs dargestellt, die 45 Tage lang kultiviert wurden und zu 95 % rein sind und eine hohe Anzahl von zytoplasmatischen Granulaten enthalten.

Daher eignen sich Zellen aus diesen Kulturen für Transplantationsexperimente, während Zellen, die 15 Tage lang kultiviert wurden, nicht auf diesen Bildern zu sehen sind. Die erfolgreiche Transplantation des Ohrpennys vier Wochen nach intradermaler Transplantation der mesenterialen Fenster, der Peritonealhöhle sechs Wochen nach der intraperitonealen Transplantation und der Lunge 12 Wochen nach intravenöser Transplantation ist erwartungsgemäß dargestellt. Mastzellen sind in den Gewebeproben vorhanden, die von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, während bei den Mastzell-defizienten Tieren in den Mastzell-Knockin-Mäusen keine Mastzellen nachgewiesen wurden.

Die adoptiv übertragenen BMC-MCs treten jedoch an ähnlichen Stellen auf wie bei den Wildtyp-Tieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass das Intervall zwischen der Transplantation und der Untersuchung des Experiments je nach Mastzellinjektionsstelle variieren kann. Es ist sehr wichtig, solche Intervalle einzuhalten, um den transplantierten Zellen genügend Zeit zu geben, zu reifen und ihren endgültigen Standort in vivo einzunehmen.

Dieser Ansatz lieferte und liefert weiterhin wichtige Informationen darüber, was Massenzellen und ihr Produkt in vivo leisten oder nicht leisten können. Bitte denken Sie immer daran, dass die Arbeit mit lebenden Tieren eine spezielle Schulung, eine angemessene Überprüfung und Genehmigung von Versuchsprotokollen und die strikte Einhaltung der höchsten Standards der Tierpflege erfordert, einschließlich der Sorgfalt, um die Schmerzen und den Stress des Tieres bei der Durchführung dieser Verfahren zu reduzieren.