Name: Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie die robotergestützte Produktion von Krebszellsphäroiden mit einem wässrigen Zweiphasensystem für Hochdurchsatz-Tests. Diese Methode ermöglicht präzise Arzneimittelscreenings in 96-Well-Platten.

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Die Autoren danken für die Finanzierung durch die National Institutes of Health R21CA182333.

1. Herstellung der Polymer wässrigen Zweiphasensystem (ATPS) <ol><li> Wiege 0,5 g Polyethylenglykol (PEG) (Molekulargewicht: 35.000) und 9,5 ml komplettem Wachstumsmedium hinzufügen, in einem sterilen konischen 15 ml bis 10 ml von 5% herzustellen (w / v) wässrigen PEG-Phase. Anmerkung: Das Hinzufügen der Hälfte des Mediums mit dem ersten durch Zugabe des Polymers und anschließend konisch dann wird die verbleibende Menge des Mediums minimiert Adhäsion des Polymers an den konischen Wänden und hilft das Polymer lösen sich schneller auf. </li><li> Man wiegt 0,128 g Dextran (DEX) (MW: 500.000), um sie 0,872 ml komplettem Wachstumsmedium hinzuzufügen in einem sterilen 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um 1 ml von 12,8% (w / v) wässrigen DEX Phase herzustellen. </li><li> Vortex sowohl Lösungen für etwa 1 min, um die Polymere in dem Medium zu lösen. </li><li> Halten beide Lösungen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 Stunde, um die Auflösung und homogene Mischungen zu gewährleisten. Halten der Kappen oberhalb des Wasserspiegels, um die Möglichkeit einer Kontamination der Lösungen aus dem Bad zu vermeidenWasser. </li><li> Laden Sie die PEG-Phase-Lösung in einem sterilen, Kunststoffspritze und führt es durch einen Spritzenfilter von 0,2 um Porengröße, um Verunreinigungen zu entfernen. Hinweis: Füllen Sie die Spritze mit der PEG-Lösung, legen Sie sie in den Einsatz des Filters auf einem konischen Rohr und mit Gewalt, langsam schieben Sie die Lösung durch den Filter. Es ist normal, um den Widerstand gegen eine Bewegung des Spritzenkolbens auftreten. Geringen Verlust der Polymerlösung tritt als etwas von der Lösung im Filter bleibt, sondern die Polymerkonzentration nicht ändert. </li><li> Je 10 ul der DEX Phasenlösung und verdünnen Sie es in 10 ul Medium in einem separaten Röhrchen in 6,4% (w / v) DEX Phasenlösung führen. Aspirat 100 ul der PEG-Phase-Lösung und darauf verzichten, in einer Petrischale. <ol><li> Verzichtet werden 0,5 ul der 6,4% (w / v) DEX Phasenlösung in die PEG-Phase-Lösung. Überprüfen Sie optisch erfolgreiche ATPS Bildung durch Beobachten einer DEX Tropfen unter dem Mikroskop. Der Rückgang Grenzesollten sichtbar bleiben, die das Vorhandensein von zwei stabilen, separate Wasserphasen. </li></ol></li><li> Bewahren Sie die Lager wässrige PEG und DEX Phasen Lösungen in 4 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Es wird empfohlen, Polymerlösungen werden frisch vor jedem Experiment vorbereitet und innerhalb von 24 Stunden der Lagerung. </li></ol> 2. Vorbereitung für den Druck von Cancer Cell Spheroids <ol><li> Wachsen die Krebszellen von Interesse (zB, MDA-MB-157-Brustkrebszellen) zu einer 90% -100% konfluenten Monolayer. MDA-MB-157-Zellen, mit einem Medium aus DMEM, enthaltend 10% FBS, 1% Glutamin und 1% Antibiotikum besteht. <ol><li> Ernten Sie die Zellen mit Hilfe eines Zelldissoziationspuffer (nach Herstellerprotokoll) und laden Sie die Suspension in einen konischen 15 ml. Zentrifugieren Sie es für 5 min bei 173,3 × g, zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 1 ml vollständigem Wachstumsmedium. </li></ol></li><li> Wägezellen auf einem Hämozytometer und zählen Sie die erforderliche Anzahl berechnenvon Zellen für eine gewünschte Sphäroid Zelldichte. Eine konfluente Monoschicht von MDA-MB-157-Zellen in einer T75-Flasche gezüchtet gibt üblicherweise ~ 7 × 10 6 Zellen. Anmerkung:. Pro ​​0,3 &amp; mgr; DEX Phase Abfall Erforderliche Zelldichte für ein Tropfenvolumen zu erzeugen, eine einzelne Sphäroid wird auf dem Zelltyp abhängen 22 beispielsweise eine Dichte von 1,5 x 10 4 oder größer für MDA-MB-157-Zellen empfohlen sicherzustellen Bildung eines einzigen Sphäroid. </li><li> Zentrifuge Zellen ein zweites Mal 5 Minuten lang bei 173,3 x g und Resuspendieren in einer geeigneten Volumen an Wachstumsmedium, um die Suspension auf einen gewünschten Zelldichte zu konzentrieren. Hinweis: Wenn beispielsweise 7 x 10 6 Tumorzellen wurden geerntet, das Gesamtvolumen der erforderlich ist, um ein Sphäroid von 1,5 x 10 4 Zellen in einer Dichte von 0,3 &amp; mgr; DEX Phase Tropfen bilden Zellsuspension werden 140 &amp; mgr; l sein. Jedoch wegen der Verdünnung mit dem DEX Phasenlösung in dem nächsten Schritt, verwenden nur 70 &amp; mgr; l Zellkulturmedium, um Zellen zu resuspendieren. </li><li&gt; Zu der resultierenden Zellsuspension wurde ein gleiches Volumen der 12,8% (w / v) wässrigen DEX Phasenlösung in 1,2 hergestellt. Für das Beispiel von 1,5 x 10 4 Zelldichte Sphäroid werden 70 ul der DEX Phasenlösung zu 70 &amp; mgr; l Zellsuspension zugegeben. </li><li> Die Zellsuspension gründlich zu mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen und Vermischung von DEX-Lösung zu gewährleisten. Auf- und Abpipettieren sollte vorsichtig durchgeführt werden, um eine Blasenbildung zu verhindern. </li></ol> 3. Vorbereitung für den Druck von Co-kultiviert Spheroids <ol><li> Wachsen die Krebszellen (beispielsweise MDA-MB-157 menschlicher Brustkrebszellen) und Stützzellen (zB menschliche Fibroblasten) in eine 90% -100% konfluenten Monolayer. Ernten jeden Zelltyp mit einem Zelldissoziationspuffer (gemäß dem Herstellerprotokoll). <ol><li> Legen Sie jede Suspension in eine 15 ml konischen, zentrifugieren 5 min bei 173,3 × g, und saugen Stand aus jeder konisch. Die Zellen jeder Kegel in 1 ml vollständigen growth Medium. Anmerkung: Fluoreszierende Farbstoffe wie Calcein AM (Lebendzell Färbung) und Kern Farbstoffe (Hoechst) verwendet, um die zwei Zelltypen unterschieden werden. </li></ol></li><li> Legen jeder Zelltyp separat auf einem Hämozytometer gezählt und auf die erforderliche Anzahl von einzelnen Zelltyp für ein gewünschtes Verhältnis von Krebszellen gegenüber Stützzellen cokultiviert Sphäroide berechnen. Konfluente Monoschichten von MDA-MB-157-Zellen und Fibroblasten in T75-Flaschen gezüchtet geben üblicherweise ~ 7 x 10 6 und ~ 6 x 10 6 Zellen. </li><li> Füge das richtige Volumen aus der Suspension von Stützzellen, Krebszellen-Suspension, um ein gewünschtes Verhältnis der Anzahl von zwei Zelltypen ergeben. Beispielsweise verwenden die ein Verhältnis von 50 Krebszellen 1 Fibroblastenzellinie. </li><li> Zentrifuge der konische enthaltend das gemischte Zellsuspension für 5 min bei 173,3 xg und Zellen in einem geeigneten Volumen an Enddichte ergeben, bestehend aus gleichen Volumen des Wachstumsmediums und der 12,8% (w / v) wässrigen DEXPhasenlösung (1.2) hergestellt. </li><li> Pipette vorsichtig die resultierende Zellsuspension nach oben und unten, um die Homogenität der Suspension zu gewährleisten. </li></ol> 4. Drucken von Tumorsphäroide in eine 96-Well-Platte <ol><li> Einen Tag vor Versuchsmantel nichtbehandelten Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen mit 1% (w / v) Pluronic bei 37 ° C für 24 Stunden. Diese Beschichtung verhindert, dass die Zellhaftung über die Kulturdauer. </li><li> Geben Sie 50 &amp; mgr; l des gefilterten 5% (w / v) wässrigen PEG-Phase in jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Zielscheibe). </li><li> Mit einer Pipette mischen die Zellsuspension (in Schritt 2 oder 3 für die Mono- und Co-Kultur bzw. vorbereitet) und fügen Sie 20 ul der Suspension zu jedem anderen auch von einer Spalte einer 384-Well-Platte (Source-Platte) . </li><li> Schalten Sie den Liquid Handler und &quot;Heimat&quot; der Pipettierkopf Koordinaten registrieren. Dann kompilieren Sie eine zuvor definierte Protokoll (unten in 4.6), um sicherzustellen, Laborgeräte und Parameter richtig definiertly. Diese &quot;Homing&quot; Schritt kann für verschiedene flüssige Handlern können. Anmerkung: Die Strömung des Protokolls gezeigten Schritt-für-Schritt nachfolgend 4.6, wird ähnliche unabhängig von der verwendeten Roboter-Flüssigkeitshandhabungsgerätes ist; jedoch kann die Programmierschnittstelle abweichen aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Software. </li><li> Legen Sie die Quellplatte, die Zielscheibe und Pipettenspitze Boxen an definierten Positionen auf der Arbeitsstation des Liquid Handler wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Führen Sie das Protokoll, das die folgenden Schritte beinhaltet: <ol><li> Laden Sie eine Spalte der Fässer aus dem Pipettieren Leiter der Liquid Handler mit Mischpipettenspitzen (8 Tipps) von der Arbeitsstation (Abbildung 1). </li><li> Mischen der Zellsuspension in Vertiefungen der Quellenplatte (Abbildung 1). Wählen Sie ein Mischvolumen kleiner als der Zellsuspensionsvolumen in den Vertiefungen um eine Blasenbildung zu vermeiden. </li><li> Werfen Sie Tipps in einen leeren Deponien Feld (Abbildung 1). </li&gt; <li> Laden Sie eine Spalte der Fässer vom Pipettierkopf mit 10 ul Abgabe Pipettenspitzen (Abbildung 1). </li><li> Aspirat 0,3 ul der Zellsuspension aus der Quellenplatte (1) in jede Pipettenspitze. </li><li> Abgeben der Zellsuspension in die Vertiefungen in einer Spalte des Zielplatte (Abbildung 1). Verwenden eine Abgabehöhe von 0,5 mm und eine Abgabedurchflussrate von weniger als 1 l / s an. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.6.1 durch 4.6.6 bis die Spalte für Spalte Druck in den gesamten Zielplatte abgeschlossen ist. </li></ol></li><li> Die Ziel-Platte vorsichtig aus dem Workstation Oberfläche und legen Sie sie in einem feuchten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Pflegen Sie die Platte waagerecht transportiert es in den Inkubator zu Aufbrechen von DEX Phasentropfen mit Zellen zu vermeiden. </li><li> Die Platte für 24 Stunden, um die Aggregation von Zellen in ein Sphäroid im DEX Phasenausfall ermöglichen. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Drug Treatment von Cancer Cell Spheroids Beachten Sie, dass das folgende Protokoll ist für einen 4-Tages-medikamentöse Behandlung und umfasst eine Erneuerung mit frischen Droge für Tag 2. Es kann für andere Behandlungszeiten geändert werden. <ol><li> Überprüfen Sie optisch Sphäroidbildung in 96-Well-Platten nach 24 Stunden. Falls erforderlich, Bildquellen für die Messung der Größe der Kügelchen durch Mittelung der kleinsten und größten Durchmesser jedes Sphäroid. </li><li> Bereiten Sie die Stammlösung eines gewünschten Wirkstoffs durch in einem Lösungsmittel vom Hersteller empfohlen bei einer vorbestimmten Löslichkeitskonzentration Auflösen. Beispielsweise lösen sich Cisplatin in Wasser bei 2 mg / ml. Hinweis: Schützen Sie die Stammlösung des Arzneimittels von Licht, wenn das Medikament ist lichtempfindlich. </li><li> Mit der Verdünnungstechnik, bereiten verdünnten Wirkstoffkonzentrationen mit Zellkulturmedium aus dem im vorherigen Schritt hergestellte Standardlösung. Jede Verdünnung sollte zweimal die gewünschte Konzentration hergestellt werden. Dilution Verhältnisse werden je nach Ausgangsstoffkonzentration variiert und der gewünschten Arbeitskonzentrationen. </li><li> Fügen Sie 50 ul der im vorherigen Schritt in jede Vertiefung vorbereitet Wirkstofflösung. Dies kann maschinell oder durch manuelles Pipettieren erfolgen. Anmerkung: Jede Wirkstoffkonzentration wird in die Hälfte, um die gewünschte Konzentration von 50 &amp; mgr; l wässrige PEG-Phase bereits in jeder Vertiefung zu verdünnen. <ol><li> Verwenden Sphäroide aus zwei Spalten von einer 96-Well-Platte (n = 16) für jede Konzentration. </li><li> In Kontrollvertiefungen, fügen nur 50 ul frischem Kulturmedium zu den vorhandenen 50 ul der wässrigen Phase PEG. </li></ol></li><li> Sphäroide Inkubieren mit dem Wirkstoff für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2, vor Licht geschützt. </li><li> Nach 48 Stunden Inkubation ansetzen Verdünnungen des Wirkstoffs in den gewünschten Konzentrationen und erneuern Medikament durch Zugabe von 50 &amp; mgr; l frisches Medikamentenlösung in jede Vertiefung. Hinweis: Die Wells die gewünschte Wirkstoffkonzentration enthalten bereits ab dem ersten Medikament tEHANDLUNG. Daher in dieser Erneuerungsphase wird jede Konzentration an die gewünschte Konzentration, da keine Verwässerungseffekte auftreten. </li><li> Sphäroide Inkubieren mit dem Arzneimittel für weitere 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2, vor Licht geschützt. </li></ol> 6. Analyse der Zelllebensfähigkeit in Spheroids <ol><li> Nach 48 h Inkubation mit erneuter Arzneimittel (dh, die Gesamtzeit der Behandlung von Sphäroiden mit einem Medikament 4 Tage), messen die gesamte Volumen des Mediums in ein Well durch manuelles Pipettieren. Hinweis: Typische Volumen in einer gut ist ~ 140 &amp; mgr; l (eine geringe Abnahme erfolgt durch Verdampfung). </li><li> Berechnen des Volumens der Zelllebensfähigkeit Reagenz (zB Presto) als 10% ige Konzentration des gesamten Muldenvolumens. Füge diese Volumen Zellviabilität in jede Vertiefung. Hinweis: Bei einer vorhandenen Medienvolumen von 140 &amp; mgr; l in einer gut wird ein Volumen von 15,6 &amp; mgr; erforderlich, um eine Konzentration von 10% des Gesamt auch geben. Dieser wird berechnet durchAufteilung des vorhandenen Medienvolumen von 9 (140 ul / 9 = 15,6 ul). </li><li> Die Platte mit der Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz jeweils für 6 h bei 37 ° C zugegeben und vor Licht geschützt. </li><li> Die Platte wird in einem Mikroplattenleser und lesen Sie das Fluoreszenzsignal bei 560 nm und 590 nm Anregungs- und Emissionswellenlängen auf. </li><li> Die prozentuale Lebensfähigkeit von Zellen in Sphäroiden durch Normalisierung der Fluoreszenzsignal von behandelten Vertiefungen zu der Kontrollvertiefungen nach der Mittelung der Werte aus den gleichen Behandlungsbedingungen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Sphäroide ein realistisches Modell, besser zu verstehen Tumorphysiologie und Wirksamkeit von Medikamenten und bieten ein nützliches Werkzeug für Anti-Krebs-Medikamentenentwicklung. Solche Anwendungen würden in hohem Maße von einfachen Techniken Sphäroid Erstellung und Pflege, die nur Standardlaborgeräte, Liquid Handling-Tools und Siebanlagen benötigen profitieren. Die Verwendung eines wässrigen Zwei-Phasen-System spontan Aggregatkrebszellen innerhalb der Tropfenphase ermöglicht die effiziente Produktion und Wartung von ...

Tests auf Zellbasis ein wichtiges Instrument für die Entwicklung und Entdeckung neuer Antikrebsmittel. 1,2 Historisch Schichtkulturen von Krebszellen verwendet worden, um die Wirksamkeit von Testverbindungen gegen bestimmte Typen von Krebszellen zu untersuchen. Die Wartungsfreundlichkeit der Monolayer-Kulturen in Standardkulturplatten, die Kompatibilität der Standardplatten mit handelsüblichen Roboter-Tools für die Zugabe von Reagenzien und mit Screening-Geräte für nachgeschaltete Analyse der zellulären Reaktionen auf chemische Verbindungen sind die wichtigsten Vorteile, die 2D-Kulturen ein attraktives Werkzeug machen für Drogentests. 3 Leider Monolayer-Zellassays häufig nicht die Wirksamkeit der Verbindungen in vivo vorherzusagen, so dass der Arzneimittelentwicklung und Entdeckung eine sehr kostspieliges Verfahren. 4,5 Trotz erheblicher Investitionen und Anstrengungen von Pharmaunternehmen und akademischen Einheiten nur ~ 1% von Anti-Krebs-Medikamente in klinischen Studien genehmigtvon der FDA in den letzten zwei Jahrzehnten. 6 Ungleichheit zwischen 2D Kulturen und der komplexen 3D-Umgebung von Krebszellen in vivo ist ein Hauptnachteil der Monolayer-Kultur-Systeme. 7 daher Screening von Kandidatenverbindungen gegen Tumorzellen in einer Umgebung, die mehr ähnelt die 3D-Tumorumgebung kann die Entwicklung neuer Chemotherapeutika beschleunigen. 8 Krebszell Sphäroide ein den entsprechenden 3D Tumormodell in vitro. 9,10 Sphäroide kompakte Cluster, die durch spontane oder induzierte Anordnung von Krebszellen auf nicht-adhärenten Oberflächen oder in Suspension unter Verwendung von Techniken wie Rotationskolben, Flüssigkeitslagerung, mikrofabrizierten mikro bilden . auch Arrays, Mikrofluidik und hängenden Tropfen 11-16 Spheroids nachahmen Merkmale von soliden Tumoren wie Geometrie und begrenzte Transport von Sauerstoff, Nährstoffen und Wirkstoffen für Arzneimittel in der zentralen Zone; damit sie enger Medikament Verant regenerierense von soliden Tumoren im Vergleich zu Monolayer-Kulturen. 17-19 Trotz dieser deutlichen Vorteil, Sphäroiden nicht routinemäßig für das Screening von chemischen Verbindungen gegen Krebszellen eingesetzt. Schwierigkeit, einheitliche Größe Sphäroiden in einer Standard-Hochdurchsatz-Einstellung, die mit handelsüblichen Robotertechnik und Screening / Imaging-Tools kompatibel ist behindert Einbeziehung der Sphäroid-Kultur in die Entwicklungspipeline. Obwohl benutzerdefinierte Materialien und Platten wurden vor kurzem im Handel erhältlich sein, um diesem Bedarf zu begegnen, aus Kostengründen abschrecken ihren weit verbreiteten Einsatz. Beide Ansätze erfordern zwei Haupttechniken mit der Fähigkeit zur Herstellung von konsistenten großen Sphäroide in hohem Durchsatz verwendet eine neue Hängetropfen Plattform und mikrofabrizierte Mikrovertiefungen. 13,16,20 jedoch spezielle Platten und Vorrichtungen, die in der Herstellung teuer und unbequem für den Endpoint sind in Kernforschungszentren und der pharmazeutischen Industrie, wo die meisten großen efForts für die Entdeckung von neuen Antikrebsmitteln vorgenommen. Trotz einiger Verbesserungen in der Stabilität der Zellen enthaltende Tropfen mit einem aktuellen Design der hängenden Tropfen Platten wird nur jedes zweite Loch der Platte noch während der Kultur verwendet werden, um die Verbreitung / Zusammenführen von Tropfen zu vermeiden. 16 Diese Versuchsdurchsatz deutlich abnimmt. Drogenabhängigkeit und der Erneuerung ist schwierig, mit manueller oder Roboter Pipettieren und Sphäroiden müssen in eine Standard-Platte für die biochemische Analyse übertragen werden, da diese Platte-Konfiguration ist nur schwer mit der herkömmlichen Screening-Geräte wie Plattenreadern. 21 Mikrobohrungen mittels Softlithographie auch hergestellt eine kontrollierte Größe Sphäroid Produktion. 13,20 Aber Unvereinbarkeit dieser Plattform mit Standard Pipettierwerkzeugen verhindert Behandlung einzelner Kügelchen mit verschiedenen Arzneimittelverbindungen / Konzentrationen, was allen Kügelchen nach einer einzigen Behandlung Zustand. Somit ist dieses Verfahren nicht für HochfallsDurchsatz Screening von Verbindungen, die eine gleichzeitige Prüfung mehrerer Verbindungen / Konzentration erfordert. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurde eine neue Technik für die Hochdurchsatzproduktion von gleichbleibend große Krebszelle Sphäroiden in Standard-96-Well-Platten entwickelt. 22,23 Der Ansatz basiert auf einem polymeren wässrigen Zweiphasensystem (ATPS) mit Polyethylenglykol (basierend PEG) und Dextran (DEX) als phasenbildende Polymere. 24 ATPS wurden kürzlich in einer Reihe von neuartigen zellbiologische Anwendungen Zelle Mikrostrukturierung erlauben 25-32 verwendet und die lokalisierte Verabreichung von biologischen Reagenzien auf Zellen, die in wässrigen Medien sehr worden. Um ein Formular Sphäroid, sind Krebszellen mit der wässrigen Phase DEX und Untermikroliter-Tropfen der erhaltenen Suspension gemischt wird in eine Vertiefung, die die Eintauchphase wässrige PEG-Lösung pipettiert. Der Tropfen bleibt mischbaren dem Eintauchphase und beschränkt Zellen zur Bildung eines Sphäroids erleichtern. Koboldortantly stellt die stark wässrigen Eintauchphase Nährstoffe zu den Zellen des Sphäroids und das bekannte Problem der Medien Verdampfen gemeinsam zu anderen Assays, die Veränderungen in der Medien Osmolalität und Schwankungen der Wirkstoffkonzentrationen verursacht minimiert. Diese Technik ermöglicht die Produktion Sphäroid und medikamentöse Behandlung nur mit im Handel erhältlichen Reagenzien und Pipettierwerkzeugen in Standard-96-Well-Platten. Wichtig ist, dass Analyse der zellulären Reaktionen von Sphäroiden in der gleichen Platte mit Standard-biochemische Tests und Plattenlesegeräte durchgeführt. Die Leichtigkeit der Arbeit mit ATPS und Anpassungsfähigkeit der Ansatz zur Roboter Liquid Handling ermöglicht Hochdurchsatz-Generation sowohl Monokultur und Co-Kultur Sphäroide eine einfache Labortechnik. Dieser neue Ansatz wird ein wichtiger Schritt in Richtung Integration der Krebszelle Sphäroiden in der Arzneimittelentwicklung und Discovery-Prozesse mit verbesserter Testdurchsatz und Wirtschaftlichkeit (zunehmende Zahl von getesteten Verbindungen und redu seinced Reagenzienverbrauch) und Effizienz (Verringerung der Hands-on-Zeit). Ein detailliertes Protokoll für Roboter Herstellung von Krebszell Sphäroide in 96-Well-Platten unter Verwendung des ATPS Ansatz wird nachstehend beschrieben. Zusätzlich werden Details der medikamentösen Behandlung der resultierenden Kügelchen und nachgeschaltete Analyse der zellulären Reaktionen unter Verwendung eines kommerziellen biochemischen Test dargestellt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien und Verbrauchsmaterialien</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol, MW: 35.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500.000</td><td>Pharmakosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Einwegspitzen (10 & Mikro; l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Einwegspitzen (70 & Mikro; l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit rundem Boden</td><td>Nunc</td><td>268200<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

roboter-produktion von cancer cell sphäroide mit einer wässrigen zwei-phasen-system für drug testing

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell sphäroide stellen ein relevantes in vitro Modell von avaskulären Tumoren für Anwendungen zur Prüfung von Krebsmedikamenten dar. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Monokultur- und Co-Kultur-Sphäroiden in einem 96-Well-Plattenformat mit hohem Durchsatz beschrieben. Bei diesem Ansatz wird ein wässriges Zweiphasensystem verwendet, um Zellen in einen Tropfen der dichteren wässrigen Phase einzuschließen, der in die zweite wässrige Phase eingetaucht ist. Der Tropfen ruht auf der Well-Oberfläche und hält die Zellen in unmittelbarer Nähe, um ein einzelnes Sphäroid zu bilden. Diese Technologie wurde an einen robotergestützten Liquid Handler angepasst, um größengesteuerte Sphäroide herzustellen und den Prozess der Sphäroidproduktion für Compound-Screening-Anwendungen zu beschleunigen. Sphäroide, die mit einem klinisch verwendeten Medikament behandelt wurden, zeigen eine verminderte Zellviabilität mit zunehmender Arzneimitteldosis. Die Verwendung einer Standard-Mikrotiterplatte für die Sphäroiderzeugung macht es einfach, die Lebensfähigkeit von Krebszellen von medikamentös behandelten Sphäroiden mit einem Mikroplatten-Reader zu analysieren. Diese Technologie ist sowohl robotergestützt als auch mit anderen Liquid-Handling-Werkzeugen wie manuellen Pipetten einfach zu implementieren.

Der Arbeitsplatz des Roboter Liquid Handler ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Pipettierkopf und alle in der Roboter-Druck von Sphäroiden in Abschnitt 4.6 verwendet Stationen sind beschriftet. Das Bild zeigt die Verwendung von zwei verschiedenen Stationen für Tipp-Boxen (eine Reihe von Tipps für das Mischen und den zweiten Satz zum Ansaugen / Abgeben von Zellsuspension-wässrigen DEX Phasengemisch). Die gesamte Einrichtung ist in einem Standard-biologischen Sicherheitswerkbank, um die Sterilität zu erha...

Ein Protokoll für den robotergestützten Druck von Krebszell-Sphäroiden in einem 96-Well-Plattenformat mit hohem Durchsatz unter Verwendung eines wässrigen Zweiphasensystems wird vorgestellt.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Krebszellen in einem standardisierten Hochdurchsatzformat aufzubereiten, um sie für die Prüfung von Anti-Krebs-Wirkstoffen verwenden zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Polymere, Polyethylenglykol und Dextran, in Zellkulturmedium in vorbestimmten Konzentrationen gelöst werden, um ein funktionierendes wässriges Zweiphasensystem zu bilden. Der zweite Schritt besteht darin, die gewünschten Zellen in doppelter gewünschter Zelldichte vorzubereiten und die Zellsuspension mit einem gleichen Volumen der wässrigen Dextran-Phase zu vermischen. Füllen Sie dann eine 96-Well-Platte mit der wässrigen Polyethylenglykol-Phase und geben Sie mit einem Flüssigkeitsmanipulationsroboter Submikroliter-Tropfen der zellhaltigen Dextran-Phase in die Vertiefungen ab. Der nächste Schritt besteht darin, nach 24-stündiger Inkubation die Bildung von Sphäroiden in der 96-Well-Platte zu überprüfen und direkt die gewünschten Anti-Krebs-Wirkstoffe zu den Vertiefungen hinzuzufügen. Schließlich wird ein handelsüblicher, plattenleser-kompatibler Vitalitätsassay verwendet, um die prozentuale Überlebensfähigkeit der mit Wirkstoff behandelten Sphäroide im Vergleich zu unbehandelten Kontroll-Sphäroiden darzustellen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Hänge-Tropfen-Methode oder dem mikrofabrizierten Vertiefungsansatz liegt darin, dass keine speziell angefertigten Platten oder Geräte benötigt werden und eine Hochdurchsatz-Sphärenbildung sowie Wirkstoffprüfung ermöglicht wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsforschung zu beantworten und die Entdeckung von anti-krebschemotherapeutika zu beschleunigen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Krebstherapie hinein, da sie ein Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen anhand relevanterer Tumormodelle ermöglicht, um neue Anti-Krebs-Wirkstoffe zu identifizieren. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden bequem Krebszell-Steroiden und Mikro-Platten herstellen und mühelos Arzneimittelbehandlungsversuche unter Verwendung von Standard-Laborausrüstung und robotischen Werkzeugen durchführen können. Zunächst 0,5 Gramm Polyethylenglykol abwiegen und zu 9,5 Milliliter vollständigem Wachstumsmedium in einem sterilen 15-Milliliter-Konischkolben hinzufügen. Die Mischung eine Minute lang verwirbeln, um 10 Milliliter einer 5 %igen (Gewicht pro Volumen) wässrigen Polyethylenglykol-Phase herzustellen. Danach 0,128 Gramm Dextran abwiegen und zu 0,87Zwei Milliliter komplettes Wachstumsmedium in einem sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen verwirbeln. Diese Mischung eine Minute lang, um einen Milliliter einer 12,8 %igen (Gewicht pro Volumen) wässrigen Dextran-Phase herzustellen. Beide Lösungen, die aus Polyethylenglykol und Dextran bestehen, eine Stunde lang in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad stellen.Zur Unterstützung der vollständigen Auflösung. Stellen Sie sicher, dass die Verschlüsse über dem Wasserstand bleiben, um eine mögliche Kontamination nach einer Stunde zu vermeiden. Entfernen Sie die Polyethylenglykol-Gesichtslösung und füllen Sie sie in eine sterile fünf Milliliter-Plastikspritze.Lassen Sie die Lösung durch einen Spritzenvorfilter mit 0,2-Mikron-Porengröße laufen, um Verunreinigungen zu entfernen. Lagern Sie sowohl die Polyethylenglykol- als auch die Dextran-Phasenlösungen bis zu 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius vor der Verwendung. Kultivieren Sie die gewünschten Krebszelllinien, beispielsweise die Brustkrebszelllinie M-D-A-M-B 1 57, bis sie 90 bis 100 % konfluent sind.Anschießend die Zellen mit Standardmethoden gewinnen und die Ausbeute auf einem Hämozytometer bestimmen; das Pellet in einer Mischung aus der Hälfte Wachstumsmedium und der Hälfte Strandslösung auf eine Konzentration von 50 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendieren. Dies gewährleistet eine Dichte von etwa 15.000 Zellen pro 0,3-Mikroliter-Tropfen; 50 Mikroliter der filtrierten 5%igen wässrigen Polyethylenglykol-Phase in jede Vertiefung einer nicht-adhärenten 96-Loch-Platte geben, die wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben zuvor mit Onic codiert wurde. Die Polyethylenglykol-Addition kann manuell mit einer Mehrkanalpipette oder robotisch mit einem Flüssigkeitshandler unter Verwendung einer Pipette durchgeführt werden; die Zellsuspension durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mischen, um sie erneut in Suspension zu bringen.Suspendieren Sie alle Zellen, die sich im Laufe der Zeit abgesetzt haben. Geben Sie 20 Mikroliter der Suspension in jedes andere Loch einer Spalte einer 384-Loch-Platte. Schalten Sie dann den Flüssigkeitshandler ein und fahren Sie den Pipettierteil in die Ausgangsposition.Um die Koordinaten zu registrieren, platzieren Sie die Quellplatte, die Zielplatte und die Pipettenspitzenkästen an definierten Positionen auf der Arbeitsstation des Flüssigkeitsmanipulators. Wählen Sie mithilfe des automatisierten Flüssigkeitsmanipulators ein Mischvolumen, das ungefähr einem Drittel des Zellsuspensionsvolumens entspricht, und laden Sie eine Spalte der Pipettierköpfe des Flüssigkeitsmanipulators mit Mischpipettenspitzen von der Arbeitsstation. Benutzen Sie den Flüssigkeitsmanipulator, um die Zellsuspension in der 384-Loch-Quellplatte zu mischen.Danach entsorgen Sie die Spitzen in eine leere Auffangbox für verbrauchte Spitzen. Als Nächstes bestücken Sie eine Säule der Pipettiernadeln am Pipettierkopf mit 10-Mikroliter-Dispensierspitzen. Verwenden Sie den Flüssigkeitshandler, um 0,3 Mikroliter der Zellsuspension aus der Quellplatte in jede Pipettenspitze aufzusaugen.Gegeben Sie dann die Zellsuspension in die Vertiefungen einer Spalte der Zielplatte, die 50 Mikroliter der 5 %igen Polyethylenglykol-Phase enthält. Verwenden Sie eine Abgabehöhe von 0,5 Millimetern und geben Sie den Tropfen mit einer Flussrate von einem Mikroliter pro Sekunde oder langsamer ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Spalten der Zielplatte einmal mit Zellen belegt sind. Danach entfernen Sie die Zielplatte vorsichtig von der Arbeitsstation und inkubieren die Zellen 24 Stunden lang in einer befeuchteten Umgebung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor eine Behandlung mit Wirkstoffen erfolgt.Visuell bestätigt die Steroidbildung in jedem Well der 96-Well-Platte nach 24 Stunden Kultivierung. Verwenden Sie eine serielle Verdünnung, um ein gewünschtes Medikament wie Cisplatin zur Untersuchung vorzubereiten. Verdünnen Sie die Stammlösung des Medikaments in Kulturmedium, sodass jede Verdünnung die doppelte endgültige gewünschte Konzentration aufweist.Bis zu fünf verschiedene Konzentrationen können pro 96-Loch-Platte getestet werden. Geben Sie 50 Mikroliter der Wirkstofflösung in die Polyethylenglykol-Phase jedes Lochs. Verwenden Sie zwei Spalten mit jeweils acht Löchern pro Behandlungsgruppe, einschließlich einer Kontrollgruppe, der nur Medium zugesetzt wird.Die Steroide 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie nach 48 Stunden frische Verdünnungen des Wirkstoffs vor und erneuern Sie den Wirkstoff, indem Sie 50 Mikroliter Medium mit frischem Wirkstoff in der gewünschten Konzentration hinzufügen. Inkubieren Sie den PHE weitere 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid im Dunkeln. Fügen Sie anschließend, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, ein Reagenz zur Bestimmung der Zellviabilität in jedes Well hinzu und inkubieren Sie die Platte sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, geschützt vor Licht. Sobald der Assay abgeschlossen ist, stellen Sie die Platte in einen Mikroplatten-Reader und messen das Fluoreszenzsignal bei 560 beziehungsweise 590 Nanometer Anregungs- und Emissionswellenlänge. Das Hochdurchsatz-Screening von Anti-Krebs-Wirkstoffen erfordert eine reproduzierbare Methode, um Hunderte von gleichmäßig großen Steroiden zu bilden.Der hier gezeigte Graph unterstreicht die Reproduzierbarkeit dieser Methode zur Bildung von Sphäroiden. In einer standardmäßigen 96-Loch-Platte ergaben sich durchschnittliche Durchmesser von 332 Mikrometern mit einer Standardabweichung von weniger als 10 %. Die Variationen der Sphäroid-Durchmesser entsprachen typischen Werten einer Normalverteilung. Als die Sphäroide vier Tage lang unterschiedlichen Konzentrationen von Cisplatin, einem klinischen Chemotherapeutikum, ausgesetzt wurden, zeigten sie eine dosisabhängige Reaktion auf die Behandlungen.Die resultierende 50 %-tötliche Dosis der Wirkstoffkonzentration betrug 4,67 µM. Die Behandlung mit tödlichen Wirkstoffkonzentrationen zerstörte Krebszellen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in etwa zwei Stunden abgeschlossen werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, schnell die Bildung einer wässrigen Zweiphasenmischung zu überprüfen, bevor mit den Steroid-Druck-Experimenten begonnen wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Kryoschnitte, immunhistochemische Färbung von Steroidproben und andere biologische Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den molekularen Wirkorten von Wirkstoffen in Krebszellen-Steroiden zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man auf einfache Weise 3D-Krebszellkulturen herstellt und mithilfe von Standardplatten und -geräten eine Wirkstoffprüfung in hoher Durchsatzleistung durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir führen ein Protokoll für die Erzeugung einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) von einheitlicher Größe und Zusammensetzung gesteuerten Tumorsphäroide mit handelsüblichen Mikrotiterplatten.

Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.

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Dieses Protokoll dient zur Immuntherapie umgeleiteten T-Zellen (Auto T-Zelle) Zytotoxizität gegen 3D strukturierte Krebszellen (Sphäroide) in Echtzeit zu bewerten.

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Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.

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Dieser Artikel demonstriert eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumorsphäroide. Eine Strategie zur Sphäroidbeobachtung und bildbasierten Deep-Learning-Analyse unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems wird ebenfalls beschrieben.

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In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

Erfahren Sie die robotergestützte Produktion von Krebszellsphäroiden mit einem wässrigen Zweiphasensystem für Hochdurchsatz-Tests. Diese Methode ermöglicht präzise Arzneimittelscreenings in 96-Well-Platten.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

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