Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Ein Protokoll für den robotergestützten Druck von Krebszell-Sphäroiden in einem 96-Well-Plattenformat mit hohem Durchsatz unter Verwendung eines wässrigen Zweiphasensystems wird vorgestellt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den pH-Wert von Krebszellen in einem Standard-Hochdurchsatzformat zu bilden, um sie in der Testung von Krebsmedikamenten zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Polymere, Polyethylenglykol und Dextran, in Zellkulturmedium in vorgegebenen Konzentrationen gelöst werden, um ein erfolgreiches wässriges Zweiphasensystem zu bilden. Der zweite Schritt besteht darin, die interessierenden Zellen mit der doppelten Zelldichte zu präparieren und die Zellsuspension mit einem gleichen Volumen der wässrigen Dextranphase zu mischen.

Füllen Sie dann eine 96-Well-Platte mit der wässrigen Polyethylenglykolphase und geben Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter Tröpfchen im Submikroliterbereich der Zelle mit Dextranphasentropfen in die Wells ab. Der nächste Schritt besteht darin, die Sphäroidbildung in den 96-Well-Platten nach 24-stündiger Inkubation zu bestätigen und die für sie interessanten Krebsmedikamente direkt in die Wells zu geben. Schließlich wird ein mit einem Standardplattenleser kompatibler Viabilitätsassay verwendet, um die prozentuale Lebensfähigkeit von medikamentös behandelten Steroiden zu zeigen, die im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollkugeln normalisiert sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Hanging Drop-Methode oder dem mikrofabrizierten Well-Ansatz besteht darin, dass sie keine kundenspezifischen Platten oder Vorrichtungen erfordert und einen hohen Durchsatz bei der Kugelbildung und Wirkstofftests ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Krebsforschung zu beantworten und die Entdeckung von Chemotherapeutika gegen Krebs zu beschleunigen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krebs, da sie ein Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen mit relevanteren Tumormodellen ermöglicht, um neue Krebsmedikamente zu identifizieren.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können bequem Krebszellsteroide und Mikrotiterplatten formen und problemlos Experimente zur medikamentösen Behandlung mit Standard-Laborkleidung und Roboterwerkzeugen durchführen. Wiegen Sie zunächst 0,5 Gramm Polyethylenglykol ab und fügen Sie es zu 9,5 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium in einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen Vortex hinzu, die Mischung für eine Minute, um 10 Milliliter einer wässrigen Polyethylenglykolphase von 5 % pro Volumen herzustellen. Wiegen Sie dann 0,128 Gramm Dextran ab und fügen Sie es zu 0,87 hinzu.

Zwei Milliliter vollständiges Wachstumsmedium in einem sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen Vortex. Diese Mischung für eine Minute, um einen Milliliter einer wässrigen Dextranphase von 12,8 Gew.-% pro Volumen herzustellen. Legen Sie sowohl die Polyethylenglykol- als auch die Dextranlösung eine Stunde lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Um bei der vollständigen Auflösung zu helfen. Stellen Sie sicher, dass die Verschlüsse nach einer Stunde über dem Wasserspiegel bleiben, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Entfernen Sie die Polyethylenglykol-Gesichtslösung und füllen Sie sie in eine sterile Fünf-Milliliter-Kunststoffspritze.

Lassen Sie die Lösung durch einen Spritzenoberfilter mit 0,2 Mikrometern Poren, um Verunreinigungen zu entfernen. Lagern Sie sowohl die Polyethylenglykol- als auch die Dextran-Phasenlösung vor der Verwendung bis zu 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Züchten Sie Krebszellen von Interesse, wie z. B. die Brustkrebszelllinie M-D-A-M-B 1 57, bis sie zu 90 bis 100 % konfluent sind.

Ernten Sie dann die Zellen mit Standardtechniken und zählen Sie die Ausbeute auf einem Hämozytometer, resuspendieren Sie das Pellet auf eine Konzentration von 50 Millionen Zellen pro Milliliter in einer Mischung aus Halbwachstums-, Mittel- und Halbstranglösung. Dies gewährleistet eine Dichte von etwa 15.000 Zellen pro 0,3 Mikroliter Tröpfchen: Dispensieren Sie 50 Mikroliter der gefilterten 5%igen wässrigen Polyethylenglykolphase in jede Vertiefung einer nicht adhärenten 96-Well-Platte, die mit Onic vorcodiert wurde, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Die Polyethylenglykol-Edition kann manuell mit der Mehrkanalpipette oder robotergestützt mit einem Liquid Handler erfolgen, wobei eine Pipette verwendet wird. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie sie vorsichtig auf und ab zur Resus pipettieren.

Unterbrechen Sie alle Zellen, die sich im Laufe der Zeit angesetzt haben. Geben Sie 20 Mikroliter der Suspension aus einer Säule einer 384-Well-Platte in jede zweite Vertiefung. Schalten Sie dann den Liquid Handler ein und setzen Sie den Pipettierkopf ein.

Um die Koordinaten zu registrieren, platzieren Sie die Quellplatte, die Zielplatte und die Pipettenspitzenboxen an definierten Positionen auf dem Arbeitsplatz des Liquid Handlers. Wählen Sie mit dem automatisierten Liquid Handler ein Mischvolumen, etwa ein Drittel des Zellsuspensionsvolumens, und laden Sie eine Säule mit Fässern aus dem Pipettierkopf des Liquid Handlers mit Mischpipettenspitzen von der Workstation. Verwenden Sie den Liquid Handler, um die Zellsuspension in der 384-Well-Quellplatte zu mischen.

Werfen Sie dann die Spitzen in eine leere Taillenspitzenbox. Laden Sie anschließend eine Säule Fässer aus dem Pipettierkopf mit 10 Mikroliter-Pipettenspitzen. Verwenden Sie den Liquid Handler, um 0,3 Mikroliter der Zellsuspension von der Quellplatte in jede Pipettenspitze zu aspirieren.

Geben Sie dann die Zellsuspension in die Vertiefungen einer Säule der Zielplatte, die 50 Mikroliter der 5%igen Polyethylenglykolphase enthält. Verwenden Sie eine Dosierhöhe von 0,5 Millimetern und dosieren Sie den Tropfen mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Sekunde oder langsamer. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Säulen in der Zielplatte mit den Zellen besetzt sind. Nehmen Sie die Zielplatte vorsichtig von der Arbeitsstation und inkubieren Sie die Zellen in einer befeuchteten Umgebung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden vor jeder medikamentösen Behandlung.

Bestätigt visuell die Steroidbildung in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte nach 24 Stunden in Kultur. Verwenden Sie die serielle Verdünnung, um ein Medikament von Interesse wie Cisplatin für den Test vorzubereiten. Verdünnen Sie die Stammarzneimittellösung in Nährmedien, so dass jede Verdünnung das Doppelte der gewünschten Endkonzentration beträgt.

Pro 96 können bis zu fünf verschiedene Konzentrationen getestet werden. Geben Sie auf der Well-Platte jeweils 50 Mikroliter der Arzneimittellösung in die Polyethylenglykolphase. Verwenden Sie zwei Säulen mit acht Vertiefungen pro Behandlungsgruppe, einschließlich einer Kontrollgruppe, in der nur das Medium hinzugefügt wird.

Inkubieren Sie Steroide mit dem Medikament für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid geschützt vor Licht. Bereiten Sie nach 48 Stunden frische Arzneimittelverdünnungen vor und erneuern Sie das Arzneimittel, indem Sie zusätzliche 50 Mikroliter Medien hinzufügen, die frisches Arzneimittel in der gewünschten Konzentration enthalten. Inkubieren Sie den PHE für weitere 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid vor Licht.

Geben Sie als Nächstes ein Reagenz für die Zellviabilität in jede Vertiefung, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, und inkubieren Sie die Platte sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid vor Licht. Wenn der Assay abgeschlossen ist, legen Sie die Platte in einen Mikroplatten-Reader und lesen Sie das Fluoreszenzsignal bei 560 bzw. 590 Nanometern Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen. Das Hochdurchsatz-Screening von Krebsmedikamenten erfordert eine wiederholbare Methode zur Bildung von Hunderten von Steroiden in einheitlicher Größe.

Die hier gezeigte Grafik unterstreicht die Reproduzierbarkeit dieser Methode zur Bildung von Sphäroiden. In einer Standardplatte mit 96 Vertiefungen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 332 Mikrometern und einer Standardabweichung von weniger als 10 % wurden die Schwankungen der Steroiddurchmesser als typisch für eine Normalverteilung festgestellt. Wenn die Sphäroide vier Tage lang unterschiedlichen Konzentrationen von Cisplatin, einem klinischen Chemotherapeutikum, ausgesetzt wurden, zeigten sie ein dosisabhängiges Ansprechen auf die Behandlungen.

Es wurde festgestellt, dass die resultierende Wirkstoffkonzentration von 50 % bei einer tödlichen Dosis 4,67 Mikromolare Arzneimittelbehandlung bei tödlichen Konzentrationen betrug. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden abgeschlossen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, schnell auf wässrige Zweiphasenbildung zu prüfen, bevor Sie mit Steroiddruckexperimenten fortfahren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Kryosektionen von Steroiden, immunhistochemische Färbung von Proben und andere biologische Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu molekularen Zielen von Medikamenten in Krebszellsteroiden zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie auf bequeme Weise 3D-Krebszellkulturen bilden und Arzneimitteltests mit hohem Durchsatz mit Standardplatten und -geräten durchführen können.