Name: Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Lernen Sie den COMET-Assay zur indirekten Messung oxidativen Stresses in menschlichen Leukozyten. Diese Methode quantifiziert DNA-Schäden durch Fluoreszenzmikroskopie und Softwareanalyse.

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Wir möchten die LHW Stiftung zu danken, in Triesen Liechtenstein, für die finanzielle Unterstützung unserer Forschung auf oxidativen Stress.

Studien über Comet-Assay in der Universität Basel durchgeführt, Augenklinik wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt Basel 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Vorbereitung Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (Ca ++, Mg ++ frei) Lösung durch Zugabe von PBS (1 L-Paket) und 990 ml dH 2 O zu den Medien. Den pH-Wert auf 7,4. Lagern bei RT. </li><li> Bereiten Lyselösung: So bereiten 1.000 ml hinzuzufügen 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) und 10 mM Trizma Base (1,2 g) in dH 2 O </li><li> Vorbereitung Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) durch Zugabe von 30 ml 10 M NaOH und 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs bis 1.500 ml dH 2 O und gut mischen. Das Gesamtvolumen hängt von der Gelbox Kapazität. Vor der Verwendung wird Den pH des Puffers auf einen pH-Wert von&gt; 13 zu gewährleisten. </li><li> Vorbereitung Neutralisierungspuffer, enthaltend 0,4 M Tris (48,5 g zugegeben, um ~ 800 ml dH 2 O, Einstellen des pH auf 7,5), eingeengt (&amp; #62; 10 M HCl) in 1.000 ml mit dH 2 O Bewahren Sie die Lösung bei RT. </li><li> Bereiten Färbelösung. Um Ethidiumbromid (EtBr; 10x Lager, 20 ug / ml) in 10 mg EtBr in 50 ml dH 2 O und Speicher bei RT. Für 1x Lager - mischen 1 ml mit 9 ml dH 2 O VORSICHTIG! Griff EtBr mit ausreichender Vorsicht, da es ein bekanntes Karzinogen. </li></ol> 2. Isolierung von Leukozyten <ol><li> Erhalten Humanblutproben (20 ml) mit Anti-Koagulationsmittel, wie Heparin mittels Venenpunktion. </li><li> Trennen Sie die Lymphozyten mit einem Dichtegradienten Zellseparator wie Histopaque. <ol><li> Kurz, verdünnte Blut in Verhältnis 1: 1 mit PBS oder RPMI (ohne FBS) und die Schicht mehr als 600 &amp; mgr; l Zelltrennflüssigkeit. </li><li> Zentrifuge 1.800 xg für 20 min bei 4 ° C. Saugen Sie das &#39;Buffy&#39; Mantel in 3-5 ml PBS / RPMI und bei 300 g für 10 min zentrifugiert, um die Lymphozyten zu pelletieren. </li><li> Abrufen Lymphozyten von knapp über Grenze zwischen PBS (RPMI) Und Zelltrennflüssigkeit, mit einem Pipette. Entfernen Sie die Leukozyten-Bands aus der Schnittstelle zwischen Plasma und den Zellseparator Flüssigkeitsschichten von jedem Röhrchen sammeln und in einen 50-ml-Tube. </li></ol></li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 50 ml mit kaltem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Dreimal mit DMEM Waschen der Zellsuspension bei 300 × g für 10 min. </li><li> Zählen der Gesamtzahl von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Die Zellen in PBS und Aliquot in Mikrozentrifugenröhrchen auf 10 7 Zellen / Röhrchen. </li><li> Pipette 0,4 ml der Zellen in einem 5 ml-Einweg-Kunststoffrohr. In 1,2 ml 1% niedriger Temperaturen gelierender Agarose bei 40 ° C. Mischen und schnell und pipettieren 1,2 ml der Zellsuspension auf das Agarose-bedeckten Oberfläche einer vorbeschichteten Folie. Vermeiden Sie Blasen entstehen. </li><li> Ermöglichen die Agarose ca. 2 min gelieren. Im Einklang mit der Zeit und Temperatur zum Gelieren verwendet, und sicherzustellen, dass Agarose vollständig vor Eintauchen in Lyse-Lösung eingestellt. Nach voll set, tauchen in Lyse-Lösung bei ca. 4 ° C. </li></ol> 3. Lysis und Elektrophorese HINWEIS: Die beschriebene Vorgehensweise ist für die Elektrophorese unter pH&gt; 13 alkalischen Bedingungen. <ol><li> Nach mindestens 2 Stunden bei ca. 4 ° C, entfernen Sie vorsichtig Folien aus der Lyselösung. Die Objektträger nebeneinander auf der horizontalen Elektrophoresekammer nahe einem Ende, verschiebbar sie so nahe wie möglich beieinander. </li><li> Füllen Sie die Pufferbehälter mit frisch zubereiteten pH&gt; 13 Elektrophoresepuffer, bis der Flüssigkeitspegel die Folien vollständig (zu vermeiden, Blasen über die Agarose) abdeckt. </li><li> Lassen Folien sitzen im alkalischen Puffer für 20 min bis zum Abwickeln der DNA und die Expression von alkalilabilen Schäden. </li><li> Stromversorgung einschalten, um 25 Volt (~ 0,75 V / cm), und stellen Sie den Strom auf 300 mA durch Anheben oder Absenken der Pufferstufe. Elektrophorese der Objektträger für 30 Minuten. </li><li> Schalten Sie das Gerät. Heben Sie die Folien aus dem Puffer und pSpitze auf einem Auffangwanne. Tropfenweise Beschichtung der Folien mit Neutralisationspuffer. Lassen Sie die Objektträger für mindestens 5 min zu sitzen. Ablassen Rutschen und zwei weitere Male wiederholen. </li><li> Färben die Objektträger mit 80 ul 1x Ethidiumbromid (EtBr) und lassen Sie für 5 Minuten und dann tauchen in gekühltes destilliertes Wasser, um überschüssige Fleck zu entfernen. Dann legen Sie ein Deckglas über den Objektträger und sofort speichern. Shop gleitet für einen Monat bei Raumtemperatur in trockener Umgebung. Hinweis: andere DNA Flecken (zB SYBR-Grün), können ebenfalls verwendet werden. Achtung! Schutzhandschuhe tragen, da die meisten Farbstoffe sind mutagen. </li></ol> 4. Quantifizierung der DNA-Brüche <ol><li> Um die DNA-Schäden zu visualisieren, beobachten die EtBr-gefärbten DNA Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop 40X-Objektiv. </li><li> DNA-Schädigung zu beurteilen quantitativ in den Zellen durch Messen der Länge der DNA-Migration und der Prozentsatz der migrierten DNA (1A). DNA-Schäden zu quantifizieren (1B) von der Schwanz Moment und Olive-moment. Definitionen von Schwanz-Moment und Olive -Moment eine effektvolle wurden bislang 8-10 gegeben. HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist es genug, um von einer der Parameter bleiben. Die Zellen werden durch Setzen des automatisiertes Tool, das über dem Objektträger und Fotografien Zellen scannt fotografiert. Die Quantifizierung der DNA-Brüche können durch Bildanalyse-Software-Pakete durchgeführt werden. Es gibt mehrere verschiedene Softwarepakete, die nach Maß sind, um das Bild der Zellen zu erfassen und zu quantifizieren, DNA-Schäden. Wir empfehlen, mit der gleichen Software-Paket während des Experiments. Die Labor-Techniker identifiziert der intakten Zelle oder Kometen auf dem Computer erzielt werden, und klickt mit der Maus auf sie. Der Komet oder intakte Zelle wird dann automatisch erzielt. </li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+fields+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li>
<li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer%3A+role+of+lipid+peroxidation%2C+DNA+damage%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li>
<li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair%3A+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li>
<li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li>
<li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Induc+Dis%22%5BJournal%5D)">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li>
<li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li>
<li>Gaivão, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+comet+assay%3A+insights%2C+uses%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304(2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li>
<li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li>
<li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage%3A+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li>
<li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood%3A+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li>
<li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li>
<li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station%5BTitle%5D)+AND+%22Electromagn+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li>
<li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li>
</ol>

Schwedische Wissenschaftler Ostling und Johanson als erste in ihrem Bereich zu Comet-Assay verwenden, um DNA-Schäden in Zellen 1 zu quantifizieren. Die neutralen Bedingungen, dass die beiden Wissenschaftler nutzten jedoch nur erlaubt den Nachweis von doppelsträngigen DNA-Brüche. Singh et al. Später angepasst den Test für den Einsatz unter alkalischen Bedingungen, die eine empfindliche Version, die Doppel- und Einzelstrang-DNA-Brüche zu bewerten und erkennen alkalilabile Websites 12 könnte hergestellt. Seit der ersten Entwicklung hat der Assay bei verschiedenen Schritten verändert wurde, um für die Bewertung Arten von DNA-Schädigung in verschiedenen Zelltypen 13-15 geeignet zu machen. Wie bei allen Techniken ist wichtig, zahlen viel Liebe zum technischen Details, um genaue Ergebnisse zu erhalten 16. Basierend auf unserer Erfahrung, die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn jeder Verfahrensschritt-Lösung von der Vorbereitung bis zur Kometen-Quantifizierung von Experten Labor techn geführticians. Die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien, angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und (wie zuvor im Ergebnisteil erwähnt) die Verwendung von frisch zubereiteten Leukozyten sind von wesentlicher Bedeutung, um für die Lyse und Gelelektrophorese, um genaue Ergebnisse zu erhalten 17. All die einzelnen Schritte in diesem Test sind für den Erhalt zuverlässige Ergebnisse ebenso wichtig. 16 In der Regel die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn jeder einzelne Verfahrensschritt aus der Lösung Vorbereitung bis Kometen Quantifizierung wird von Experten Labor technicians.Important geführt scheint die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien , angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und wie bereits im Ergebnisteil der Einsatz von frisch zubereiteten Leukozyten für die Lyse und Gelelektrophorese, angemessene Ergebnisse aus dem Test 17 ​​zu erhalten bezeichnet. Wie andere Methoden, hat die Comet-Assay-Technik seine ADVANteile und Nachteile. Als eine empfindliche Methode ist der Test anfällig für Faktoren (zB UV-Licht), die DNA-Brüche ergänzen und beeinflussen so Ergebnisse könnten. Jeder Faktor, erhöhen kann oxidativer Stress, außer der, die erforscht wird, sollte vermieden werden. Stressoren können Niveau von oxidativem Stress nicht nur in Leukozyten, sondern auch in allen anderen Blut Medien und Lymphozyten zu erhöhen. Wie bereits erwähnt gibt es viele verschiedene und direktere Methoden zur Messung der oxidativen Stress 18,19. Comet-Assay ist einer der vielen Methoden, die bestimmte Vorteile hat. Dazu gehören ihre relativ geringen Kosten, der geringen Anzahl von Zellen erforderlich ist (&lt;10.000 Zellen) und damit die kleine Proben von Blut pro Patient benötigt, die relativ kurze Zeitdauer erforderlich ist, um DNA-Schäden in Zellen (etwa 3 Tage) zu quantifizieren, dessen Empfindlichkeit und seine weit verbreitete Anwendbarkeit auf Eseln DNA-Schäden in verschiedenen Zelltypen. In der Vergangenheit wählen wir mit Leukozyten zu arbeiten, da wir hatten Erfahrung mit diesemZelltyp und es war zutreffend für den jeweiligen geplanten Studie. Ein weiterer Vorteil der Comet-Assay ist, dass es verwendet werden kann, um verschiedene Arten und Mengen an DNA-Schäden zu erkennen und kann somit in verschiedenen anderen Bereichen des Studiums neben oxidativen Stress, wie DNA-Reparatur Studien Supplementierung Versuche oder Genotoxizität Studien angewendet werden. Oxidativer Stress gilt heute als spielen eine kritische Rolle bei der Pathogenese mehrerer Krankheiten erkannt. Comet-Assay-Methode, wobei eine von vielen Möglichkeiten der Messung von oxidativem Stress 18,19, ist relativ einfach, vielseitig und kostengünstig. Wenn beherrscht, kann dieses Verfahren in allen Bereichen der Medizin, bei denen oxidativer Stress eine Rolle spielt 8-10,20,21 verwendet werden.

Comet Assay wurde zuerst von schwedischen Wissenschaftlern Ostling und Johanson 1 entwickelt. DNA ist ein negativ geladenes Molekül. Während der Elektrophorese, kleiner, beschädigte DNA-Fragmente zu reisen schneller zu einer positiv geladenen Anode 2. Je kleiner die DNA-Fragmente, desto schneller wird die Migration in Richtung der Anode eine typische &quot;Komet&quot; mit einem &quot;Kopf&quot; von intakten, unbeschädigte DNA und einem &quot;Schwanz&quot; der beschädigten DNA-Fragmente 3 zusammengesetzt, um zu bilden. Beschädigte DNA kann durch verschiedene Mechanismen im Körper 4, der die Erzeugung von DNA-Brüchen relativ ausgewogen 5 halten repariert werden. Wenn jedoch das Gleichgewicht zugunsten der DNA Pausen können die Brüche ansammeln und wird schließlich zu der Entwicklung einer Krankheit beitragen. Unsere DNA leidet etwa 0.000165% Schädigung zu einer gegebenen Zeit 6. Einzelsträngige DNA-Brüche beziehen sich auf einen Defekt an einem der beiden Stränge der DNA-Doppelhelixwohingegen doppelsträngige DNA-Brüche verursacht werden, wenn beide Stränge der DNA-Doppelhelix beschädigt sind. Es gibt verschiedene Faktoren, die die Menge an DNA-Brüche zu einem gegebenen Zeitpunkt wie das Alter der Zelle, Zigarettenrauch, verschiedene Medikamente oder oxidativen Stress 7-9 erhöhen kann. Wenn alle Faktoren, die zu einer verbesserten DNA-Brüche konstant gehalten werden, dann wird die Quantifizierung von DNA-Brüchen mittels Comet-Assay ist eine gute indirekte Parameter des oxidativen Stresses. Das Verfahren zur Comet-Assay wird heute zunehmend in der Medizin einschließlich der Augenheilkunde eingesetzt. Ein Grund dafür ist, dass oxidativer Stress mehr als Pathomechanismus für verschiedene Krankheiten, 8-11 und Comet-Assay erfasst ist eine Methode, mit der oxidativen Stress indirekt quantifiziert werden kann.

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Dinatrium-EDTA</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Ca++, Mg++ frei)</td><td>HiMedia</td> <td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Erforderliche Materialien für die Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Normalschmelzende Agarose (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Niedriger Schmelzpunkt Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (Nr. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten und Spitzen</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger, Konventionelle / Mikrogelelektrophorese (MGE) Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay als ein indirektes maß für systemische oxidativer stress

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Höheren eukaryotischen Organismen nicht ohne Sauerstoff leben; Paradoxerweise kann Sauerstoff für sie schädlich sein. Das Sauerstoffmolekül chemisch relativ inert, weil es zwei ungepaarten Elektronen in verschiedenen pi * Anti-Bindungsorbitalen entfernt. Diese beiden Elektronen parallel Spins, das heißt sie in der gleichen Richtung um ihre eigenen Achsen drehen. Deshalb ist die Sauerstoffmoleküls ist nicht sehr reaktiv. Aktivierung von Sauerstoff kann durch zwei verschiedene Mechanismen auftreten; entweder durch Reduktion über ein Elektron zu einem Zeitpunkt (monovalent Reduktion) oder durch die Absorption von genügend Energie, um den Spin eines der ungepaarten Elektronen umzukehren. Dies resultiert in der Produktion von reaktiven oxidativen Spezies (ROS). Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, wie der menschliche Körper eliminiert ROS in seinen physiologischen Zustand. Wenn ROS-Produktion übersteigt die Reparaturkapazität, oxidativer Stress Ergebnisse und Schäden unterschiedlichen Molekülen. Es gibt viele verschiedene Methoden, mit denen oxidativer Stress kann mich seingesicherter. Diese Handschrift konzentriert sich auf eine der Methoden namens Zell Gelelektrophorese, die auch als &quot;Comet Assay&quot;, die Messung der DNA-Brüche ermöglicht bekannt. Wenn alle Faktoren bekannt, DNA-Schädigung, ausgenommen oxidativen Stress verursachen konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung durch Comet-Assay gemessen wird, ein guter Parameter für oxidativen Stress. Das Prinzip ist einfach und beruht auf der Tatsache, dass DNA-Moleküle, sind negativ geladen. Ein intakter DNA-Molekül hat eine so große Größe, die nicht während der Elektrophorese nicht migrieren. DNA-Brüche, jedoch falls vorhanden führen zu kleineren Fragmenten, die im elektrischen Feld zur Anode hin bewegen. Kleinere Fragmente wandern schneller. Die Fragmente unterschiedliche Größen für das Ergebnis der Elektrophorese ist keine klare Linie, sondern ein Kontinuum mit der Form eines Kometen. Das System ermöglicht eine Quantifizierung der resultierenden &quot;Komet&quot; und damit der DNA-Brüche in der Zelle.

Obwohl das Verfahren der Comet-Assay macht reproduzierbare Ergebnisse, kann es durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden. Ein solcher Faktor ist, ob die Leukozyten vor der Lyse und Gelelektrophorese oder ob dieser Schritt auf frisch hergestellten Leukozyten geführt kryokonserviert. 2 zeigt, dass in der Gruppe 2, wobei Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese ss- DNA kryokonserviert Pausen waren signifikant höher als in Gruppe 1, wo die Lyse und Gel -electrophoresis wurde auf frisch zubereitete Zellen durchgeführt. Der Assay kann auch verwendet werden, um indirekt zu beurteilen systemischen oxidativen Stress. Tabelle 1 zeigt die deskriptiven Statistiken für Schwanz Moment und Oliven Moment bei Rauchern und gesunden Probanden. Die Daten zeigen, dass das Rauchen eine halbe Packung Zigaretten täglich mehr als verdoppelt ssDNA Brüche in den zirkulierenden Leukozyten 9. <img alt="1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Abbildung 1 (a) zeigt das Mikroskop während der Comet-Assay-Analyse verwendet. (B) Δ zeigt eine typische &quot;Komet&quot; mit einem hellen Kopf und Schwanz (beschädigt kleiner DNA-Fragmente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Abbildung 2. ssDNA Pausen waren signifikant höher als Leukozyten wurden (Gruppe 2) kryokonserviert als frisch hergestellt Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese verwendet. <imgalt = &quot;Tabelle 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabelle 1. Raucher hatten mehr als die doppelte Anzahl von ssDNA bricht im Vergleich zu Alter und Geschlecht gesunden Nichtrauchern.

Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den COMET-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst Leukozyten aus menschlichen Blutproben isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit niedrigschmelzendem Agarose zu mischen und die Zellen auf Objektträgern zu immobilisieren.Anschließend werden die Zellen zwei Stunden lang lysiert, gefolgt von einer Elektrophorese nach Anfärbung der Objektträger mit Diumbromid. Die DNA wird mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Letztendlich werden DNA-Strangbrüche durch eine Software-Analyse der Fluoreszenzmikroskopiedaten quantifiziert.Heute wissen wir, dass oxidativer Stress eine entscheidende Rolle in der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen spielt, darunter natürlich auch Augenerkrankungen. Es gibt zahlreiche verschiedene Methoden, um oxidativen Stress zu messen. Eine Möglichkeit, ihn indirekt zu bestimmen, ist mittels des Comet-Assays.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine einfache, kostengünstige und zuverlässige Methode darstellt, mit der wir oxidativen Stress indirekt messen können. Die Lucas-Leukozyten für dieses Experiment werden aus menschlichen Blutproben isoliert, die mittels Venenpunktion unter Verwendung eines Antikoagulans gewonnen wurden, um die Lymphozyten zu trennen. Verdünnen Sie das Blut zunächst im Verhältnis 1:1 mit PBS. Anschließend schichten Sie 600 Mikroliter einer Dichtegradienten-Zellseparationsflüssigkeit, wie beispielsweise Histo-Paque, auf und zentrifugieren bei 1.800 × g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie die Buffy Coat in drei bis fünf Milliliter PBS und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 ×g. Um die Lymphozyten mit einem Pipettiergerät zu gewinnen, entnehmen Sie die Lymphozyten direkt oberhalb der Grenzfläche zwischen PBS und der Zellseparationsflüssigkeit. Entfernen Sie die Leukozytenbänder von der Grenzfläche zwischen der Plasmaschicht und der Zellseparationsflüssigkeit in jedem Röhrchen und sammeln Sie sie in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Bringen Sie das Gesamtvolumen mit kaltem PBS auf 50 Milliliter. Waschen Sie die Zellsuspension dreimal mit PBS bei 300 ×g für 10 Minuten. Zählen Sie nach dem dritten Waschschritt die Gesamtzahl der Zellen mithilfe eines Hämozytometers.Suspendieren Sie die Zellen in PBS und Eloqua in Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 10 Millionen Zellen pro Röhrchen. Pipettieren Sie 0,4 Milliliter Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Wegwerfplastikröhrchen. Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension zu 500 Mikrolitern einer 1 %igen Lösung mit niedriger Geliertemperatur.Agarose bei 40 Grad Celsius, vorab zubereitetes Gemisch, und pipettieren Sie schnell 50 Mikroliter der Zellsuspension auf die mit Agarose bedeckte Oberfläche eines vorgespannten Objektträgers. Lassen Sie die Agarose etwa zwei Minuten bei vier Grad Celsius gelieren. Achten Sie auf Konsistenz bezüglich Zeit und Temperatur während des Gelierens und stellen Sie sicher, dass die Agarose vollständig erstarrt ist, bevor Sie mit der Lyseprozedur fortfahren.Sobald das Agarosegel vollständig erstarrt ist, tauchen Sie die Objektträger mindestens zwei Stunden lang in eine Lysepufferlösung bei vier Grad Celsius ein. Danach nehmen Sie die Objektträger vorsichtig aus der Lysepufferlösung heraus. Stellen Sie die Objektträger nebeneinander an einem Ende einer horizontalen Gelelektrophoresekammer auf, und schieben Sie sie so nah wie möglich zueinander. Füllen Sie die Pufferreservoirs mit frisch hergestelltem Elektrophoresepuffer mit einem pH-Wert über 13. Beachten Sie, dass die hier demonstrierte Methode für die Elektrophorese gilt. Unter alkalischen Bedingungen mit einem pH-Wert über 13 füllen Sie die Pufferreservoirs, bis der Flüssigkeitsstand die Objektträger vollständig bedeckt.Vermeiden Sie Blasen über den Aros. Lassen Sie den Objektträger 20 Minuten im alkalischen Puffer, um die Entwindung der DNA und die Expression von alka­lisch induzierten Schäden zu ermöglichen. Schalten Sie nach 20 Minuten die Stromversorgung auf 25 Volt ein und stellen Sie einen Strom von 300 Milliampere ein, indem Sie den Pufferstand anheben oder absenken.Elektrophorese der Objektträger für 30 Minuten. Nach 30 Minuten das Gerät ausschalten. Die Objektträger vorsichtig aus dem Puffer heben und auf ein Auffangtablett legen, wobei sie tropfenweise mit einem Neutralisationspuffer beschichtet werden.Lassen Sie die Objektträger mindestens fünf Minuten lang stehen. Entfernen Sie die Flüssigkeit von den Objektträgern und wiederholen Sie die Beschichtung zwei weitere Male mit Neutralisierungspuffer. Färben Sie anschließend die Objektträger mit einem Milliliter eines x Ethereumbromid fünf Minuten lang.Tragen Sie Schutzhandschuhe, da Ahy-Bromid ein bekanntes Karzinogen ist. Nach fünf Minuten tauchen Sie die Objektträger in gekühltes destilliertes Wasser, um überschüssige Färbung zu entfernen. Anschließend legen Sie einen Deckgläser über jeden Objektträger.Bewahren Sie die Objektträger sofort auf. Gefärbte Objektträger können einen Monat lang bei vier Grad Celsius unter trockenen Bedingungen gelagert werden. Um DNA-Schäden zu beurteilen, betrachten Sie den mit Atheriumbromid gefärbten DNA-Objektträger unter einem fluoreszierenden Mikroskop mit 40x-Objektiv.Stellen Sie das automatisierte Werkzeug ein, das das Mikroskop abfährt, um die Zellen im Kometen-Assay zu scannen und zu fotografieren. Die DNA-Schädigung wurde quantitativ in den Zellen durch Messung der Länge der DNA-Migration und des Prozentsatzes an migrierter DNA bewertet. Die schwarze Pfeilspitze zeigt einen typischen Kometen mit einem hellen Kopf und Schwanz.Der Kopf besteht aus intakter, unbeschädigter DNA, und der Schwanz besteht aus kleineren, beschädigten DNA-Fragmenten. Obwohl der COMET-Assay reproduzierbare Ergebnisse liefert, kann er durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden, beispielsweise dadurch, ob der Assay an frisch präparierten Leukozyten durchgeführt wird. In diesem Diagramm ist das Schwanzmoment als Produkt aus der Schwanzlänge und dem Schwanz definiert.Der DNA-Anteil an der Gesamt-DNA bei Leukozyten der Gruppe zwei, die vor der Lyse und Elektrophorese kryokonserviert wurden, weist signifikant mehr Einzelstrang-DNA-Brüche auf als frisch präparierte Leukozyten der Gruppe eins. Dieser Assay kann ebenfalls verwendet werden, um indirekt systemischen oxidativen Stress zu bewerten. Hierbei stellt das Olive-Moment das Produkt aus dem Prozentsatz der Gesamt-DNA im Schwanz und dem Abstand zwischen den Massenzentren des Kopf- und Schwanzbereichs dar.Ergebnisse von alters- und geschlechtsangepassten Rauchern und gesunden Probanden zeigen, dass das tägliche Rauchen einer halben Schachtel Zigaretten die Anzahl der Einzelstrang-DNA-Brüche in den zirkulierenden Leukozyten mehr als verdoppelt. Sobald die Technik beherrscht ist, bietet sie mehrere Vorteile, darunter ihre relativ geringen Kosten, die geringe Anzahl an Zellen – und somit die kleine Blutprobe pro Patient – sowie die relativ kurze Zeit, die zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Zellen benötigt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Video zeigt den Kometen-Assay zum Nachweis von DNA-Schäden nach Exposition gegenüber schädlichen Stoffen. Unter alkalischen Bedingungen wickelt sich die DNA ab und denaturiert, und bei der Elektrophorese wandern die unbeschädigte und die beschädigte DNA unterschiedlich im Agarosegel und bilden eine kometenförmige Struktur. Die langsam wandernde unbeschädigte DNA bildet den kreisförmigen Kometenkopf, während die schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmente den länglichen Kometenschweif...

Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Dieses Video zeigt den Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanzen-Assay (TBARS) zur Beurteilung von oxidativem Stress in biologischen Proben.

Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen zur Beurteilung von oxidativem Stress im Humanserum

Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

Der alkalische Kometen-Assay misst DNA-Strangbrüche in eukaryotischen Zellen. Durch Hinzufügen eines Endonuklease III- oder humanen 8-Oxoguanin-DNA-N-Glykosylase-Verdauungsschritts kann der Assay oxidative DNA-Schäden effizient nachweisen. Wir beschreiben Methoden zur Verwendung dieser Assays zum Nachweis von DNA-Schäden in der Leber von Ratten.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Der Kometentest ist ein beliebtes Mittel zum Nachweis von DNA-Schäden. Diese Studie beschreibt einen Ansatz zum Ausführen von Objektträgern in repräsentativen Varianten des Kometenassays. Dieser Ansatz erhöhte die Anzahl der Proben signifikant und verringerte gleichzeitig die Assay-Laufzeit, die Anzahl der Objektträgermanipulationen und das Risiko einer Beschädigung von Gelen.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Dieses Protokoll beschreibt eine effektive Methode zur Quantifizierung des Unterschieds in der DNA-Schädigung, die durch Typ-I- und Typ-II-Inhibitoren in FLT3-mutierten Zellen durch Anwendung des Comet-Assays induziert wird.

Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

Lernen Sie den COMET-Assay zur indirekten Messung oxidativen Stresses in menschlichen Leukozyten. Diese Methode quantifiziert DNA-Schäden durch Fluoreszenzmikroskopie und Softwareanalyse.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

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