Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Einfluss toxischer Chemikalien auf die Migration endothelialer Zellen mithilfe verschiedener Migrationsassays zu untersuchen. Zunächst wird im nächsten Experiment die Anwendung eines modifizierten Vermeidungskammer-Assays zur Untersuchung der Chemokinese exponierter endothelialer Zellen demonstriert. Ein Wundheilungs-Assay wird mit einer Zellverfolgung kombiniert, um zusätzliche detaillierte Informationen über die Dynamik der Zellmigration bereitzustellen.

Im abschließenden Test wird die Untersuchung des mitochondrialen Membranpotentials zur Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen einer beeinträchtigten endothelialen Zellmigration demonstriert. Letztendlich können diese Migrationsassays verwendet werden, um die Wirkungen hochtoxischer alkylierender Agenzien auf das mitochondriale Membranpotential und die Migration endothelialer Zellen zu bewerten. Die Methoden können helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der durch hochtoxische Chemikalien induzierten Wundheilungsstörungen zu beantworten, wobei die Verfahren ramat, voer und Stefan Miller, alle Techniker aus meinem Labor, demonstrieren werden. Um die Zellkulturflaschen vorzubereiten, geben Sie zunächst ein ausreichendes Volumen frisch zubereiteter Gelatine in eine sterile Zellkulturflasche, sodass der Boden gerade bedeckt ist.

Stellen Sie den Kolben mindestens 30 Minuten lang in einen Zellkultur-Inkubator. Danach entfernen Sie die verbleibende Gelatinelösung und überführen die aus embryonalen Stammzellen stammenden frühen endothelialen Zellen oder EEC in ausreichend Medium, um die Zellen bis zur 80 %igen Konfluenz zu kultivieren, sobald die Zellen subkonfluent sind. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und inkubieren Sie sie mit einem Milliliter Accutase pro 25 Quadratzentimeter für zwei bis zehn Minuten.

Wenn sich die Zellen gelöst haben, teilen Sie sie im Verhältnis 1 zu 5 in frischem Medium für die Analyse der endothelialen Zellmigration mittels Boyden-Kammer-Assay auf. Beschriften Sie zuvor die Filtereinsätze mit 500 Mikrolitern frisch zubereiteter 0,1 %igen Gelatin. Nachdem die EEC wie gerade gezeigt gewonnen wurden, zählen Sie die Zellen und geben Sie 500 Mikroliter Zellkulturmedium in die unteren Kammern der Boyden-Kammer.

Als Nächstes genau 1 × 10⁴ EEC in 500 Mikroliter Medium zu jedem Filter hinzufügen. Danach, nach Entfernung eventueller Luftblasen, die Boyden-Kammer für genau acht Stunden in den Inkubator stellen. Am Ende der Inkubation die Filter einmal mit PBS spülen.

Danach die Zellen nach 20 Minuten durch Zugabe von 0,5 Milliliter 4 %igem Paraformaldehyd in beide Kompartimente fixieren. Die Filter mindestens dreimal mit 0,1 molarer PBS waschen und die Membranen mit dem Skalpell ausschneiden. Jede Membran mit Montagemedium, das mit DPI ergänzt ist, zwischen zwei Glasdeckgläsern eindecken.

Beachten Sie dabei die Ausrichtung der Filter. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop mit einer 400-fachen Vergrößerung, um ausschließlich die Zellen zu zählen, die in die untere Kammer migriert sind. Achten Sie darauf, die Poren nicht mit den migrierenden Zellen zu verwechseln.

Um den Wundheilungs-Assay zu starten, heben Sie die Zellen manuell von einer 80 % konfluenten EEC-Kulturschale ab, indem Sie eine sterile 10-Mikroliter-Pipettenspitze sanft in einer geraden Linie über die Oberfläche der Kultur von einer Seite der Schale zur anderen bewegen. Spülen Sie die Platte zweimal mit 0,1-molarer PBS, um die abgelösten Zellen zu entfernen. Anschließend fügen Sie dem Kulturbehälter Medium mit der Substanz der Untersuchung hinzu.

Danach die Kulturschale unter einem Mikroskop montieren, das Live-Cell-Bildgebung unter Zellkulturbedingungen ermöglicht, und Zeitrafferaufnahmen über einen Zeitraum von 24 Stunden in 10-Minuten-Abständen aufnehmen, wobei am Ende der Bildgebungssitzung mindestens eine Auflösung von 1024 × 1024 verwendet wird. Mit dem geeigneten Softwaretool die Spaltbreite zu den Zeitpunkten 0 und 24 Stunden messen, um einen Zellverfolgungs-Assay durchzuführen. Die Bildsequenz in ImageJ importieren und das MT-TrackJ-ImageJ-Plugin aktivieren.

Danach mithilfe des Add-Befehls zufällig 10 Zellen im Sichtfeld auswählen, um manuell die Bewegung der Zellen über den 24-stündigen Bildgebungszeitraum zu verfolgen. Verwenden Sie den Measure-Befehl, um die Ergebnisse anzuzeigen. Anschließend verwenden Sie den Movie-Befehl, um die Spuren zu exportieren, um das mitochondriale Membranpotential der Zellen nach Behandlung mit der experimentellen Verbindung von Interesse zu bewerten; ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch zwei Mikroliter frisch zubereitetes TMRM in einem Milliliter frischem Zellkulturmedium.

Mittel, dann ohne Waschen sofort die Schale unter das Mikroskop stellen und Bilder der Kontroll- und experimentell behandelten Zellen aufnehmen, ohne die Aufnahmeparameter zu ändern. Um die Vergleichbarkeit zwischen den verschiedenen Gruppen sicherzustellen, erfordert die Wundheilung Angiogenese, die von der Migration endothelialer Zellen abhängt, wie durch die Grafik veranschaulicht wird. Die Exposition der EEC gegenüber dem alkylierenden Agenz Chlorambucil führt zu einer signifikanten Abnahme der Zellmigration, gemessen mittels Boyden-Kammer-Assay. Der Zusatz des reaktiven Sauerstoffspezies- oder ROS-Scavengers Alpha-Linolensäure unmittelbar nach 24-stündiger Chlorambucil-Exposition kompensiert das Phänotyp fast bis auf Kontrollniveau.

Der Boyden-Kammer-Test liefert jedoch keine Informationen über das Migrationsverhalten der Zellen in diesem repräsentativen Wundheilungsassay. Die nicht behandelten EEC konnten die Lücke innerhalb von 24 Stunden schließen, während die mit Chlorambucil behandelten EEC dies nicht konnten. Darüber hinaus zeigte die Verfolgung einzelner EEC, dass die Zellen nach Exposition gegenüber Chlorambucil kaum Bewegung zeigten, die sich jedoch nach Behandlung mit dem ROS-Scavenger wieder normalisierte.

Tatsächlich zeigen EEC, die Chlorambucil ausgesetzt waren, einen Zusammenbruch ihres mitochondrialen Membranpotentials, wie durch den Mangel an TMRM-Expression veranschaulicht wird. Die Behandlung der EEC mit dem ROS-Scavenger verhinderte jedoch diesen mitochondrialen Schaden und bewahrte ihr mitochondriales Membranpotential. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Migration chemisch gestörter endothelialer Zellen mithilfe eines modifizierten Point-in-Chamber-Assays unter Verwendung eines Scratch-Wound-Assays analysiert und wie man deren mitochondriales Membranpotential beurteilt.