Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Einfluss toxischer Chemikalien auf die Migration von Endothelzellen mit verschiedenen Migrationsassays zu untersuchen. Zunächst wird im nächsten Experiment die Verwendung eines modifizierten Vermeidungskammer-Assays zur Untersuchung der Chemokinese exponierter Endothelzellen demonstriert. Ein Wundheilungsassay wird mit einem Zelltracking kombiniert, um zusätzliche detaillierte Informationen über die Dynamik der Zellmigration zu liefern.

Im abschließenden Assay wird die Untersuchung des mitochondrialen Membranpotentials demonstriert, um die zugrundeliegenden Mechanismen der gestörten Endothelzellmigration zu identifizieren. Letztendlich können diese Migrationsassays verwendet werden, um die Auswirkungen hochtoxischer Alkylierungsmittel auf das mitochondriale Membranpotenzial und die Migration von Endothelzellen zu bewerten. Die Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Wundheilungsstörungen zu beantworten, die durch hochgiftige Chemikalien hervorgerufen werden. Ramat, voer und Stefan Miller, alle Techniker aus meinem Labor. Um die Zellkulturflaschen zu preco zu machen, fügen Sie zunächst eine ausreichende Menge frisch zubereiteter Gelatine hinzu, um gerade den Boden eines sterilen Zellkulturkolbens zu bedecken.

Stellen Sie den Kolben für mindestens 30 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie dann die restliche Gelatinelösung und übertragen Sie die aus den embryonalen Stammzellen gewonnenen frühen Endothelzellen oder EEC in genügend Medien, um die Zellen auf 80 % Co-Flüssigkeit zu kultivieren, wenn die Zellen die Subkonfluenz erreicht haben. Entfernen Sie das Medium, spülen Sie die Zellen mit PBS und inkubieren Sie sie in einem Milliliter Accutane pro 25 Quadratzentimeter für zwei bis 10 Minuten.

Wenn sich die Zellen abgelöst haben, spalten Sie sie im Verhältnis eins zu fünf in frischem Medium für die Analyse der Endothelzellmigration mit dem Boyden-Kammer-Assay. Der Filter wird vor dem Code in 500 Mikroliter frisch zubereitete 0,1%ige Gelatine eingelegt. Nach der Ernte des EEC, wie gerade gezeigt, werden die Zellen gezählt und 500 Mikroliter Zellkulturmedium in die unteren Kompartimente der Boydenkammer gegeben.

Als nächstes geben Sie genau eins mal 10 zum vierten EEC in 500 Mikroliter Medium zu jedem Filter. Nachdem Sie alle Blasen entfernt haben, stellen Sie die Boyden-Kammer für genau acht Stunden in den Inkubator. Spülen Sie die Filter am Ende der Inkubation einmal mit PBS.

Fixieren Sie dann die Zellen unter Zugabe von 0,5 Millilitern 4%para Formaldehyd nach 20 Minuten in beiden Kammern. Waschen Sie die Filter mindestens dreimal mit 0,1 molaren PBS und schneiden Sie die Membranen mit dem Skalpell heraus. Verwenden Sie ein mit DPI ergänztes Einbettmedium, um jede Membran zwischen zwei Glasabdeckscheiben zu montieren.

Achten Sie auf die Ausrichtung der Filter. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop mit 400-facher Vergrößerung, um nur die Zellen zu zählen, die in das untere Kompartiment gewandert sind. Achten Sie darauf, die Poren nicht mit den wandernden Zellen zu verwechseln.

Um den Wundheilungstest zu starten, heben Sie die Zellen manuell aus einer 80%igen konfluenten EEC-Kulturschale, indem Sie eine sterile 10-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig in einer glatten, geraden Linie von einer Seite der Schale zur anderen über die Oberfläche der Kultur schieben. Waschen Sie die Platte zweimal in 0,1 molaren PBS, um die abgelösten Zellen zu entfernen. Geben Sie dann Medium, ergänzt mit der interessierenden Verbindung, in den Kulturbehälter

Montieren Sie dann die Kulturschale unter einem Mikroskop, das in der Lage ist, lebende Zellen unter Zellkulturbedingungen zu bebildern, und nehmen Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden in 10-Minuten-Intervallen auf, wobei am Ende der Bildgebungssitzung eine Auflösung von mindestens 10 24 x 10 24 verwendet wird. Verwenden Sie das entsprechende Software-Tool, um die Spaltbreite bei null und 24 Stunden zu messen, um einen Zellverfolgungsassay durchzuführen. Importieren Sie die Bildsequenz in Image J und aktivieren Sie das Plugin MT track J image J.

Wählen Sie dann mit dem Befehl add 10 Zellen nach dem Zufallsprinzip im Sichtfeld aus, um die Bewegung der Zellen über den 24-Stunden-Bildgebungszeitraum manuell zu verfolgen. Verwenden Sie den Befehl Messen, um die Ergebnisse anzuzeigen. Verwenden Sie dann den Befehl movie, um die Spuren zu exportieren, um das mitochondriale Membranpotenzial der Zellen nach der Behandlung mit der interessierenden experimentellen Verbindung zu bewerten, ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch zwei Mikroliter frisch zubereitetes TMRM in einem Milliliter frischer Zellkultur.

Medium, dann ohne sofortiges Waschen, die Schale unter das Mikroskop zu legen und Bilder der Kontrollzellen und der experimentell behandelten Zellen zu erhalten, ohne die Erfassungsparameter zu verändern. Um die Vergleichbarkeit zwischen den verschiedenen Gruppen zu gewährleisten, erfordert die Wundheilung eine Angiogenese, die von der Migration der Endothelzellen abhängt, wie in der Grafik der Exposition des EEC gegenüber dem Alkylierungsmittel dargestellt wird. Chlorambacil führt zu einer signifikanten Verringerung der Zellmigration, gemessen mit dem Boyden-Kammer-Assay. Die Zugabe der reaktiven Sauerstoffspezies oder des ROS-Fängers Alpha-Linolensäure direkt nach einer 24-stündigen Chlorambacil-Exposition rettet den Phänotyp signifikant fast auf ein Kontrollniveau.

Der Boyden-Kammer-Assay liefert jedoch keine Informationen über das Migrationsverhalten der Zellen in diesem repräsentativen Wund- und Heilungsassay. Die nicht exponierten EEC waren in der Lage, die Lücke innerhalb von 24 Stunden zu schließen, während die mit Chlorambacil behandelten EEC dies nicht taten. Darüber hinaus zeigte die Zellverfolgung der einzelnen EEC, dass die Chlorambacil-exponierten Zellen wenig Bewegung zeigten, was nach der Behandlung mit dem ROS-Scavenger wiederhergestellt wurde.

Tatsächlich zeigen Chlorambacil-exponierte EEC einen Zusammenbruch ihres mitochondrialen Membranpotentials, was durch ihren Mangel an TMRM-Expression veranschaulicht wird. Die Behandlung der EEC mit dem ROS-Fänger verhinderte jedoch diese mitochondriale Schädigung und bewahrte ihr mitochondriales Membranpotential. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Migration chemisch gestörter Endothelzellen mit Hilfe eines modifizierten Point-in-Chamber-Assays mit einem Scratch-Wund-Assay analysiert und wie man ihr mitochondriales Membranpotenzial beurteilt.