Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die extrazellulären Fallen (NETs) von Neutrophilen, die von menschlichen Neutrophilen freigesetzt werden, auf einer Hochdurchsatzskala zu quantifizieren. Die hier vorgestellten Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entzündung und der Veränderung entzündlicher Erkrankungen zu beantworten, indem sie den Mechanismus und die Regulation der in vitro neutrophilen extrazellulären Fallenbildung bei menschlichen Neutrophilen untersuchen. Die Implikationen dieser Technik beinhalten die Identifizierung eines zentralen NET, das Signalwege vermittelt, und NET-inhibitorischer oder NET-stimulierender Moleküle.

Um Neutrophile aus dem Blut zu isolieren, aliquotieren Sie 20 Milliliter menschlichen Blutes in konische 250-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 10 Milliliter 6%iges Dextran hinzu, mischen Sie es vorsichtig und lassen Sie die Lösungen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Übertragen Sie die leukozytenreiche obere Phase vorsichtig in saubere konische 50-Milliliter-Röhrchen und verwenden Sie steriles PBS, um das Röhrchen bis zum Rand zu füllen.

Zentrifugieren Sie dann die Probe zehn Minuten lang bei 400 mal G und verwenden Sie 15 Milliliter steriles PBS, um das Pellet zu resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal. Als nächstes bereiten Sie fünfstufige Percoll-Gradienten von 85, 80, 75, 70 und 65 Prozent in konischen 215-Milliliter-Röhrchen vor und schichten Sie zwei Milliliter der Leukozytensuspension auf jeden Gradienten.

Dann zentrifugieren Sie die Gradienten bei 800 mal G für 30 Minuten mit abgebrochenem Break. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in den Schichten an den Grenzflächen 75-80 % und 70-75 % gesammelt. Verwenden Sie PBS, um die Zellen zweimal zu waschen, und verwenden Sie dann ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.

Um die Kinetik der extrazellulären DNA-Freisetzung zu messen, wird eine Suspension von Neutrophilen in Testmedium in einer Konzentration von zwei mal zehn bis sechs Zellen pro Milliliter hergestellt. Fügen Sie fünf Mikromol pro Liter SYTOX Orange hinzu, einen membranundurchlässigen DNA-Bindungsfarbstoff, und mischen Sie vorsichtig. Aliquotieren Sie humane Neutrophile in sterile 96-Well-Mikrotiterplatten mit schwarzem transparentem Boden, wobei sichergestellt wird, dass das Testmedium den gesamten Boden der Vertiefung abdeckt.

Wenn nicht, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte an der Seite. Den Teller bei 37 Grad Celsius 10 Minuten erwärmen. In der Zwischenzeit ist ein 37 Grad Celsius heißes Testmedium zu verwenden, um Lösungen herzustellen, die Stimuli in doppelter Höhe enthalten.

Als positive NET-Kontrolle bereiten Sie 100 nanomolare Phorbol-Myristat-Acetat oder PMA vor, um menschliche Neutrophile vier Stunden lang zu behandeln und so eine maximale NET-Freisetzung auszulösen. Bereiten Sie als Nächstes das Mikrotiterplatten-Fluorometer für die Messung vor. Stimulieren Sie Neutrophile, indem Sie 50 Mikroliter Stimuluslösung zu 50 Mikrolitern Neutrophilensuspensionen hinzufügen.

Geben Sie eine Endkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter Saponin in eine Vertiefung, um das maximale DNA-Freisetzungssignal zu messen. Legen Sie die Platte in das Lesegerät und messen Sie Änderungen der Fluoreszenz in Zwei-Minuten-Intervallen für vier Stunden ohne Schütteln. Um die Daten zu analysieren, berechnen Sie den normalisierten Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Zeit, indem Sie die Ausgangsfluoreszenz von den Endpunktwerten für alle Wells einschließlich Saponin subtrahieren.

Der Anstieg der Saponinfluoreszenz sollte das höchste Signal sein und wird als maximale DNA-Freisetzung bezeichnet. Mittelwerten Sie die Ergebnisse von Replikaten und stellen Sie sie als Prozentsatz der maximalen DNA-Freisetzung dar. Um die NET-Bildung mit MPO-DNA- und HNE-DNA-ELISA-Assays zu quantifizieren, fügen Sie 96-Well-ELISA-Platten mit anti-MPO- oder anti-HNE-Capture-Antikörpern hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht, um sie zu beschichten.

Verwenden Sie am nächsten Morgen 200 Mikroliter PBS pro Well, um die ELISA-Platten dreimal zu waschen. Verwenden Sie dann 200 Mikroliter 5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % Humanserumalbumin (HSA), um die Vertiefungen bei Raumtemperatur zwei Stunden lang zu verschließen. In der Zwischenzeit säen Neutrophile in 100 Mikrolitern Testmedium auf einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Well und induzieren die NET-Bildung nach Zugabe von Stimuli, indem sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Führen Sie als Nächstes einen begrenzten DNase-Verdau durch, indem Sie zwei Einheiten pro Milliliter DNAse zu den neutrophilen Überständen hinzufügen, dann gut mischen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie 15 Mikroliter 25 Millimolar EGTA hinzufügen und gut mischen. Sammeln Sie die Überstände, reinigen Sie die Mikrofugenröhrchen und schleudern Sie die Proben, um Zelltrümmer bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur fünf Minuten lang zu entfernen.

Das Sammeln von NETs ohne eingeschränkten Verdau führt zu inkonsistenten Daten. Der begrenzte Schritt des DNA-Verdaus ist entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Daher wurden die Konzentration des Enzyms DNase I und die Dauer des Aufschlusses optimiert.

Den Überstand in saubere Mikrofuge-Röhrchen umfüllen und auf Eis legen. Anschließend wird unter Verwendung eines Aliquots des zuvor hergestellten NET-Standards eine Verdünnung von ein bis zwei in PBS und EGTA hergestellt. Verwenden Sie nun PBS mit EGTA, um die von DNase I aufgeschlossenen Proben zwanzigfach zu verdünnen und auf ELISA-Platten zu aliquotieren, die mit Capture-Antikörpern beschichtet sind.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius. Bevor Sie die Platten mit PBS dreimal waschen, tragen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung einer Nachweis-Antikörperlösung wie Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-DNA-Antikörper auf und inkubieren Sie eine Stunde lang im Dunkeln. Nach vier Wäschen mit PBS 100 Mikroliter TMB-Peroxidase-Substrat pro Vertiefung hinzufügen und 30 Minuten lang inkubieren.

Die blaue Färbung zeigt die Peroxidaseaktivität und das Vorhandensein von NETs an. Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 100 Mikroliter eines molaren HCL hinzu. Die blauen Lösungen werden gelb.

Lesen Sie mit einem Mikroplatten-Photometer die Extinktion bei 450 Nanometern ab. Um die Menge der gemessenen MPO-DNA- oder HNE-DNA-Komplexe im Vergleich zum NET-Standard zu vergleichen, subtrahieren Sie die optimale Hintergrunddichte von allen Proben und plotten die Absorptionswerte der verdünnten Standardproben gegen ihren relativen NET-Gehalt. Legen Sie unter Verwendung des nicht gesättigten Bereichs dieser Standardkurve eine Trendlinie fest, indem Sie die beste exponentielle Anpassung der verwendeten Software verwenden.

Fügen Sie die gemessenen OD-Werte der Unbekannten in die Trendliniengleichung ein, die die Anzahl der NETs in der unbekannten Stichprobe in Prozent des NET-Standards angibt. Berechnen Sie abschließend die Mittelwerte der Replikate und präsentieren Sie die endgültigen Daten als Menge an MPO-DNA- oder HNE-DNA-Komplexen. Hier sind repräsentative Daten aus einem fluoreszenzbasierten DNA-Release-Assay von humanen Neutrophilen gezeigt, die nicht stimuliert oder mit PMA oder P-aeruginosa aktiviert wurden.

P-aeruginosa löst die NET-Bildung in humanen PMNs aus. Dieses Diagramm zeigt, dass die durchschnittlichen Fluoreszenzanstiege von Replikatwells berechnet, bei maximaler Fluoreszenz normalisiert und als DNA-Freisetzung ausgedrückt werden. Diese Fluoreszenzbilder zeigen Neutrophile, die unbehandelt oder mit PMA stimuliert wurden.

Hier sind Immunfluoreszenzbilder von nicht-stimulierten, PMA- und PA01-aktivierten humanen Neutrophilen aus einem MPO-DNA- und HNE-DNA-Elisa-Assay gezeigt. Die extrazelluläre DNA zeigt eine typische NET-Morphologie und kolokalisiert mit MPO und citrulliniertem Histon H4, einem Marker für die NET-Bildung. Dieses Experiment zeigt die Freisetzung von MPO-DNA und HNE-DNA in humanen Neutrophilen unter Verwendung desselben Assays.

Der NET-Standard enthält durchschnittlich 19,5 Mikrogramm pro Milliliter extrazelluläre DNA, 399 Nanogramm pro Milliliter MPO und 103,4 Nanogramm pro Milliliter HNE. Basierend auf den Molekulargewichten von MPO und HNE und der Tatsache, dass ein Mikrogramm DNA 9,91 mal 10 to die 14 Nukleotide enthält, enthält der NET-Standard 109 HNE-Moleküle und 147 MPO-Moleküle pro 1.000 Nukleotide. Schließlich zeigen zweifache serielle Verdünnungsexperimente des NET-Standards, dass die dynamischen Bereiche sowohl der MPO-DNA- als auch der HNE-DNA-ELISA-Assays zwischen 19 und 609 Nanogramm pro Milliliter DNA liegen.

Einmal gemeistert, kann die SYTOX Säure auf Orangenbasis einfach und schnell in einer Stunde zusammengebaut werden, was am nächsten Tag zu Ergebnissen führt. Die NET-Quantifizierungsassays sind ebenfalls einfach durchzuführen und liefern bei richtiger Durchführung am nächsten Tag Daten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Naturalase in menschlichen Neutrophilen mit hohem Durchsatz quantifiziert.