Name: Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Erfahren Sie hochdurchsatzfähige Methoden zur Quantifizierung von NET-Freisetzung aus humanen Neutrophilen. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung inflammatorischer Signalwege und fördern das Verständnis entzündlicher Erkrankungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Besonderer Dank geht an das Personal des Labors des University of Georgia Health Center für ihre kontinuierliche Unterstützung unserer Arbeit zur Isolierung menschlicher Neutrophilen. Diese Arbeit wurde durch den Start-up-Fonds von Dr. Rada unterstützt, der vom UGA-Büro des Vizepräsidenten für Forschung zur Verfügung gestellt wurde.

Die Institutional Review Board der University of Georgia genehmigt das menschliche Subjekt Studie peripheren Blut von gesunden Freiwilligen (UGA # 2012-10769-06) zu sammeln. 5,7,8 Freiwilligen unterzeichnet die erforderliche Einverständniserklärung vor der Blutentnahme. Die Forschung in diesem Artikel ausgeführt ist in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für die medizinische Forschung am Menschen von der Deklaration von Helsinki. 1. Isolierung von Neutrophilen aus peripherem menschlichem Blut (Figur 1) Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren. Das folgende Protokoll stellt eine Möglichkeit. Dieses Protokoll liefert eine große Anzahl von nicht-aktivierten menschlichen Neutrophilen der Lage NETs auf externe Stimulation freigesetzt wird. Verwenden Sie 40 ml Vollblut von gesunden Freiwilligen durch Venenpunktur. 7,9 <ol><li> Aliquotieren 20 ml Blut in zwei 50 ml konischen Röhrchen. 10 ml 6% Dextran. Vorsichtig mischen. </li><li> Nach 20 min Transfer der Leukozyten-rich obere Phase ohne pelle roten Blutkörperchen in saubere 50 ml konische Röhrchen nehmen, und füllen Sie es mit sterilem PBS auf. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg 10 min. Pellet in 4 ml sterilem PBS. </li><li> Bereiten Sie einen 5-stufigen Percollgradienten von 85% -80% -75% -70% -65% in zwei 15 ml konischen Röhrchen und Schicht 2 ml Leukozyten-Suspension auf der jeweils Gradienten. </li><li> Zentrifuge 800 × g für 30 min mit Bremsen aus. </li><li> Sammle alle Zellen (Neutrophile) in den Schichten an der 75% / 80% und 70% / 75% Schnittstelle. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (350 · g, 10 min, RT) und zählen Zellen eine Zählkammer. </li></ol> 2. Messung der Kinetik der extrazellulären DNA Veröffentlichung Mit Hilfe eines Mikroplatten-Fluorimeter Hinweis: Diese Methode ermöglicht die Messung von Veränderungen in der Fluoreszenz eines membran impermeable DNA-bindenden Farbstoff anzeigt DNA Freisetzung auf einer 96-Well - Mikrotiterplatten - Format (Abbildung 2). <ol><li> Eine Suspension von Neutrophilen in Testmedium (HBSS +1% (v / v) autologem Serum + 5 mM Glucose) bei einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; mol / L der Membran undurchlässig DNA-bindenden Farbstoff. Vorsichtig mischen. </li><li> Aliquotieren humanen Neutrophilen (50 &amp; mgr; l / Vertiefung) auf 96-Well-schwarz, transparenten Boden Mikrotiterplatten. Stellen Sie sicher, dass das Testmedium den gesamten Boden des Bohrlochs erstreckt. Wenn nicht, tippen Sie auf die Platte vorsichtig auf die Seite. </li><li> Warm up die Platte, die Neutrophile für 10 min bei 37 ° C. </li><li> In der Zwischenzeit werden die Lösungen von Reizen auf das Doppelte ihrer endgültigen Konzentrationen eingesetzt werden (in 37 ° C warmen Testmedium). Als ein positives Nettosteuer menschliche Neutrophilen mit 100 nM Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) für 4 Stunden nutzen , um eine maximale NET Freisetzung auslösen. 5,8 PMA - Stimulation für 4 Stunden sorgt für maximale NET Freisetzung während spontane NET Bildung niedrig 5,8 bleibt. </li><li> Bereiten Sie die Mikrotiterplatte Fluorimeter für die Messung (4 Stunden, 37 ° C, 530 nm zur Anregung und 590 nm für Emission). &lt;/ Li&gt; <li> Neutrophile stimuliert durch Zugabe von 50 &amp; mgr; l Reizlösung auf 50 ul Neutrophilen Suspensionen. Verwenden Sie 0,5 ug / ml Saponin in einem gut maximale DNA-Freigabesignal zu messen. </li><li> Legen Sie die Platte in Leser und messen Veränderungen in der Fluoreszenz für 4 Stunden bei jeder 2 min ohne Schütteln. </li><li> Für die Datenanalyse berechnen normalisierten Erhöhungen der Fluoreszenz über die Zeit. <ol><li> Subtract Fluoreszenzbasis von Endpunktwerte für alle Vertiefungen einschließlich Saponin (2A, B). Aufstieg in Saponin Fluoreszenz sollte das höchste Signal sein. Es wird als &quot;maximale DNA - Freigabe&quot; (2A) bezeichnet. </li><li> Berechnen Prozentsatz der DNA-Freisetzung in unbekannten Proben durch einen Anstieg der Fluoreszenz von unbekannten Proben durch maximale DNA-Freisetzung zu teilen. </li><li> Durchschnittliche Ergebnisse der Replikate und präsentieren sie als &quot;% der maximalen DNA - Release&quot; (Abbildung 2C). </li></ol></li></ol> 3. Die Quantifizierung von NET-Formularation von MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays Hinweis: Diese Assays modifiziert (MPO-DNA) oder etablierte (HNE-DNA) in unserem Labor NET Bildung Quantifizieren von Niveaus von MPO-DNA und HNE-DNA - Komplexe Messung 5. <ol><li> Mantel 96-well hohe Bindungskapazität ELISA-Platten über Nacht mit Fänger-Antikörper (50 &amp; mgr; l / Well): anti-MPO (1: 2000 Verdünnung) oder anti-HNE (1: 2000). </li><li> Wasch ELISA Platten dreimal mit PBS (200 ul / Vertiefung) und blockieren sie mit 5% BSA und 0,1% humanes Serumalbumin für 2 h bei RT (200 ul / Vertiefung). Wasche dreimal mit PBS. </li><li> Seed Neutrophilen auf 96-well Mikrotiterplatten in einer Dichte von 100.000 Zellen / Well in 100 &amp; mgr; l Assay-Medium und NET Bildung stimulieren. Inkubiere Zellen: 4 h 37 ° C. </li><li> Führen Sie eine begrenzte DNase-Verdau durch Zugabe von 2 U / ml DNase Neutrophilen Stände, mischen sie gut. Halten Sie diese bei RT. </li><li> Stoppen Sie die DNase nach 15 Minuten durch Zugabe von 11 &amp; mgr; l 25 mM EGTA (Endkonzentration 2,5 mM). Gut mischen. Sammeln Sie supernatants in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Proben bei 300 × g für 5 min bei RT loszuwerden Zelldebris zu werden. Bringen Sie ihre Stände in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie sie auf Eis, bis sie bereit. </li><li> Verwenden Sie einen aliquoten Teil einer zuvor hergestellten &quot;NET-Standard&quot;. Hinweis: Die NET-Standard ist eine Mischung aus DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten, die aus mindestens 5 verschiedenen, unabhängigen menschlichen Spendern. <ol><li> Um den gleichen Standard für eine lange Zeit, zu sammeln und ein großes Volumen an neutrophilen Stände von jedem einzelnen Spender aliquotieren. Sammeln zum Beispiel 2 ml DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten Neutrophilen werden in 200 Aliquots (10 ul jeweils) genug für 200 ELISA-Platten führen. Die Daten der NET - Standard kennzeichnen , sind in Abbildung 5 gefunden. </li><li> Stimulieren menschliche Neutrophilen mit 100 nM PMA für 4 Stunden und gelten DNase nach Schritten, um ihre Überstände verdauen 3,4-3,5. </li><li> Sammeln, Pool, Aliquot (10 ul) und kostenlosze (-20 ° C) neutrophil Überständen. </li><li> Zur Herstellung der &quot;NET-Standard&quot;, Tauwetter ein Aliquot / Spender aus mindestens fünf verschiedenen Spendern erhalten, mischen sie und halten sie auf dem Eis. </li><li> Entsorgen Sie aufgetauten Proben und frische für den nächsten Versuch verwenden. </li><li> Bereiten Sie eine 1: 2 serielle Verdünnung des NET-Standard in PBS + EGTA. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie DNase1-verdauten Proben (Standard und unbekannte Stände) 20-fach in PBS + EGTA und aliquotieren sie auf ELISA-Platten mit Fänger-Antikörper beschichtet. </li><li> Inkubieren ELISA-Platten über Nacht bei 4 ° C und waschen Sie sie dreimal mit PBS. </li><li> Bewerben Detektions-Antikörper-Lösung (100 &amp; mgr; l / Well): Meerrettich-Peroxidase-konjugierter anti-DNA-Antikörper (1: 500, Maus). Inkubieren für 1 Stunde in Dunkelheit. </li><li> Nach vier Waschungen mit PBS TMB Peroxidasesubstrat hinzufügen: 100 &amp; mgr; l / Vertiefung, 30 min. Blaue Färbung ist ein Indiz für die Peroxidase-Aktivität (NETs vorhanden). </li><li> Stop Reaktion durch Zugabe von 100 ul / Vertiefung 1 M HCl. Dasblau Lösungen gelb (5A) drehen. </li><li> Lesen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Photometer. </li><li> Für die Datenanalyse, die Berechnung der Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA-Komplexe im Vergleich zu dem NET-Standard. <ol><li> Ziehen Sie den Hintergrund Wert der optischen Dichte des Testmediums aus allen Proben. </li><li> Zeichnen Sie die Absorptionswerte (X-Achse) der verdünnten Standardproben gegen ihren Nettogehalt (Y-Achse) (5A). </li><li> Mit dem nicht gesättigten Bereich dieser Standardkurve eine Trendlinie etablieren (beste exponentielle Anpassung der Software verwendet wird ) (5A). Die Gleichung dieser Trendlinie bestimmt die Umwandlung von OD-Werte Mengen von NETs quantitativ. </li><li> Legen Sie die gemessenen OD - Werte der Unbekannten in den Trend-Linie Gleichung von 3.13.3, die die Menge von NETs in der unbekannten Probe als Prozentsatz des Netto-Standard (5A) geben wird. </li><li> BerechnenMittelwerte von Replikaten (dreifacher Ausführung) und die endgültigen Daten als &quot;Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA - Komplexe ( in % der Norm)&quot; (5C) präsentieren. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

NETs stellen eine faszinierende neuartige Mechanismus , durch den Erreger Neutrophilen töten. 1 Obwohl die Literatur von NETs hat den letzten zehn Jahren den Ausbau über kontinuierlich seit ihrer Entdeckung, einige wichtige Fragen zu ihrer Rolle im Zusammenhang mit der Biologie, Mechanik und Regelung unklar bleiben. Entsprechende Methodik entwickelt werden NETs zu messen, diese einzigartigen antimikrobiellen Mechanismus. Dieser Artikel beschreibt Verfahren, die verwendet werden können NETs in einem Hochdurchs...

NET-Bildung ist ein neuartiger Mechanismus, mit dem Neutrophile Krankheitserreger bekämpfen. 1 Der Kern von NETs ist die nukleare DNA. 1 Dieses DNA-Netzwerk ist mit neutrophilen Körnerproteinen und Histonen assoziiert. 1 Die Hauptform der NET-Bildung erfordert den Tod von Neutrophilen, die durch Chromatin-Dekondensation, Verschwinden von granulären und nukleären Membranen, Translokation der neutrophilen Elastase in den Zellkern, Citrullinierung von Histonen und schließlich das Verschütten von DNA-basierten NETs gekennzeichnet ist. arabische Ziffer NETs fangen und töten eine Vielzahl von Mikroben und sind ein wesentlicher Bestandteil des Repertoires an angeborenen Immunwaffen. Die unkontrollierte NET-Bildung wurde jedoch mit zahlreichen autoinflammatorischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. 3,4 Trotz ihrer zunehmenden etablierten Relevanz ist nur wenig über den Mechanismus und die Regulierung der NET-Veröffentlichung bekannt. 
Neutrophile, die durch Freisetzung von NETs sterben, unterscheiden sich von apoptotischen oder nekrotischen Neutrophilen. 3,5 kgNET-freisetzende Neutrophile weisen mehrere Merkmale auf, die für die NET-Bildung charakteristisch sind. Granulatkomponenten sind mit der DNA in NETs assoziiert. 1 Myeloperoxidase (MPO) und humane neutrophile Elastase (HNE) kommen beide in primären Granula in ruhenden Zellen vor, werden aber in den Zellkern transloziert, um an DNA in NETs zu binden. 1 MPO-DNA- und HNE-DNA-Komplexe sind spezifisch für NETs, kommen in apoptotischen oder nekrotischen Neutrophilen nicht vor. 1,3,5 Die Chromatin-Dekondensation ist ein weiteres typisches Merkmal der NETose. arabische Ziffer Die NET-Freisetzung erfordert auch die Citrullinierung von Histonen durch Peptidylaminidase 4 (PAD4). 6 Citrullinierte Histone sind Kennzeichen von Neutrophilen, die eine NET-Freisetzung durchlaufen haben. 6
Hier werden drei Methoden vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung von NETs auf einer Hochdurchsatzskala bieten. Der erste Assay wurde mit unterschiedlichen Veränderungen vor Ort eingesetzt und quantifiziert die extrazelluläre DNA-Freisetzung in einem Mikroplattenformat. Der zweite und dritte Assay liefern die Bestätigung von NETs durch Messung von NET-spezifischen MPO-DNA- und HNE-DNA-Komplexen.

<table><tbody><tr><td>Anti-humane neutrophile Elastase&nbsp; Kaninchen ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2.000x beschichtetes</td></tr><tr><td>Anti-Myeloperoxidase Ab (Kaninchen)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2.000x beschichtetes</td></tr><tr><td>DNase-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181; g/ml für den Aufschluss</td></tr><tr><td>verwendet 20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Zelltoderkennung ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Eon Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 All-in-One-Mikrotiterplatten-Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Analysewerkzeug (ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0,2 % Endkonzentration/Volumen</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>Verwenden Sie eine Endkonzentration von 10 mM.</td></tr><tr><td>1 M Glukose</td><td>Sigma</td><td></td><td>Verwenden Sie 5 mM Endkonzentration.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM final used</td></tr><tr><td>ELISA Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 50 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (pH 8,5-9,5) &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Natriumchlorid, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Spectrum</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Assay Platte schwarze Platte</td> klarer Boden <td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

hoher durchsatz messung von extrazellulärer dna freisetzung und quantitative net ausbildung in human-neutrophilen<em&gt; in vitro</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blut. Neutrophile sind die ersten, die am Ort der Infektion ankommen. Neutrophile entwickelten verschiedene antimikrobielle Mechanismen, darunter Phagozytose, Degranulation und Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile. NETs bestehen aus einem DNA-Gerüst, das mit Histonen und mehreren Granulamarkern dekoriert ist, darunter Myeloperoxidase (MPO) und humane neutrophile Elastase (HNE). Die NET-Freisetzung ist ein aktiver Prozess, der charakteristische morphologische Veränderungen von Neutrophilen beinhaltet, die zur Ausstoßung ihrer DNA in den extrazellulären Raum führen. NETs sind wichtig für die Bekämpfung von Mikroben, aber die unkontrollierte Freisetzung von NETs wurde mit mehreren Erkrankungen in Verbindung gebracht. Um mehr über die klinische Relevanz und den Mechanismus der NET-Bildung zu erfahren, besteht ein Bedarf an zuverlässigen Werkzeugen, die in der Lage sind, die NET-Quantifizierung durchzuführen. 
Hier werden drei Methoden vorgestellt, mit denen die NET-Freisetzung von humanen Neutrophilen in vitro beurteilt werden kann. Der erste ist ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung der extrazellulären DNA-Freisetzung aus menschlichen Neutrophilen unter Verwendung eines membranundurchlässigen DNA-bindenden Farbstoffs. Darüber hinaus werden zwei weitere Methoden beschrieben, die in der Lage sind, die NET-Bildung durch Messung des Gehalts an NET-spezifischen MPO-DNA- und HNE-DNA-Komplexen zu quantifizieren. Diese Mikroplatten-basierten Methoden bieten in Kombination hervorragende Werkzeuge, um den Mechanismus und die Regulation der NET-Bildung menschlicher Neutrophilen effizient zu untersuchen.

Die Zahlen in diesem Manuskript die Methode der Neutrophilen - Isolierung, experimentelle Verfahren beschreiben und präsentieren repräsentative Ergebnisse mit Erklärung der Datenanalyse. Abbildung 1 die aufeinanderfolgenden Schritte der humanen neutrophilen Vorbereitung zeigt. Dieses Protokoll stellt nur eine mögliche Art der Neutrophilen-Isolation. Es ergibt große Mengen an Neutrophilen freisetzen kann , NETs bei Stimulierung ruht. 2 zeigt , wie die Flu...

Es werden Hochdurchsatz-Assays vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung der NET-Freisetzung von menschlichen Neutrophilen bieten.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neutrophile extrazelluläre Fallen, oder NETs, die von humanen Neutrophilen freigesetzt werden, im Hochdurchsatzmaßstab zu quantifizieren. Die hier vorgestellten Methoden können helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Entzündung und der modifizierenden entzündlichen Erkrankungen zu beantworten, indem der Mechanismus und die Regulation der in-vitro-Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen in humanen Neutrophilen untersucht werden. Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Identifizierung zentraler, NET-vermittelnder Signalwege sowie von NET-hemmenden oder NET-stimulierenden Molekülen. Um Neutrophile aus Blut zu isolieren, portionieren Sie 20 Milliliter menschliches Blut in 250-Milliliter-Kegelröhren. Geben Sie 10 Milliliter 6 % Dextran hinzu, mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Lösungen 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Übertragen Sie vorsichtig die leukocytenreiche obere Phase in saubere 50-Milliliter-Kegelröhren und füllen Sie die Röhren mit steriler PBS bis zum Rand auf. Anschließend die Probe bei 400 ×g zehn Minuten lang zentrifugieren und den Pellet mit 15 Milliliter steriler PBS resuspendieren. Diesen Waschschritt noch einmal wiederholen. Danach bereiten Sie fünfstufige Percoll-Gradienten mit 85, 80, 75, 70 und 65 Prozent in 215-Milliliter-Konischgefäßen vor und geben auf jeden Gradienten zwei Milliliter der Leukozytensuspension auf.Anschließend die Gradienten 30 Minuten lang bei 800 × g zentrifugieren, wobei der Bremsvorgang deaktiviert ist. Nach der Zentrifugation die Zellen in den Schichten an den Grenzflächen von 75–80 % und 70–75 % sammeln. Die Zellen zweimal mit PBS waschen und anschließend mit einem Hämozytometer die Zellen zählen.Um die Kinetik der Freisetzung extrazellulärer DNA zu messen, stellen Sie eine Suspension von Neutrophilen in Assay-Medium mit einer Konzentration von zwei mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter her. Geben Sie fünf µmol/L SYTOX Orange zu, ein membranimpermeables, DNA-bindendes Farbstoff, und mischen Sie vorsichtig. Portionieren Sie humane Neutrophile in sterile 96-Loch-Mikroplatten mit schwarzen, transparenten Böden, wobei sichergestellt werden muss, dass das Assay-Medium den gesamten Boden jedes Wells bedeckt.Falls nicht der Fall, die Platte vorsichtig an der Seite antippen. Die Platte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erwärmen. In der Zwischenzeit 37 Grad Celsius Assay-Medium verwenden, um Lösungen mit den Stimuli in doppelter Endkonzentration herzustellen, die verwendet werden sollen.Als positiven NET-Kontrollansatz bereiten Sie 100 Nanomolar Phorbolmyristatacetat, oder PMA, vor, um humane Neutrophile vier Stunden lang zu behandeln, um eine maximale NET-Freisetzung auszulösen. Bereiten Sie anschließend den Mikroplatten-Fluorometer für die Messung vor. Stimulieren Sie die Neutrophilen, indem Sie 50 Mikroliter Stimulationslösung zu 50 Mikrolitern Neutrophilensuspension hinzufügen.Fügen Sie einer Vertiefung eine Endkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter Saponin hinzu, um das maximale Signal der DNA-Freisetzung zu messen. Stellen Sie die Platte in das Messgerät und messen Sie die Änderungen der Fluoreszenz in Zwei-Minuten-Abständen über vier Stunden hinweg, ohne zu schütteln. Zur Datenanalyse berechnen Sie die normalisierten Zunahmen der Fluoreszenz über die Zeit, indem Sie die Ausgangsfluoreszenz von den Endpunktwerten aller Vertiefungen, einschließlich Saponin, subtrahieren.Der Anstieg der Saponin-Fluoreszenz sollte das höchste Signal aufweisen und wird als maximale DNA-Freisetzung bezeichnet. Mitteln Sie die Ergebnisse der Replikate und geben Sie sie als Prozentwert der maximalen DNA-Freisetzung an. Um die NET-Bildung mittels MPO-DNA- und HNE-DNA-ELISA-Assays zu quantifizieren, geben Sie anti-MPO- oder anti-HNE-Einfangantikörper in 96-Well-ELISA-Platten mit hoher Bindungskapazität und inkubieren Sie diese über Nacht, um die Platten zu beschichten.Am nächsten Morgen waschen Sie die ELISA-Platten dreimal mit je 200 Mikrolitern PBS pro Vertiefung. Anschließend blockieren Sie die Vertiefungen zwei Stunden bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern 5 % Bovinem Serumalbumin (BSA) und 0,1 % Humanem Serumalbumin (HSA). In der Zwischenzeit säen Sie Neutrophile in 100 Mikrolitern Assay-Medium in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Vertiefung aus und induzieren nach Zugabe der Stimuli die NET-Bildung durch vierstündiges Inkubieren bei 37 Grad Celsius.Führen Sie anschließend eine begrenzte DNase-Digestion durch, indem Sie zwei Einheiten pro Milliliter DNase zu den Neutrophilensupernatanten hinzufügen, gut mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stoppen Sie dann die Reaktion durch Zugabe von 15 Mikrolitern 25 Millimolar EGTA und mischen Sie gründlich. Sammeln Sie die Supernatanten in sauberen Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben, um Zelltrümmer zu entfernen, bei 300 × g und Raumtemperatur für fünf Minuten. Die Gewinnung von NETs ohne begrenzte Verdauung führt zu inkonsistenten Daten. Der Schritt der begrenzten DNA-Verdauung ist entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Daher wurden die Konzentration des DNase-I-Enzyms und die Dauer der Verdauung optimiert.Überführen Sie das Überstand in saubere Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie diese auf Eis. Bereiten Sie anschließend unter Verwendung eines Aliquots des zuvor hergestellten NET-Standards eine ein- bis zweifache Verdünnung in PBS und EGTA vor. Verdünnen Sie nun die mit DNase I behandelten Proben mittels PBS mit EGTA um den Faktor zwanzig und pipettieren Sie sie auf mit Erfassungsantikörpern beschichtete ELISA-Platten. Die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Vor der dreimaligen Wäsche der Platten mit PBS jeweils 100 Mikroliter pro Mulde einer Detektionsantikörper-Lösung, beispielsweise einer mit Peroxidase aus Rettich conjugierten anti-DNA-Antikörper-Lösung, zugeben und eine Stunde lang im Dunkeln inkubieren. Nach vier Wäschen mit PBS jeweils 100 Mikroliter pro Mulde TMB-Peroxidase-Substrat hinzufügen und 30 Minuten lang inkubieren.Die blaue Färbung zeigt die Peroxidase-Aktivität und das Vorhandensein von NETs an. Um die Reaktion zu stoppen, geben Sie 100 Mikroliter einer einmolarigen HCl-Lösung hinzu. Die blauen Lösungen färben sich gelb.Lesen Sie mithilfe eines Mikroplatten-Photometers die Extinktion bei 450 Nanometern ab. Um die gemessene Menge an MPO-DNA- oder HNE-DNA-Komplexen im Vergleich zum NET-Standard zu bewerten, subtrahieren Sie die Hintergrund-Optische Dichte von allen Proben und tragen Sie die Extinktionswerte der verdünnten Standardproben gegen ihren relativen NET-Gehalt auf. Erstellen Sie im nicht gesättigten Bereich dieser Standardkurve eine Trendlinie, indem Sie die beste exponentielle Anpassung der verwendeten Software verwenden.Tragen Sie die gemessenen OD-Werte der Unbekannten in die Trendliniengleichung ein, um die Menge an NETs in der unbekannten Probe als Prozentwert des NET-Standards zu erhalten. Berechnen Sie abschließend die Mittelwerte der Replikate und geben Sie die endgültigen Daten als Menge an MPO-DNA- oder HNE-DNA-Komplexen an. Dargestellt ist repräsentatives Datenmaterial aus einem fluorometrischen DNA-Freisetzungs-Assay menschlicher Neutrophiler, die entweder unbehandelt blieben oder mit PMA oder P. aeruginosa aktiviert wurden.P. aeruginosa löst die NET-Bildung in humanen PMNs aus. Dieses Diagramm zeigt, dass die Mittelwerte der Zunahme der Fluoreszenz in replizierten Wells berechnet, auf maximale Fluoreszenz normalisiert und als DNA-Freisetzung ausgedrückt werden. Diese Fluoreszenzbilder stellen unbehandelte oder mit PMA stimulierte Neutrophile dar.Hier sind Immunfluoreszenzbilder von nicht stimulierten, PMA- und PA01-aktivierten humanen Neutrophilen aus einem MPO-DNA- und HNE-DNA-ELISA-Assay dargestellt. Die extrazelluläre DNA zeigt eine typische NET-Morphologie und kolokalisiert mit MPO und zitruilliertem Histon H4, einem Marker für die NET-Bildung. Dieses Experiment zeigt die Freisetzung von MPO-DNA und HNE-DNA in humanen Neutrophilen mittels desselben Assays.Der NET-Standard enthält durchschnittlich 19,5 Mikrogramm pro Milliliter extrazelluläre DNA, 399 Nanogramm pro Milliliter MPO und 103,4 Nanogramm pro Milliliter HNE. Auf der Grundlage der molaren Massen von MPO und HNE sowie der Tatsache, dass ein Mikrogramm DNA 9,91 × 10¹⁴ Nukleotide enthält, enthält der NET-Standard 109 HNE-Moleküle und 147 MPO-Moleküle pro 1.000 Nukleotide. Schließlich zeigen Verdünnungsreihen im Zweifach-Verdünnungsschema des NET-Standards, dass die dynamischen Messbereiche beider ELISA-Assays, MPO-DNA und HNE-DNA, zwischen 19 und 609 Nanogramm pro Milliliter DNA liegen.Wenn die Handhabung einmal beherrscht ist, kann der auf SYTOX Orange basierende Assay einfach und schnell innerhalb einer Stunde zusammengestellt werden, sodass am nächsten Tag Ergebnisse vorliegen. Der NET-Quantifizierungs-Assay ist ebenfalls leicht durchzuführen und liefert bei korrekter Durchführung am folgenden Tag Daten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man die Aktivität von Naturalase in menschlichen Neutrophilen auf hochdurchsatzfähige Weise quantifiziert.

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Erzeugung und Isolierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). Neutrophile werden aus peripherem Blut isoliert und mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert, um NETs zu produzieren. Während der Inkubation durchlaufen die Neutrophilen einen Prozess des Zelltods (NETose), um NETs freizusetzen, die aus dekondensiertem Chromatin bestehen, das mit granulären zytoplasmatischen Proteinen gemischt ist.

Eine In-vitro-Technik zur Erzeugung von extrazellulären Fallen für humane Neutrophile

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das...

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Erfahren Sie hochdurchsatzfähige Methoden zur Quantifizierung von NET-Freisetzung aus humanen Neutrophilen. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung inflammatorischer Signalwege und fördern das Verständnis entzündlicher Erkrankungen.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen

Weitere Videos entdecken