Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Aktivität von deubiquitinierten Enzymen in Zellen sichtbar zu machen. Dazu werden Zellen bis zur hohen Konfluenz kultiviert und anschließend geerntet, um in einem zweiten Schritt die Herstellung eines konzentrierten Lysats zu ermöglichen. Eine schonende mechanische Lyse wird verwendet, um ein Lysat herzustellen, das das metabolische Bild des zellulären Zytoplasmas erhält.

Anschließend werden die Enzyme mit aus Hämagglutinin abgeleiteten Sonden inkubiert, um die Desubiquitinierungs-Enzyme zu markieren, indem sie mit dem aktiven Cystein-Rest der aktiven Stelle reagieren. Die Ergebnisse zeigen die Aktivitätsprofile mehrerer Desubiquitinierungs-Enzyme basierend auf Western-Blot-Analyse und nachfolgender chemilumineszenter Detektion. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu etablierten Verfahren wie dem herkömmlichen Western Blot besteht darin, dass der Anwender die Aktivitäten mehrerer Enzyme gleichzeitig sichtbar machen kann. Bereiten Sie in einem Experiment das Zellkulturmedium vor, indem Sie 30 Milliliter Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium, kurz DMEM, plus 10 % fetalem Kälberserum in einen 50-Milliliter-Kegelrohr geben, um darin Zellen zu kultivieren.

Die Zellen für das Experiment werden aus der flüssigen Stickstoffspeicherung in ein kleines Becherglas mit lauwarmem Wasser überführt. Anschließend werden die Zellen in ein 50-Milliliter-Kegelrohr mit 30 Milliliter Medium transferiert. Danach wird etwas Medium in das Zellfläschchen gegeben und die resuspendierten Zellen innerhalb von fünf Sekunden nach dem Auftauen überführt.

Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 450 G, um ein Zellpellet zu erhalten. Geben Sie anschließend 20 Milliliter Medium in einen T-75-Flasche. Entfernen Sie das Medium von den Zellen durch Absaugen.

Geben Sie fünf Milliliter frisches Medium zum Zellpellet und resuspendieren Sie. Übertragen Sie die fünf Milliliter Zellsuspension in die zwanzig Milliliter Medium im T-75-Fläschchen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage, um die Zellen zu gewinnen.

Entfernen Sie das Medium durch Absaugen, wobei darauf zu achten ist, die Zellen nicht zu berühren. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern gepuffertem Phosphat-Salzlösung oder PBS. Entfernen Sie PBS durch Absaugen.

Fügen Sie anschließend drei Milliliter Trypsin-EDTA zum T-75-Fläschchen hinzu und inkubieren Sie drei Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation geben Sie sechs Milliliter frisches Medium zum Fläschchen hinzu und resuspendieren die Zellen.

Überführen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Kegelrohr und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 290 G. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 5 Milliliter PBS hinzu. Klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Rohrs, um das Pellet aufzulösen, bevor Sie erneut fünf Minuten bei 290 G zentrifugieren. Nachdem die PBS-Waschung dreimal wiederholt wurde, entfernen Sie das alte PBS und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem PBS.

Überführen Sie die Zellen anschließend in ein Eppendorf-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten bei 290 ×g. Um die Zelllyse durchzuführen, messen Sie das ungefähre Volumen des Pellets mit einer Pipette und wiegen Sie Glaskügelchen im Massen-zu-Volumen-Verhältnis von eins zu eins ab. Geben Sie Puffer für die Lyse in doppeltem Volumen im Vergleich zum Pellett hinzu.

Gegeben Sie dann die Glasperlen zum Pellet und lysieren Sie die Zellen im Eppendorf-Röhrchen durch 30-minütiges Vortexen bei maximaler Agitation bei vier Grad Celsius in einem Kühlschrank. Zentrifugieren Sie kurz bei 200 ×g für 30 Sekunden.

Um die Kügelchen abzusenken und den Überstand zu sammeln. Geben Sie zum Überstand das gleiche Volumen an Glaskügelchen wie zuvor hinzu und wirbeln Sie erneut bei maximaler Agitation 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, nachdem Sie kurz für 30 Sekunden bei 200 Gs zentrifugiert haben. Um die Glaskügelchen abzusenken, sammeln Sie den Überstand.

Zentrifugieren Sie abschließend fünf Minuten bei 5.030 ×g. Um die Kerne, Membranen und unlysierten Zellen zu entfernen, sammeln Sie den Überstand, der das Zelllysat für die Gewebe-Derivatisierung darstellt, die mittels Trichloressigsäure oder BCA-Analyse durchgeführt wird. In einer 96-Well-Platte bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Lysats mit einem photometrischen 96-Well-Platten-Reader gemäß der Anleitung des BCA-Protein-Assay-Kits.

Nach der Bestimmung der Protein-Konzentration wird ein Aliquot entsprechend 20 Mikrogramm Gesamtprotein mit deionisiertem Wasser auf 50 Mikroliter aufgefüllt. Anschließend werden zwei Mikroliter einer 1,35 Mikromolar-Lösung von HAUB-Vinyl-Handytelefon zur Lösung gegeben. Das Ergebnis ist eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm Lysat und 50 Nanomolar Sonde im Reaktionsgemisch.

Dies ist ein großer molaren Überschuss. Um die Markierung funktioneller Deubiquitin-Enzyme oder DUBs sicherzustellen, lassen Sie die Lösung eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie anschließend Laemmli-Probelösungspuffer zur Lösung hinzu.

Für ein Reaktionsvolumen von 52 Mikroliter verwenden Sie 26 Mikroliter Zweifach-Probenpuffer, 13 Mikroliter Vierfach-Probenpuffer oder 8,87 Mikroliter Sechsfach-Probenpuffer. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten bei 95 Grad Celsius. Anschließend auf Eis abkühlen.

Bevor Sie das Gel für die Westernblot-Analyse beladen, laden Sie zunächst ein 12-Loch-Tris-Glycin-Gel mit 4 bis 20 % mit 40 Mikrolitern der vorbereiteten Probe. Führen Sie das Gel bei 95 Volt durch, bis die Ionenfront den unteren Rand erreicht. Anschließend führen Sie eine Übernacht-Übertragung des Gels auf eine Polyvinylidenfluorid- oder PVDF-Membran durch.

Als Erstes übertragen, inkubieren Sie die Membran in der AMDO-Schwarzfärbung und scannen Sie die Membran, um ein Bild zu erhalten, das die Menge an Protein in jeder Spur zeigt. Danach fixieren Sie die Membran und inkubieren sie eine Stunde lang in 5 % Milch in PBS, um eine Blockierung durchzuführen. Anschließend inkubieren Sie die Membran mit dem primären Anti-HA-Antikörper in einer Konzentration von 1:10.000 in 5 % Milch in PBS, entweder über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation drei Waschschritte à fünf Minuten in PBS mit 0,1 % Tween-20-Detergens durchführen. Anschließend die Membran in einer Lösung aus Maus-Horseradish-Peroxidase in einer Verdünnung von 1:10.000 in 5 % Milch in PBS für mindestens zwei Stunden inkubieren. Drei Waschschritte wie zuvor durchführen, gefolgt von einem weiteren Fünf-Minuten-Waschschritt in PBS.

Im letzten Schritt inkubieren Sie die Membran 10 Minuten lang in einem chemilumineszenten Nachweisreagenz und detektieren Sie mithilfe eines Lumineszenzdetektors. Verwenden Sie die automatische Belichtungseinstellung am Detektor. Die Proteinbeladung wurde mit der AM Mito Black-Färbung überprüft.

Dieser Kontrollschritt stellt sicher, dass die Unterschiede in der Aktivität auf tatsächliche zelluläre Prozesse und nicht auf ungleiche Proteinbeladung zurückzuführen sind. Die hier gezeigten Bahnen zeigen, dass im ersten Experiment gleiche Proteinmengen verwendet wurden. Im zweiten Experiment wurden aufgrund der erwarteten Unterschiede in den Aktivitätsprofilen der verschiedenen Zelllinien ungleiche Proteinmengen aufgetragen.

Dies geschah, um die Detektion eines Aktivitätsprofils für die M17-Zelle sicherzustellen. Lysate wurden mit Ethylmaleat inkubiert, einem Cystin-Inhibitor, der ein vermindertes Signal im Westernblot bewirken sollte. Die Membranen wurden mit dem primären Anti-HA-Antikörper inkubiert.

Ein Maus-Horseradish-Peroxidase-Konjugat und anschließende Detektion mittels chemilumineszenzbasierter Bildgebung ermöglichen den Nachweis. Eine erfolgreiche Markierung der Dubs mit den Sonden führt zu einem charakteristischen Profil in jeder Spur der Membran. Die Intensität der Banden bei unterschiedlichen molekularen Gewichten entspricht dem Aktivitätsniveau des Dub-Enzyms.

Die Unterschiede in der Aktivität verschiedener Dub-Proteine in verschiedenen Zelllinien werden deutlich, wenn ähnliche Proteine wie UCHL1 in den HEK- und M17-Zellen verglichen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die subzelluläre Fraktionierung durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie beeinflussen pathologische Prozesse die Aktivität von Ubiquitin-Enzymen in membrangebundenen Organellen?

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aktivität vonubiquitinierten Enzymen mithilfe von aktiven Zentrum-gerichteten Sonden misst.