Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Aktivität von deubiquitinierten Enzymen in Zellen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem Zellen auf hohe Kofluenz kultiviert und geerntet werden, um in einem zweiten Schritt die Produktion eines konzentrierten Lysats zu erleichtern. Durch eine schonende mechanische Lyse wird ein Lysat hergestellt, das ein metabolisches Bild des Zytoplasmas der Zelle erhält.

Anschließend werden die Enzyme mit Hämagglutinin-abgeleiteten Sonden inkubiert, um die De-Ubiquitin-Enzyme durch Reaktion mit dem Cysteinrest des aktiven Zentrums zu markieren. Die Ergebnisse zeigen die Aktivitätsprofile vieler De-Ubiquitin-Enzyme basierend auf Western-Blotting und anschließender Chemilumineszenz-Detektion. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem regulären Western Blotting besteht darin, dass sie es dem Benutzer ermöglicht, die Aktivitäten mehrerer Enzyme zu visualisieren. In einem Experiment, Preparation cell culture media von Ali, zitierte Ali 30 Milliliter Dobe Docos, modifiziertes Eagles-Medium oder DMEM plus 10 % fötales Rinderserum in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zur Kultur.

Die Zellen für das Experiment überführen gefrorene M 17- oder he A-Zellen aus dem Flüssigstickstoffspeicher in ein kleines Becherglas mit lauwarmem Wasser. Übertragen Sie dann die Zellen in das konische 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern Medium. Geben Sie dann etwas Medium in das Zellfläschchen und übertragen Sie die resuspendierten Zellen innerhalb von fünf Sekunden nach dem Auftauen.

Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 450 g, um ein Zellpellet zu erhalten. Dann werden 20 Milliliter des Mediums in einen Kolben T 75 gegeben. Entfernen Sie das Medium durch Absaugen von den Zellen.

Geben Sie fünf Milliliter frisches Medium zum Zellpellet und reaktivieren Sie die Suspendierung. Die fünf Milliliter der Zellsuspension werden in die 20 Milliliter des Mediums in den Kolben T 75 überführt und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage, um die Zellen zu ernten.

Entfernen Sie das Medium durch Absaugen und achten Sie darauf, die Zellen nicht zu berühren. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Entfernen Sie PBS durch Absaugen.

Anschließend werden drei Milliliter Tripsin EDTA in den Kolben T 75 gegeben und drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation werden sechs Milliliter frisches Medium in den Kolben gegeben und wiederbelebt. Suspendieren Sie die Zellen.

Die Suspension wird in ein konisches 15-Liter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 290 g zentrifugiert, der Überstand entfernt und fünf Milliliter PBS hinzugefügt. Klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Rohrs, um das Pellet aufzubrechen, bevor Sie es fünf Minuten lang bei 290 g zentrifourieren. Nachdem Sie die PBS-Wäsche dreimal wiederholt haben, entfernen Sie das alte PBS und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem PBS.

Dann werden die Zellen in ein Einor-Röhrchen umgefüllt und fünf Minuten lang bei 290 GS gedreht. Um eine Zelllyse durchzuführen, messen Sie das ungefähre Volumen des Pellets mit einer Pipette und wiegen Sie die Glaskügelchen mit einem Verhältnis von Masse zu Volumen von eins zu eins ab. Geben Sie dem Pellet Lysepuffer mit dem doppelten Volumen des Pellets.

Geben Sie dann die Glasperlen zum Pellet und zur Lyse. Die Zellen werden im Einor-Röhrchen bei maximaler Bewegung 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius gepuffert, indem sie in einem kalten Raum vortexen. Bei 200 GS 30 Sekunden kurz zentrifugieren.

Um die Kügelchen abzusetzen und den Überstand zu sammeln. Geben Sie das gleiche Volumen an Glasperlen wie zuvor in den überstehenden Wirbel, wieder bei maximaler Bewegung für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, nach einer kurzen Zentrifusion bei 200 G für 30 Sekunden. Um die Glasperlen abzusetzen, den Überstand auffangen.

Zum Schluss bei 5.030 GS fünf Minuten lang zentrifugieren. Um die Zellkerne, Membranen und ununterbrochenen Zellen zu entfernen, sammeln Sie den Überstand, d. h. das Zelllysat für die Gewebeableitung, die durch Cinco-Nimsäure- oder BCA-Analyse durchgeführt wird. In einer 96-Well-Platte zur Bestimmung der Proteinkonzentration des Lysats unter Verwendung eines cholemetrischen 96-Well-Plattenlesegeräts, wie im BCA-Protein-Assay-Kit-Protokoll spezifiziert.

Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wird ein Aliquot, das 20 Mikrogramm Gesamtprotein entspricht, mit deionisiertem Wasser auf 50 Mikroliter gebracht. Geben Sie dann zwei Mikroliter 1,35 Mikromolar HAUB Vinyl-Handy in die Lösung. Das Ergebnis sind 20 Mikrogramm Lysat auf 50 Nanomolare Sonde in der endgültigen Reaktionsmischung.

Dies ist ein großer molaren Überschuss. Um die Markierung von funktionellen De-Ubiquitin-Enzymen oder -Dubs sicherzustellen, lassen Sie die Lösung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie anschließend Laly-Probenpuffer in die Lösung.

Für ein Reaktionsvolumen von 52 Mikrolitern werden 26 Mikroliter mit zwei x Probenpuffer, 13 Mikroliter mit vier x Probenpuffer oder 8,87 Mikroliter mit sechs x Probenpuffer verwendet. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Auf Eis abkühlen lassen.

Vor dem Laden des Gels zur Durchführung des Western Blots wird zunächst ein 12, gut vier bis 20%iges Tris-Glycin-Gel mit 40 Mikrolitern der vorbereiteten Probe geladen. Lassen Sie das Gel bei 95 Volt laufen, bis die Ionenfront den Boden erreicht. Führen Sie dann einen Transfer des Gels über Nacht auf eine DI-Fluorid- oder PVDF-Membran aus Polyrebe durch.

Transfer Inkubieren Sie zunächst die Membran in der schwarzen AMDO-Färbung und scannen Sie die Membran, um ein Bild zu erhalten, das die Proteinmenge in jeder Spur zeigt. Halten Sie dann die Membran fest und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in 5%iger Milch in PBS, um sie zu blockieren. Als nächstes inkubieren Sie die Membran im primären Anti-HA-Antikörper in einer Konzentration von eins bis 10.000 in 5%iger Milch in PBS, entweder über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden lang bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation drei Wäschen für jeweils fünf Minuten in PBS mit 0,1 % Tween 20 Waschmittel durchführen. Dann inkubieren Sie die Membran mindestens zwei Stunden lang in Meerrettichperoxidase der Maus in einer Konzentration von eins bis 10.000 in 5%iger Milch in PBS. Führen Sie wie zuvor drei Wäschen durch, gefolgt von einer Wäsche für fünf Minuten in PBS.

Inkubieren Sie die Membran schließlich 10 Minuten lang in einem Chemilumineszenz-Detektionsreagenz und detektieren Sie mit einem Lumineszenzdetektor. Verwenden Sie die automatische Belichtungseinstellung am Detektor. Die Proteinbeladung wurde mit dem AM mito black stain überprüft.

Dieser Kontrollschritt stellt sicher, dass die Aktivitätsunterschiede auf tatsächliche zelluläre Prozesse und nicht auf eine ungleiche Proteinbeladung zurückzuführen sind. Die hier gezeigten Spuren zeigen, dass im ersten Experiment gleiche Proteinmengen verwendet wurden. Im zweiten Experiment wurden aufgrund der erwarteten Unterschiede in den Aktivitätsprofilen der verschiedenen Zelllinien ungleiche Proteinmengen geladen.

Dies geschah, um die Detektion eines Aktivitätsprofils für die M 17-Zelle zu gewährleisten. Lysate inkubiert mit Ethyl Maide, einem Cystinhemmer, der zu einem verminderten Signal auf dem Western Blot führen sollte. Die Membranen wurden in Anti-HA-Primärantikörpern inkubiert.

Eine Maus-Meerrettich-Peroxidase und dann mit Chemilumineszenz-Bildgebung nachgewiesen. Das erfolgreiche Taggen der Dubs mit den Sonden führt zu einem Profil in jeder Spur der Membran. Die Intensität der Banden bei unterschiedlichen Molekulargewichten entspricht dem Aktivitätsniveau des Dub-Enzyms.

Die Unterschiede in den Aktivitätsniveaus verschiedener Dubs zwischen den Zelllinien werden deutlich, wenn man ähnliche Proteine wie U CHL one in den he a und M 17 Zellen vergleicht. Nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie die subzelluläre Fraktionierung können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten wie: Wie beeinflussen pathologische Prozesse die Aktivität des Ubiquitin-Enzyms in membrangebundenen Organellen?

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aktivität von deubiquitinierten Enzymen mit Sonden an der aktiven Stelle messen kann.