Name: Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell Streptococcus iniae Infektions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Mikroinjektion von Streptococcus iniae in den Otolithenbeutel von Zebrafisch-Larven zur nicht-invasiven Bildgebung der angeborenen Immunantwort. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Leukozyten-Pathogen-Interaktionen in vivo.

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Die Autoren bedanken sich bei Labormitglieder für Zebrafisch Pflege und Wartung zu danken. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 EA Harvie und NIH R01GM074827 Anna Huttenlocher unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Infektion Verfahren verwendet hier ist nützlich für die Untersuchung der Immunantwort des Wirts zu einer anfänglich lokalisierten Infektion bei 2-3 dpf Embryonen und Larven. Der Fokus eines Entzündungsreiz, wie Infektion, in einem geschlossenen Hohlraum, wie der Ohrbläschen ermöglicht die Untersuchung von Neutrophilen und Makrophagen-Chemotaxis und Phagozytose. Eine Einschränkung des Injizierens von Bakterien in das Ohrbläschen ist, daß die Fähigkeit von Neutrophilen, effizient phagozytieren Bakterien in mit Flüssig...

Streptococcus iniae ist ein großer Wasserkrankheitserreger, der in der Lage ist, die systemische Krankheiten bei den Fischen und Menschen 1 ist. Während S. iniae ist für große Verluste in der Aquakultur-Industrie zuständig ist, ist es auch ein Potenzial Zoonoseerreger, der Lage verursacht Erkrankung bei immun menschlichen Wirten mit klinischen Erkrankungen ähnlich denen von anderen Streptokokken menschlichen Erregern verwendet wird. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit menschlicher Krankheitserreger, ist es wichtig, S. studieren iniae Pathogenese der Erkrankung in Zusammenhang mit einem natürlichen Wirt. Ein erwachsenen Zebrafisch-Modell von S. iniae Infektion ergab, robust Infiltration von Leukozyten an das Host-lokalisierten Ort der Infektion sowie eine schnelle Zeit bis zum Tod Gastgeber, eine Zeit zu kurz, um das adaptive Immunsystem 7 einzubeziehen. Um zu gewinnen eine eingehende in der angeborenen Immunantwort auf S. betrachten iniae Infektion in vivo ist es erforderlich, ein Modell zu zugänglicher n verwendenon-invasive Echtzeit-Bildgebung. Die Larven Zebrafisch hat eine Reihe von Vorteilen, die es immer attraktiver Wirbeltiermodell zur Untersuchung Wirt-Pathogen-Interaktionen zu machen. Zebrafische sind relativ preiswert und einfach zu bedienen und zu halten im Vergleich zu Säugermodellen. Adaptive Immunität ist nicht funktionell reifen, bis 4-6 Wochen nach der Befruchtung, aber Larven haben eine hoch konservierte Wirbel angeborenen Immunsystems mit Ergänzung, Toll-like Rezeptoren, Zytokine und Neutrophilen und Makrophagen, die mit antimikrobiellen Funktionen, einschließlich Phagozytose und Respiratory Burst 2-6, 8-11. Darüber hinaus ist die genetische Lenkbarkeit und der optischen Transparenz der embryonalen und larvalen Stadien der Entwicklung ermöglichen die Erzeugung von stabilen transgenen Linien mit fluoreszenzmarkierten Immunzellen macht es möglich, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen in Echtzeit in vivo zu untersuchen. Die Erzeugung dieser transgenen Linien mit einem Photokonvertierbare Protein wie Dendra2 ermöglicht die Verfolgung einzelner Wirtszelle Herkunft und Schicksal im Laufe der Infektion 12. Bei der Entwicklung eines Zebrafisch-Larven-Infektionsmodell, wird der gewählte Standort der Mikroinjektion Feststellung der Infektion zunächst lokal oder systemisch. Der systemische Blutinfektionen in die Schwanzvene oder Duct von Cuvier werden am häufigsten verwendet, um mikrobielle Krankheitserreger im Zebrafisch zu untersuchen und sind nützlich für das Studium Interaktionen zwischen Wirt und mikrobiellen Zellen, Zytokin-Antworten, und die Unterschiede in der Virulenz zwischen Erregerstämme. Für langsamere Wachstum von Mikroorganismen kann eine frühe Einspritzung in den Dottersack von Embryos im 16-1,000 Zellstadium für die Mikroinjektion eines langsam wachsenden Mikroorganismus gefunden, zwischen werden verwendet werden, um eine systemische Infektion 13,14 zu erzeugen, mit der optimalen Entwicklungsstadium die 16 bis 128 Zellstadium 15. Allerdings Dottersack Injektionen von vielen Mikroben in späteren Phasen der Entwicklung sind in der Regel tödlich Host zu t zu seiner aufgrund Gastgeber an den nährstoffreichen Umgebung für Mikroben und der Mangel an infiltrierenden Leukozyten 16-18. Eine lokalisierte Infektion führt in der Regel gerichtete Wanderung von Leukozyten in Richtung der Infektionsstelle, die leicht mit nicht-invasive Abbildungs ​​quantifiziert werden kann. Diese Art der Infektion kann für die Präparation der Mechanismen, die Leukozyten-Migration sowie Untersuchung verschiedener Zugvögel und phagozytischen Funktionen verschiedener Leukozytenpopulationen vermitteln können. Lokalisierte Infektionen sind auch nützlich bei der Prüfung Unterschiede in der Virulenz zwischen Bakterienstämme sowie Studium Mikrobe Invasionsmechanismen seit physischen Host Barrieren müssen für eine lokalisierte Infektion gekreuzt systemischen zu werden werden. Zebrafische sind typischerweise bei Temperaturen von 25-31 ° C 19 angehoben wird, sie können aber auch bei Temperaturen von bis zu 34-35 ° C für die Untersuchung der Invasivität von bestimmten Pathogenen beim Menschen strengen Temperaturanforderungen aufrechterhalten werdenVirulenz 20, 21. Viele verschiedene Standorte wurden verwendet, um eine anfänglich lokalisierten bakteriellen Infektionen, einschließlich der Hinterhirn Ventrikel 22, dorsalen Schwanzmuskel 18, Perikardhöhle 23 und Ohrbläschen (Ohr) 5, 16, 24 zu erzeugen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Injektion von Bakterien in den Ruten Muskel Gewebeschädigung und Entzündung unabhängig von den Bakterien, die bei der Untersuchung Leukozytenreaktion 13 Ergebnisse verzerren können verursachen gefunden. Obwohl weniger Schaden mit Injektion in die Hinterhirn verbunden, und obwohl es zunächst frei von Leukozyten in jungen Embryonen ist das Hinterhirn Ventrikel stetig gewinnt mehr Immunzellen im Laufe der Zeit als Mikroglia Wohnsitz zu nehmen. Das Hinterhirn Ventrikel ist auch ein schwieriger Ort zum Bild. Der Ohrbläschen ist ein geschlossener Hohlraum, ohne direkten Zugang zu dem Gefäßsystem 25, 26. Es ist in der Regel frei von leukocytes, aber Leukozyten an das Ohrbläschen als Antwort auf Entzündungsreize wie Infektion rekrutiert werden. Es ist auch ein bevorzugter Ort der Mikroinjektion von Bakterien in Zebrabärbling Alter von 2-3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) wegen der Einfachheit der Bildverarbeitung und die Visualisierung der Injektion. Daher haben wir uns für das Ohrbläschen wie unsere Website von lokalisierten bakteriellen Infektion.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Falcon Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &frac12; Zoll Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Präpariergerät</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Feinpinzette</td><td>Fein Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gelkamm</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4,2 mm breit, 1,5 mm dick</td></tr><tr><td>Glasbodenschalen</td><td></td><td></td><td>Sonderanfertigung, indem ein 16 - 18 mm Loch in die Mitte des Bodens einer 35 mm Gewebekulturschale gebohrt und ein 22 mm rundes #1 Deckglas in das Loch gelegt und mit einer dünnen Schicht Norland Optical Adhesive 68 verschlossen wird, das durch UV-Licht ausgehärtet wurde.</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit hohem Schmelzgehalt</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>mit FV-1000-System</td><td></td></tr><tr><td>Low-Melt-Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Magnetstativ</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionssystem</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader-Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop-Spektrophotmeter</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Protease Pepton</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Zellkulturschale</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige Kapillarinjektionsnadeln aus Glas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fluka Biochemika</td><td>Artikel-Nr.: 92144</td><td></td></tr></tbody></table>

nicht-invasive bildgebung von der angeborenen immunantwort in einem zebrafisch-larven modell<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infektions

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Die aquatische Erreger Streptococcus iniae, ist seit mehr als 100 Millionen Dollar in jährlichen Verluste für die Aquakultur zuständig und in der Lage ist, die systemische Erkrankung in beiden Fische und Menschen. Ein besseres Verständnis der S. iniae Pathogenese der Erkrankung erfordert eine entsprechende Modellsystem. Die genetische Lenkbarkeit und die optische Transparenz der frühen Entwicklungsstadien von Zebrabärbling ermöglichen die Erzeugung und nicht-invasive Abbildung von transgenen Linien mit fluoreszenzmarkierten Immunzellen. Das adaptive Immunsystem nicht voll funktionsfähig, bis mehrere Wochen nach der Befruchtung, aber Zebrafisch-Larven haben eine konservierte Wirbel angeborenen Immunsystems mit beiden Neutrophilen und Makrophagen. Somit ist die Erzeugung eines Larveninfektionsmodell ermöglicht die Untersuchung des spezifischen Beitrags der angeborenen Immunität bei der Kontrolle S. iniae Infektion. Die Website der Mikroinjektion wird geprüft, ob eine Infektionsystemische oder zunächst lokalisiert. Hier präsentieren wir unsere Protokolle für Ohrbläschen Injektion von Zebrafisch im Alter von 2-3 Tagen nach der Befruchtung sowie unsere Methoden zur Fluoreszenz konfokale Abbildung der Infektion. Eine lokalisierte Infektion Website ermöglicht die Beobachtung der ersten Mikroben-Invasion, Rekrutierung von Wirtszellen und die Verbreitung der Infektion. Unsere Ergebnisse unter Verwendung des Zebrafisch-Larven-Modell von S. iniae Infektion zeigen, daß Zebrafisch kann verwendet werden, um die unterschiedlichen Beiträge von Aufnahme Neutrophilen und Makrophagen in lokalisierten bakteriellen Infektionen zu untersuchen. Darüber hinaus wird beschrieben, wie Photomarkierung von Immunzellen können einzelne Wirtszelle Schicksal im Verlauf der Infektion zu verfolgen.

Mikroinjektion von S. iniae in das Ohrbläschen (Abbildung 1 und 2) zu einer Reaktion zunächst lokalisiert Host. Wenn korrekt injiziert, sollten die Bakterien nur in der Ohrbläschen und nicht in das umliegende Gewebe oder Blut zu erkennen. Dies kann bei der Mikroinjektion mit Phenolrot-Farbstoff (1A) sichtbar gemacht werden. Alternativ, wenn markierten Bakterien injiziert werden, einen schnellen Scan des infizierten Larven sofort nach der Injektion kann bestätig...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung und Bildgebung einer lokalisierten bakteriellen Infektion im otischen Vesikel des Zebrafisches.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zebrafischlarven mit einem bakteriellen Pathogen, Streptococcus IEA, zu mikroinjizieren, um eine nichtinvasive Live-Bildgebung der Wirtsimmunantwort zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mikroinjektionsnadel mit einer bakteriellen Suspension beladen und anesthetisierte Zebrafischlarven auf der Agarose-Injektionsform ausgerichtet werden. Anschließend wird die bakterielle Suspension in das Oticum der Larven mikroinjiziert.Anschließend werden die injizierten Larven in Schmelzagarose eingebettet. Schließlich werden die Wirtsimunzellen photochemisch markiert, um eine einfache Verfolgung zu ermöglichen, und die Infektion wird mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. Letztendlich dient die Mikroinjektion von Streptococcus in die Ohrblase sowie die anschließende photochemische Markierung und konfokale Mikroskopie der Untersuchung der Immunantwort von Zebrafischlarven.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Coddle-Venen-Injektion besteht darin, dass die Otozysten-Injektion eine lokalisierte bakterielle Infektion erzeugt, die eine nichtinvasive Bildgebung der Wirt-Pathogen-Interaktionen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Transparente Zebrafischembryonen haben nützliches Modell Gastgeber zu visualisieren und funktionell Studie Wechselwirkungen zwischen Zellen des angeborenen Immunsystems und intrazelluläre bakterielle Erreger wie...

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der...

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Quelle: Zhang, X., et al. Ein Zebrafisch-Embryomodell für die In-vivo-Visualisierung und Intravitalanalyse von Biomaterial-assoziierten Staphylococcus aureus-Infektionen . J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung von Zebrafischembryonen, die mit Staphylococcus aureus injiziert wurden, was eine Quantifizierung des Infektionsverlaufs und der bakteriellen Verteilung ermöglicht, um den Einfluss von Biomaterial-Mikrosphären auf Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo zu bewerten.

 Fluoreszenzbildgebung von Biomaterial-assoziierten bakteriellen Infektionen in Zebrafischembryonen

Quelle: Zhang, X. et. al., Ein Zebrafisch-Embryomodell für die In-vivo-Visualisierung und Intravitalanalyse von Biomaterial-assoziierten Staphylococcus aureus-Infektionen . J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt ein Modell eines Zebrafischembryos zur Untersuchung von Infektionen, die mit implantiertem Biomaterial in Verbindung stehen. Die Injektion von Staphylococcus aureus mit Polystyrol-Mikrosphären verbessert das Überleben der Bakterien und bestätigt die infektionsfördernde Rolle der...

In vivo Analyse implantatassoziierter bakterieller Infektionen anhand von Zebrafischembryonen

Dieses Video zeigt die Verfolgung der Leukozytenrekrutierung mit transgenen Zebrafischlarven, die photokonvertierbares grün fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Vorinjektion von rot fluoreszierenden Farbstoff-markierten Bakterien in das otische Vesikel und die Induktion der Photokonversion ermöglicht die Beobachtung der Migration, Phagozytose und Ausbreitung von Leukozyten im Körper und liefert wertvolle Einblicke in die Dynamik der Immunantwort.

Photokonversionsbasiertes Leukozyten-Tracking in bakteriell infizierten transgenen Zebrafischen

Das Video demonstriert eine Technik zum Verletzen und Einfangen von Zebrafischen zur Beobachtung von fluoreszenzmarkierten Pilzerregerinfektionen in Zebrafischlarven. Die Erstinfektion zieht Makrophagen an, und wenn die Infektion anhält, schreitet die Rekrutierung von Neutrophilen an der Injektionsstelle fort.

Eine zWEDGI-Technik zur Visualisierung von mit Pilzerregern infizierten Zebrafischlarven

Die angeborene Immunantwort gegen Krankheitserreger schützt Organismen Infektion. Eine kritische Komponente des angeborenen Immunantwort, die Phagozyten Atmungsstoß erzeugt reaktive Sauerstoffspezies, die eindringende Mikroorganismen zu töten. Wir beschreiben einen Assay, der Respiratory Burst reaktiven erzeugt, wenn der angeborenen Immunantwort chemisch induzierte Sauerstoffspezies quantifiziert.

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

Die Untersuchung der frühesten Ereignisse präneoplastischen Zellprogression und angeborenen Immunzellinteraktion ist von zentraler Bedeutung, zu verstehen und Behandlung von Krebs. Hier beschreiben wir eine Methode, um bedingt induzieren epithelialen Zelltransformationen und der anschließenden Live-Imaging von angeborenen Immunzellinteraktion mit HRAS G12V exprimierenden Hautzellen im Zebrafisch-Larven.

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Optisch transparente Zebrafischembryonen werden häufig verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen pathogenen Mikroorganismen und den angeborenen Immunzellen in Echtzeit zu untersuchen und zu visualisieren. Die Mikroinjektion von Mycobacterium abscessus, kombiniert mit Fluoreszenzbildgebung, wird verwendet, um wesentliche pathogene Merkmale wie die Nabelschnurbildung in Zebrafischembryonen zu untersuchen.

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Systemische und lokalisierte Zebrafisch-Infektionsmodelle für humane Influenza-A-Viren werden demonstriert. Unter Verwendung eines systemischen Infektionsmodells kann der Zebrafisch zum Screening von antiviralen Medikamenten verwendet werden. Unter Verwendung eines lokalisierten Infektionsmodells kann der Zebrafisch zur Charakterisierung der Immunzellreaktionen des Wirts verwendet werden.

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Die vorliegende Studie beschreibt ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierten Infektionen im Laufe der Zeit anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Modell ist ein viel versprechende Ergänzung Säugetier-Tiermodellen wie Maus-Modellen für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.

Zebrafish Embryos Modell für bei Vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierte Staphylococcus Aureus Infektion

Erfahren Sie die Mikroinjektion von Streptococcus iniae in den Otolithenbeutel von Zebrafisch-Larven zur nicht-invasiven Bildgebung der angeborenen Immunantwort. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Leukozyten-Pathogen-Interaktionen in vivo.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell

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