Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zebrafischlarven mit einem bakteriellen Pathogen, Streptococcus IEA, zu mikroinjizieren, um eine nichtinvasive Live-Bildgebung der Wirtsimmunantwort zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mikroinjektionsnadel mit einer bakteriellen Suspension beladen und anesthetisierte Zebrafischlarven auf der Agarose-Injektionsform ausgerichtet werden. Anschließend wird die bakterielle Suspension in das Oticum der Larven mikroinjiziert.

Anschließend werden die injizierten Larven in Schmelzagarose eingebettet. Schließlich werden die Wirtsimunzellen photochemisch markiert, um eine einfache Verfolgung zu ermöglichen, und die Infektion wird mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. Letztendlich dient die Mikroinjektion von Streptococcus in die Ohrblase sowie die anschließende photochemische Markierung und konfokale Mikroskopie der Untersuchung der Immunantwort von Zebrafischlarven.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Coddle-Venen-Injektion besteht darin, dass die Otozysten-Injektion eine lokalisierte bakterielle Infektion erzeugt, die eine nichtinvasive Bildgebung der Wirt-Pathogen-Interaktionen im transparenten Zebrafischlarven ermöglicht. Um zu beginnen, bereiten Sie eine 1,5 bis 2 %ige Hochschmelz-Agar-Lösung in E3-Medium vor und erhitzen sie in der Mikrowelle, bis die Lösung klar ist. Gießen Sie nach dem Abkühlen etwas von dem Agar in eine Petrischale, fügen Sie gerade so viel hinzu, dass der Boden der Schale bedeckt ist, und schwenken Sie die Schale.

Nachdem das Agarose-Gerinnungsmittel erstarrt ist, platzieren Sie einen gespülten und getrockneten Gelauftragskamm so darauf, dass das glatte Ende gerade auf dem oberen Rand der Petrischale aufliegt und das gezahnte Ende die Agarose berührt. Achten Sie darauf, dass der Kamm so horizontal wie möglich steht und einen Winkel von 30 Grad gegenüber der unteren Agaroseschicht bildet. Gießen Sie eine zusätzliche kleine Menge flüssiger Agarose an die Grenzfläche zwischen dem Kamm und der unteren Agaroseschicht, sodass die frische Agaroseschicht die Vertiefungen des Kamms bedeckt.

Lassen Sie es vollständig abkühlen, bevor Sie den Kamm entfernen. Entfernen Sie anschließend mit einer Pipettenspitze alle überstehenden Teile von Aros aus den Vertiefungen. Gießen Sie E drei mittlere Portionen auf die Spritzgussform und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Nach der Vorbereitung des SNEA-Inokulums und der Zebrafischlarven für die Injektion gemäß dem Textprotokoll schalten Sie den Mikroinjektor ein und stellen den Zeitbereich auf Millisekunden ein. Öffnen Sie das Ventil am Kohlendioxid-Tank, um Gas in die Leitung zu lassen. Der Druck des Mikroinjektors sollte etwa 20 PSI betragen. Wirbeln Sie die vorbereitete SNEA-Kultur in Phenolrot und PBS und verwenden Sie eine Mikrolader-Spitze, um zwei bis drei Mikroliter der Kultur in eine gezogene Kapillar-Injektionsnadel aufzunehmen. Befestigen Sie die beladene Nadel an einem Mikromanipulator, der mit einem magnetischen Stativ verbunden ist, und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop, sodass die Nadel in einem Winkel von etwa 45 bis 65 Grad gegenüber der Mikroskoptischbasis steht.

Zerbrechen Sie zunächst die Spitze der Nadel mit einer feinen Pinzette ab, drücken Sie das Fußpedal des Mikroinjektors, um einen Tropfen des Inokulums auf die Nadelspitze abzugeben. Verwenden Sie die Skalenskala im Okular des Mikroskops, um den Durchmesser des Tropfens zu messen. Der Durchmesser des Tropfens sollte etwa 0,10 Millimeter betragen, was einem Volumen von ungefähr einem Nanoliter entspricht.

Um die Tropfengröße einzustellen, passen Sie die Dauer-Einstellung am Mikroinjektor an oder kürzen Sie mithilfe einer feinen Pinzette die Nadelspitze weiter ab. Die Injektionszeit sollte zwischen 20 und 35 Millisekunden liegen, um übermäßige Gewebeschädigungen zu vermeiden. Übertragen Sie anschließend mit einer Plastik-Transferpipette jeweils einen Fisch pro Vertiefung in die 12 Vertiefungen der Injektionsform.

Dann die Larven mit einem Glasstab, Haarschleife oder Plastikspitze vorsichtig so positionieren, dass die Köpfe in Richtung Rückseite des Mikroskops zeigen und die Dottersäcke an der linken Seite der Vertiefung liegen. Die linke Ohrregion der Larven nach oben in Richtung Decke ausrichten. Wenn die Larven bereit für die Injektion sind, die Knöpfe am Mikromanipulator verwenden, um die beladene Nadel mit dem Ohrbläschen auszurichten, sodass beide im gleichen Sichtfeld liegen.

Stechen Sie mit der Nadelspitze durch die äußere epitheliale Schicht des Ohrbläschen, sodass sich die Spitze gerade innerhalb des Bläschen befindet. Drücken Sie nun bei ausreichend niedrigem Druck, um eine Ruptur des Hohlraums zu vermeiden, das Fußpedal, um ein Nanoliter der gewünschten Dosis von SNEA zu injizieren. Wenn die Injektion erfolgreich war, sollte sich das Ohrbläschen, jedoch nicht das umgebende Gewebe, mit einem Phenolrot-Inokulum füllen.

Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus den Larven heraus und bewegen Sie unter einer fünffachen Vergrößerung die Injektionsplatte manuell, sodass die Larve im Sichtfeld ist. Falls fluoreszenzmarkierte Bakterien unter einem Fluoreszenzmikroskop injiziert werden, untersuchen Sie die injizierten Larven visuell und behalten nur jene, bei denen die Bakterien ausschließlich im Innenohrbläschen abgelagert wurden, um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen im Verlauf des Experiments konstant bleibt. Nach der Injektion jedes 48. Embryos geben Sie einen Tropfen der Bakteriensuspension in ein 1,7-Milliliter-Zentrifgenröhrchen, das 100 Mikroliter sterile PBS enthält.

Anschießend die 100 Mikroliter auf THY-Platten mit P-Auger aufplattieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren. Um die KBE in dem Injektionsvolumen zu bestimmen, nachdem eine gesamte Gruppe von 12 Larven auf der Injektionsrampe injiziert wurde, die Larven vorsichtig mit einer Plastik-Transferpipette aus den Vertiefungen entfernen und in eine neue Petrischale überführen. Die Trica-Lösung entfernen und durch etwa zwei Milliliter frisches E3-Medium ersetzen, um den Larven eine Erholungsphase zu ermöglichen.

Die Embryonen gemäß dem Textprotokoll inkubieren. Nach der Vorbereitung von Aros mit Trica gemäß dem Textprotokoll auf der Bühne des Stereomikroskops vier bis fünf anästhesierte Larven mit einer Transferpipette in eine Glasboden-Dish geben. Die Trica- und Aro-Lösung aus dem 55 Grad Celsius Wasserbad entfernen und ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen.

Entfernen Sie in der Zwischenzeit so viel Flüssigkeit wie möglich von den betäubten Larven. Gießen Sie anschließend das abgekühlte Agar in die Petrischale, bis etwa die Hälfte der Oberfläche bedeckt ist. Schwenken Sie dann die Schale, um das Agar gleichmäßig zu verteilen.

Heben Sie die Larven auf, die an die Seiten der Petrischale geschwommen sind, und pipettieren Sie sie zurück in die Mitte. Verwenden Sie dann unter dem Stereomikroskop eine lange Pipettenspitze, um die Larven vorsichtig in die gewünschte Position für die Bildaufnahme zu bringen. Positionieren Sie die Larven so, dass die rechte Ohrbläschenanlage nach oben zeigt und die linke Ohrbläschenanlage flach am Boden der Schale aufliegt.

Lassen Sie die Aros etwa 10 Minuten abkühlen, bevor Sie die Probe bewegen. Geben Sie dann vorsichtig etwas Trica- und E-drei-Lösung auf die Aros-Schicht, um sie feucht zu halten. Zur Visualisierung der Proben verwenden Sie eine Zack-Scan-Aufnahme mit den 488 Nanometer und 543 Nanometer Lasern.

Verwenden Sie die kontinuierliche Zeilenscannung, um die Laserleistung und den Detektorverstärkungsfaktor einzustellen. Überprüfen Sie, dass keine zufällige photoinduzierte Umwandlung der roten Fluoreszenz im Fenster zur Bildaufnahmeerkontrolle auftritt. Wählen Sie unter Stimuluseinstellung das Scanner-Werkzeug aus, wählen Sie „main“, wählen Sie den 405 Nanometer Laser aus und stellen Sie ihn auf 70 % Leistung.

Danach mithilfe der Kreis-Option den interessierenden Bereich im Odik-Vesikel definieren; unter der Einstellung „Stimulus starten“ Aktivierung in Serie auswählen, mit einer Präaktivierung von einem Bild und einer Aktivierungszeit von 60.000 Millisekunden im Fenster „Aufnahme-Einstellung“. Unter der Überschrift „Zeitscan“ zwei Intervalle zu je einer Minute wählen, eines für die Zeit vor und eines für die Zeit nach der Photoumwandlung. Die zeitraffende Serie starten, um die Photoumwandlung des definierten interessierenden Bereichs einzuleiten.

Scannen Sie die Probe abschließend mit einem Zack und den Lasern mit 488 und 543 Nanometer. Um die photochemisch umgewandelte rote Fluoreszenz sowie verbleibende grüne Fluoreszenz sichtbar zu machen, führt die Mikroinjektion von SNEA in Phenolrot in die otische Vesikel zu einer anfänglich lokal begrenzten Wirtsreaktion, die bei korrekter Injektion ausschließlich in der otischen Vesikel sichtbar sein sollte, nicht jedoch im umgebenden Gewebe oder im Blut. Alternativ kann bei Injektion markierter Bakterien eine schnelle Überprüfung der infizierten Larven unmittelbar nach der Injektion bestätigen, dass sich die Bakterien nur in der otischen Vesikel und nicht im umgebenden Gewebe befinden.

Mikroinjektionsstellen einer anfänglich lokalisierten Infektion eignen sich gut zur Untersuchung der Leukozyten-Chemotaxis, wie hier gezeigt. Die Rekrutierung von Leukozyten kann entweder durch Sudan- oder Schwarzfärbung der Neutrophilengranula oder durch Formaldehyd-Fixierung fluoreszenzmarkierter transgener Linien unter Verwendung transgener Zebrafische-Linien, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, quantifiziert werden. Dendra zwei, spezifisch in Makrophagen oder Neutrophilen, zeigte, dass die Injektion von NEA in die otische Vesikel innerhalb von 60 Minuten nach der Infektion die Rekrutierung von Neutrophilen und Makrophagen sowie die Phagozytose von Bakterien auslöste.

In dieser Abbildung wurden zwei markierte Makrophagen, die fünf Stunden nach der Infektion zur otischen Vesikel rekrutiert wurden, mittels Photoconversion umgewandelt und anschließend über die folgenden 24 Stunden verfolgt. Obwohl einige umgewandelte Zellen in der otischen Vesikel oder im Kopfbereich verbleiben, wurden andere auch im gesamten Körper der Larven disseminiert, wie hier zu sehen ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Streptococcus n EEA in die otische Vesikel von Zebrafischembryos, die drei Tage nach der Befruchtung alt sind, mikroinjiziert.

Dies beinhaltet das Ausrichten anästhesierter Larven auf der Injektionsform und das Befüllen der Nadel mit dem bakteriellen Inokulum. Zwei, mikroinjizieren von Bakterien in die otische Vesikel. Drei, das Montieren infizierter Larven in niedrig schmelzendem Agarose, und vier, die Verwendung eines konfokalen Mikroskops, um Wirt-Leukozyten farblich zu markieren und die Interaktionen zwischen Leukozyten und Pathogenen in vivo abzubilden.