Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, ein Nagetiermodell zu verwenden, um Tissue-Engineering-Transplantate für den Ersatz des vorderen Kreuzbandes zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein biologisch abbaubares Polymergerüst hergestellt wird. Im zweiten Schritt wird das Gerüst in ein Rattenknie implantiert.

Nach 16 Wochen werden die aus dem Gerüst gebildeten Neo-Bänder für die histologische Analyse entnommen. Letztendlich wird die biomechanische Festigkeit des Kollagens getestet, um die Qualität dieser Tissue-Engineering-Transplantate für den Einsatz bei der ACL-Rekonstruktion zu beurteilen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber anderen Methoden der Gerüstbewertung bestehen darin, dass dieses Modell das Gerüst der komplexen In-vivo-Umgebung aussetzt und gleichzeitig kostengünstig und einfacher zu handhaben ist als größere Tiermodelle.

Dieses Modell kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten, z. B. wie sich ein künstlich hergestelltes Gerüst in die In-vivo-Umgebung integrieren lässt, um ein Neo-Band zu bilden. Diese Technik kann zu neuen Behandlungen und zur Rekonstruktion des VKB führen. Da Kleintiermodelle der erste Schritt zur klinischen Translation sind, kann diese Methode jedoch auch zur Evaluierung unseres speziellen Gerüsts verwendet werden.

Es kann auch auf andere Tissue-Engineering-Verträge angewendet werden, z. B. auf solche mit Zellen und Wachstumsfaktoren. Wir optimieren die Operationstechnik, indem wir die Methoden von Dr. Scott Rodeo und Kollegen am Hospital for Special Surgery in New York modifizieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, das Elektrospinnen und die chirurgischen Schritte allein durch schriftliche Anweisungen zu erlernen.

Beim Elektrospinnen bildet Polycaprolacton ein Gerüst für eine große Acrylbox mit Einstiegspunkten für die Ausgangs-Polycaprolacton-Lösung. Ein motorbetriebener Auffangdorn und ein Vakuumanschluss, der von einer Spannungsquelle angetrieben wird, die in einem chemischen Abzug platziert ist, werden benötigt, um als isoliertes Vakuummedium für den Elektrospinnprozess zu dienen. Reinigen Sie die Schachtel vor Beginn des Eingriffs gründlich mit 70%igem Ethanol und bedecken Sie alle Oberflächen mit Para-Folien, um Verunreinigungen zu entfernen, die die Qualität des elektrogesponnenen Produkts beeinträchtigen könnten.

Schalten Sie dann den Lüfter ein und laden Sie drei Milliliter frisch zubereitetes Polycaprolacton-Polymer in eine 10-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen 18-Gauge-Nadel. Nachdem Sie alle Luftblasen entfernt haben, schließen Sie die Lösung in eine programmierbare Spritzenpumpe ein und führen Sie die Nadel durch die Eintrittsöffnung in die Acrylbox ein, wobei Sie etwa einen halben Zoll der Nadel außerhalb der Box lassen. Decken Sie als Nächstes den rotierenden Lattendorn fest mit einem dünnen Streifen Aluminiumfolie ab und verriegeln Sie den Dorn mit dem Motor auf der gegenüberliegenden Seite der Box, etwa 15 Zentimeter von der Spritzennadel entfernt, um als Auffangbehälter zu fungieren und einen Kunststoffschlauch in den Vakuumanschluss einzuführen.

Schließen Sie dann den Schlauch an die Vakuumquelle des Abzugs an und schalten Sie ihn ein. Decken Sie nun die Acryldose mit dem Deckel ab und stellen Sie die Infusionsrate der programmierbaren Spritzenpumpe auf 2,5 Milliliter pro Stunde ein. Erden Sie dann das Minuskabel, schalten Sie den Motor ein, um den Dorn mit 3.450 U/min zu betreiben, und befestigen Sie das Pluskabel der Spannungsquelle mit einer Krokodilklemme an der Nadelspitze außerhalb der Box.

Sobald die Infusion der Polycaprolactonlösung begonnen hat, schalten Sie die Spannungsquelle ein und stellen Sie sie auf eine Betriebsspannung von 20 Kilovolt ein. Nach 12 Minuten Infusion hat sich aus 0,5 Millilitern der Polycaprolacton-Lösung eine homogene Manschette gebildet. Schalten Sie alle Geräte aus, einschließlich Spannung, Quelle, Motor, Vakuum und Spritzenpumpe.

Entfernen Sie den Dorn vom Motor, entfernen Sie die Polymermanschette vom Dorn und führen Sie einen einzigen Querschnitt aus, um eine rechteckige elektrogesponnene Matte zu erhalten. Dann schneiden Sie die Matte mit dem Laser zu mehreren kleinen Blättern, die später in vier Schichten dicke Streifen geschnitten und zu Gerüsten zusammengenäht werden, bevor Sie mit der Operation beginnen. Bestätigen Sie zunächst eine adäquate Anästhesie, indem Sie nicht auf den Druck des Hinterfußes reagieren.

Machen Sie dann einen zwei Zentimeter langen vertikalen Schnitt medial zum Knie, zentriert auf Höhe der Patella, und ziehen Sie die Haut bei Bedarf seitlich zurück. Als nächstes führen Sie mit einem Skalpell eine mediale para-patella-Arthrotomie direkt neben der Patella durch, die sich proximal bis zur Höhe des Musculosehnenübergangs des Quadrizeps und distal bis zur Höhe des Patellasehnenansatzes am Tibiatuberkel erstreckt. Machen Sie nun einen einen Zentimeter vertikalen Schnitt durch die Kniekapsel direkt seitlich der Patellasehne, um die Patella seitlich zu lösen.

Stellen Sie dann sicher, dass das Knie gestreckt ist, führen Sie eine feine Schere von der lateralen zur medialen Seite unter der Patella durch und spreizen Sie die Schere einige Male, damit der Streckmechanismus beim Beugen des Knies auf beide Seiten verschoben werden kann. Verschieben Sie die Patella lateral, um das Innere des Kniegelenks freizulegen, was eine klare Visualisierung der interkondylären Kerbe und der Femurkondylen bestätigt. Durchschneiden Sie dann das ACL und das PCL in der Kerbe.

Platzieren Sie nun die Spitze eines 1,6 Millimeter großen K-Drahtes, der an einer Bohrmaschine befestigt ist, auf dem ACL-Ursprung in der Interkondylenkerbe und bohren Sie seitlich, während ein Assistent das Knie stabilisiert. Führen Sie dann den K-Draht einige Male ein und aus, um einen freien Durchgang für das Transplantat zu gewährleisten. Visualisieren Sie den Austrittspunkt an der lateralen Seite des Oberschenkelknochens und entfernen Sie bei Bedarf mit einem Skalpell jegliches Weichgewebe.

Wenn der Tunnel frei ist, platzieren Sie den K-Draht auf dem ACL-Fußabdruck auf dem Tibiaplateau und bohren Sie einen seitlichen, während ein Assistent das Knie stabilisiert. Visualisieren Sie dann den Austrittspunkt an der anterolateralen proximalen Tibia, indem Sie das Skalpell verwenden, um das Weichgewebe nach Bedarf zu reinigen, so dass der Punkt, an dem der K-Draht aus der Tibia austritt, vollständig sichtbar ist, und führen Sie eine verkürzte Keith-Nadel von nicht mehr als zwei Zoll Länge durch den Femurknochentunnel. Fädeln Sie nun die beiden Nahtenden von einem Ende des Transplantats durch ein Nadelöhr und ziehen Sie mit der Nadel ein Ende des Transplantats durch den Femurtunnel.

Verwenden Sie dann die Nadel, um das andere Ende des Transplantats mit einer Vicryl-Naht mit vier Nullen durch den Tibiatunnel zu führen. Befestigen Sie als Nächstes das femorale Ende des Transplantats mit einem Achterstich am umgebenden Weichgewebe, während Sie das Knie in Streckung halten, um eine manuelle Spannung im Transplantat zu erzeugen. Befestigen Sie das Tibia-Ende des Transplantats mit einem weiteren achten Stich an dem umgebenden Weichgewebe, schneiden Sie das überschüssige Transplantat an beiden Enden mit einer Schere ab und lassen Sie ein bis zwei Millimeter an jedem Ende hinter dem Stich belassen.

Zum Schluss streckst du das Knie und verkleinerst die Kniescheibe. Platzieren Sie dann mit einer Vicryl-Naht mit vier Nullen einen einzelnen Achtstich, um die mediale Gelenkkapsel zu schließen, eine laterale Subluxation der Patella zu verhindern, und schließen Sie die Haut mit einer verlaufenden subkutikulären Monocryl- oder Vicryl-Naht mit fünf Nullen. 16 Wochen nach der Rekonstruktion zeigt die histologische Analyse des durchtrennten Knies, dass die Gerüstmatrix weitgehend von Fibroblasten infiltriert wird, die eosinophiles Kollagen mit guter Integration in die Knochentunnel sezernieren.

In diesem Experiment wurden die biomechanischen Eigenschaften des Gelenks unmittelbar nach der Tötung beurteilt. Alle getesteten Proben versagten an der mittleren Substanz unter Verwendung von niedrigen Verschiebungskurven, die aus Zugversuchen generiert wurden. Die Versagenslast und die Steifigkeit wurden für jede Gruppe berechnet.

16 Wochen nach der Implantation hatte das Elektro-Spon-Polymer-Transplantat die Spitzenlast und Steifigkeit des unmittelbar nach der Implantation getesteten Transplantats etwa verdoppelt. Obwohl diese Werte immer noch niedriger waren als bei der nativen ACL, kann die Operation an den Tieren in etwa 15 Minuten durchgeführt werden. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, einen guten Verschluss durchzuführen, bei dem von außen keine Naht sichtbar ist.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Endpunktanalysen wie zusätzliche Färbungen und biochemische Assays durchgeführt werden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering, mehrere Transplantatoptionen für die ACL-Rekonstruktionsaktion zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Polymergerüst für die Implantation in ein Nagetiermodell der ACL-Rekonstruktion herstellt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Tieren gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens jederzeit Vorsichtsmaßnahmen wie das Befolgen der tierärztlichen Empfehlungen und das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.