Name: Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie die stereotaktische Infusion von oligomerem Amyloid-beta in den Hippocampus der Maus. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neurotoxischer Effekte auf Neuronen im lebenden Tier.

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Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall unterstützt gewähren NS081333 (CMT), Alzheimer-Gesellschaft Zuschuss nirgens-10-171721 und National Institute of Mental Health Zuschuss MH096702 (bis UH) und National Institute on Aging geförderte Alzheimer-Forschung Center an der Columbia University Pilot Zuschuss AG008702 (bis YYJ und JB).

Hinweis: Für alle Tierversuche, institutionelle und nationale Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren wurden befolgt. 1. Bereiten Sie Chirurgische Instrumente und Lösungen für die Chirurgie <ol><li> Autoklaven alle chirurgischen Instrumenten aus Edelstahl. </li><li> Bereiten Sie 70% Ethanol durch Verdünnen 200 proof absolutes Ethanol mit sterilem molekularen Grad entionisiertem, destilliertem Wasser. </li><li> Bringen Sie die 29 G Nadel auf die Hamilton-Spritze. Das Innere des Hamilton-Spritze und Nadel reinigen durch die Ausarbeitung und Auswerfen nanoreinem Wasser wiederholt für 1 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit 70% Ethanol. <ol><li> Entfernen Sie den Kolben und Nadel von der Hamilton-Spritze. Luft trocknen die Teile in einer Steril O / N. </li><li> Bestrahlen die Nadel und Spritze mit UV-Licht für 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li></ol></li><li> Vorbereitung Salzlösung durch Auflösen von NaCl in Wasser UPW auf ein Endgewicht zu-Volumen-Konzentration von 0,9%. Sterilizie die Lösung durch Filtrieren über 0,2 um Porenfilter. </li></ol> 2. Bereiten Sie oligomere Aß 1-42 <ol><li> Monomerize resuspendieren rekombinante menschliche Aß 1-42 in DMSO bis 5 mM genau wie in der Veröffentlichung der Fa &#39;und andere, 13 beschrieben. </li><li> Verdünne 5 mM Aß 1-42 mit sterilem (1x) PBS auf 100 &amp; mgr; M am Tag vor der Operation. </li><li> Mischen Sie die Lösung gut durch Verreiben. </li><li> Inkubieren Aß 1-42 Lösung für 12 Stunden bei 4 ° C. Anmerkung: Die Steuerlösungen wie DMSO verdünnt in PBS oder verschlüsselt / Rückwärts Aß 1-42 Peptids sollte die gleiche Weise wie A &amp; bgr; 1-42, hergestellt werden. </li></ol> 3. Bestimmen Injection Koordinaten <ol><li> Mithilfe der erwachsenen Maus-Gehirn-Atlas, den genauen anterior-posterior (AP), medial-lateral (ML) zu bestimmen, und dorsal-ventral (DV) Koordinaten für die Hirnregion von Interesse 14. Neinte: Um die Technik, die wir mit den folgenden Koordinaten vom Bregma abgeholt Gyrus dentatus des Hippocampus als Ziel zu veranschaulichen: AP, -2.00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2.2 mm. Das negative Vorzeichen vor dem P-Wert zeigt an, dass es 2,00 mm posterior des Bregma. Die ± Zeichen vor der ML Wert zeigt nach links und rechts von der Mitte. Schließlich das negative Vorzeichen vor dem DV zeigt es ventral von der Oberfläche des Gehirns bewegen. </li></ol> 4. stereotaktischen Rahmen-Setup <ol><li> Tragen eine Chirurgische Gesichtsmaske, sauberen Kittel und sterile OP-Handschuhe. </li><li> Wischen Sie stereotaktischen Instrument und Maus-Adapter mit 70% Ethanol. </li><li> Lay down sterile Operationstuch auf den Tisch. </li><li> Setzen Sie den stereotaktischen Instrument mit Maus-Anschluß auf der Oberseite des sterilen Operationstuch. </li><li> Wischen Sie die Maus Heizkissen mit 70% Ethanol. Positionieren Sie das Heizkissen auf den stereotaktischen Rahmen Bett. Verwenden Sie für allgemeine Zwecke laboratory Kennzeichnung Band zu Band auf der Heizkissen über die Maus-Anschluß Bett. <ol><li> Befestigen Sie das Heizkissen auf den Warmwasserrückführpumpe nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Schalten Sie den Warmwasserrückführpumpe und die Temperatur auf 37 ° C, und warten Sie, bis es erreicht hat. </li></ol></li><li> Befestigen Sie das 50 ul Hamilton-Spritze mit einer 29 G-Nadel auf den stereotaktischen Rahmen durch Aufschrauben auf den motorisierten vertikalen Einspritzwelle nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Schalten Sie die Perle Sterilisator und warten, bis es vom Hersteller voreingestellte Temperatur erreicht. Hinweis: Dies ist für die Sterilisation Edelstahlinstrumente zwischen Tieren verwendet. Es dauert Einrichtungen 20 sec Berührung mit den Kügelchen für die Sterilisation. </li><li> Schalten Sie Kochplatte und setzen Sie ihn auf 42 ° C und legen Sie ein sauberes leeren Käfig oben. </li><li> Während die Hamilton-Spritze ist auf der stereotaktischen Rahmen fixiert verwenden Sie die motorisierte stereotaktischen injector der Erstellung des Aß 1-42-Lösung. Hinweis: Erstellen Sie mehr als 4 &amp; mgr; l der Lösung in die Spritze und dann mit dem stereotaktischen Injektor, um den Einspritzvolumen eingestellt. Betreiben Sie das Einspritzventil nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 5. Vorbereitung der Tiere <ol><li> Bestimmen Sie das Gewicht der Maus mit der Waage. </li><li> Betäuben Maus mit Ketamin / Xylazin Cocktail an 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin durch Injektion intraperitoneale (IP). Überwachung der Narkosetiefe durch den Verlust von toe Prise Reflex. </li><li> Nachdem die Maus sediert nehmen Sie die Haarschneidemaschine und den Kopf zu rasieren, um die Haut über den Schädel freizulegen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Heizkissen auf der Oberseite der stereotaktischen Bett. </li><li> Verwenden Sie den Spachtel, um den Mund in den Zähnen Wache öffnen und legen Sie die Schneidezähne. Sichern Sie das Mundstück über das Gesicht der Maus. Klemmen Sie es vorsichtig nach unten, und nicht zu eng. </li><li> Position die bilateralen Ohr Querstangen in Gehörgang, um den Kopf zu sichern. Verschieben Sie jede Querstange, bis sie den Schädel schlägt, und dann drehen Sie die Schraube, bis sie einrastet. <ol><li> Um sicherzustellen, dass der Kopf befestigt ist, mit dem Zeigefinger sanft nach unten drücken auf den Kopf. Wenn der Kopf richtig gesichert wird es nicht geben, oder zu verschieben, wenn sie gedrückt. </li></ol></li><li> Einen Tropfen Augencreme oder Augentropfen für die Augen, um sie feucht zu halten. Stellen Sie sicher, die Augen sind in der gesamten chirurgischen Eingriffs feucht. </li><li> Zur Desinfektion der Operationsstelle zu verwenden sterile Wattestäbchen zu Betadin-Lösung auf die Haut über den Schädel, gefolgt von 70% igem Ethanol gelten. Führen Sie die Wechsel Betadin und 70% Ethanol Reinigung 2 weitere Male. </li></ol> 6. Chirurgie und Infusion <ol><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 2-3 mm Inzision in der Mittellinie der Kopfhaut zu machen, und dann mit einem geraden feinen Schere, um die Schnittführung auf 1,0 bis 1,5 cm zu verlängern, um die Pfeilnaht, Bregma und Lambda des Schädels, Sehenswürdigkeiten aussetzens, die die stereotaktischen Koordinaten basieren. Verwenden Sie Mikroschellen, um die Haut auseinander zu halten. Hinweis: Die Bregma und Lambda-Positionen sind in den Maus-Gehirn-Atlas &quot;Gehirn der Maus in Stereotaktische Koordinaten&quot; 14 erklärt. </li><li> Nehmen Sie ein Wattestäbchen, legen Sie ihn in steriler Kochsalzlösung, und es verwenden, um den Schädel zu reinigen. Dann mit einem sauberen trockenen Wattestäbchen, um den Schädel zu trocknen. </li><li> Verwenden Sie eine sterile feinen Kugelschreiber, um einen Punkt auf dem Bregma markieren. Verwenden die stereotaktische Mikromanipulator, um die Hamilton-Spritze zu positionieren, so dass die Spitze der Nadel gerade berührt den Punkt auf dem Bregma. <ol><li> Nehmen Sie das DV zu koordinieren. </li><li> Um zu überprüfen, ob der AP-Achse des Schädels Niveau bewegen Sie den Hamilton-Spritze nach hinten, so dass die Spitze der Nadel des Lambdapunkt berührt. </li><li> Notieren Sie die DV Position. Sicherstellen, dass die DV-Koordinaten Bregma und Lambda sind innerhalb von 0,5 mm. Anmerkung: Das Ziel ist es, die Differenz DV Bregma und Lambda minimieren. </li></ol></li><li> Benutze sieicromanipulator die Hamilton-Spritze Nadelspitze zurück zum Bregma Punkt zurückzukehren. </li><li> Nehmen Sie die Startposition AP. </li><li> Berechnen Sie die Endung AP Position durch Subtraktion 2,00 mm von der Ausgangs AP koordinieren. </li><li> Verwenden Sie die Mikromanipulator, die Hamilton Spritzennadel auf die endgültige AP neu zu koordinieren. </li><li> Nehmen Sie das aktuelle ML koordinieren. </li><li> Berechnung der linken und rechten endet ML Koordinaten durch Addieren oder Subtrahieren von 1,3 mm von der Ausgangs ML koordinieren. </li><li> Verwenden Sie die Mikromanipulator, die Hamilton Spritzennadel, um entweder die Endung ML-Koordinate zu bewegen. <ol><li> Tippen Sie auf die Nadelspitze auf die Oberfläche des Schädels an beiden enden ML Koordinaten und notieren Sie die DV-Koordinaten und sicherzustellen, dass die Werte innerhalb von 0,5 mm. Hinweis: Das Ziel ist, den DV Unterschied zwischen den beiden enden ML Koordinaten minimieren. </li><li> Während bei einem Ende zu koordinieren ziehen Sie die Nadel bis 0,5-1 cm über den Schädel. Werfen Sie einen sterilen feinen Kugelschreiber, um einen Punkt auf th markierene Oberfläche des Schädels. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Gegenseite des Schädels. </li></ol></li><li> Schwenken Sie die Hamilton-Spritze klar aus dem Weg. </li><li> Bringen 0,8 mm Bohrkopf auf den Bohrer. Nehmen Sie die Bohrmaschine mit beiden Händen, setzen die Ellbogen auf der Oberfläche der Tabelle für die Stabilität, und positionieren Sie den Bohrkopf leicht über dem Sharpie Punkt auf der linken oder rechten ML koordinieren. Aktivieren Sie den Bohrer, senken Sie die Bohrerspitze auf die Schädeloberfläche, um ein Loch in den Schädel einzuführen. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Gegenseite. Hinweis: Einige Blutungen können von den neu eingeführten Löcher auftreten. Wenn es dann Blutungen mit einem sauberen trockenen Wattestäbchen, um das Blut abtupfen. </li><li> Bewegen Sie den Hamilton-Spritze wieder in Position über eine der neu eingeführten ML Löcher. Senken Sie die Nadel Hamilton direkt hinter dem Schädel. An dieser Stelle darauf achten, nicht, um das Gehirn zu durchstechen. Um sicherzustellen, dass die Nadel übergeben der Schädel nehmen Sie den Zeigefinger und sanft drücken Sie die Nadel gegen den Schädel, um sure die Nadel das Loch nicht zu verlassen. </li><li> Nehmen Sie die Start DV koordinieren. </li><li> Berechnen Sie die Endung DV-Koordinate durch Subtraktion 2,2 mm von der Ausgangs DV koordinieren. </li><li> Senken Sie die Nadel bis zum Angebotsende DV koordinieren. </li><li> Aktivieren Sie den stereotaktischen Injektorpumpe bis 4 &amp; mgr; l von Aß 1-42 in den Gyrus dentatus mit einer Rate von 0,5 ml / min zu pumpen. </li><li> Wenn die Infusion beendet ist lassen sich die Nadel an Ort und Stelle bleiben für eine weitere 1 min auf Rückfluss der Lösung aus der Injektionsstelle zu minimieren. </li><li> Bewegen Sie die Nadel auf die andere Seite des Gehirns, und wiederholen Sie die Schritte von 6,13 bis 6,18. </li></ol> 7. Tier Removal und Nachsorge <ol><li> Lösen Sie die Ohr Bars und Gesicht / Nasenschutz. Entfernen Sie die Maus aus dem Gerät. </li><li> Verwenden Sie ein Student Standardmuster einer Pinzette zu ziehen in der Nähe der Kopfhaut und dann verschließen die Wunde mit Naht. </li><li> Injizieren Sie 1 ml steriler Kochsalzlösung in die Maus über IP für Trink. </li><li> InProjekt Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan, Schmerzen zu lindern. </li><li> Pflegen Sie die Maus in die sauberen leeren Käfig auf der Oberseite der 42 ° C heißen Platte gesetzt, bis er aufwacht, dann lege sie in ihre Gehäusekäfig mit ausreichend Nahrung und Wasser. </li><li> Verwalten Buprenorphin subkutane Injektion alle 12 Stunden für 3 Tage zur Schmerzlinderung. </li></ol> 8. Fadenzieh <ol><li> Betäuben Maus mit Ketamin / Xylazin Cocktail an 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg xlyazine von IP. Hinweis: Dies ist 7-10 Tage nach der Operation durchgeführt. </li><li> Verwenden Sie ein Student Standardmuster einer Pinzette und gerade feinen Schere, um die Naht zu entfernen. </li><li> Injizieren Sie 1 ml steriler Kochsalzlösung in die Maus über IP für Trink. </li><li> Pflegen Sie die Maus in einem sauberen leeren Käfig an der Spitze von 42 ° C heiße Platte gesetzt, bis er aufwacht, und lege sie in ihre Gehäusekäfig mit ausreichend Nahrung und Wasser. </li></ol> 9. Tieropfer und Gewebeverarbeitung <ol><li> Betäuben die Maus und perfuse es mit 4% Paraformaldehyd 15, entfernen Sie das Gehirn, und verarbeiten sie für Kryoschneiden 16. Anmerkung: Der Zeitpunkt des Tieropfer hängt vom Experimentator. Für unsere Untersuchungen haben wir uns für 7 und 14 Tage nach der Operation. </li></ol>

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<li>Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+the+rat+dentate+gyrus%3A+an+immunocytochemical+and+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study.</a> Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).</li>
<li>Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+mediates+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+memory%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Um eine erfolgreiche Aß 1-42 Injektion erreichen der Experimentator oder Chirurg muss: 1) Verwenden Sie aseptische Technik; 2) richtig das Gehirn Region von Interesse mit genauen Koordinaten zu identifizieren; 3) in der Lage sein, um die Maus richtig zu sichern in der stereotaktischen Rahmen mit dem Gehirn in den AP und ML-Achse nivelliert; 4) die Fähigkeit, den Mikromanipulator mit Präzision zu arbeiten; 5) eine ordnungsgemäße post-operative Betreuung. Wenn diese Taste Schritte befolgt werden die Maus sollte...

Amyloid Plaque-Ablagerungen, die von Amyloid-beta (1-42 A &amp; bgr;) zusammengesetzt sind, sind ein wesentliches Merkmal der Pathologie der Alzheimer-Krankheit (AD). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass hohe oder toxischen Mengen von rekombinantem oligomeren Aß 1-42 entlocken neuronalen Tod, synaptic Dystrophie, Verlust und Funktionsstörung; sowie Lern- und Gedächtnisdefizite 1-4. Hirnregionen betroffen sind der Hippocampus, die Rinde, und subkortikalen Strukturen wie dem basalen Vorderhirns und der Amygdala 5,6. Bis heute gibt es mehrere transgene Mausmodelle, die den A &amp; bgr; 1-42 Pathologie von AD zu simulieren versucht. Je nach Belastung diese Tiere als nützlich erweisen bei der Prüfung wählen pathologischen Merkmale von AD zu sein. Leider mit Ausnahme von 2 transgenen Linien, APP23 und 5XFAD, diese Mäuse nie vollständig replizieren Neuronenverlust, ein wichtiger Aspekt der AD. Auch mit dem in APP23 und 5XFAD beobachtet Neuronenverlust, der neuronalen Tod Observed war subtil, altersabhängig und isoliert, um ein paar ausgewählte Regionen 7,8. Die direkte Infusion von oligomeren Aß 1-42 in den Wildtyp-Maus Gehirn bietet eine hervorragende In-vivo-Modell, das die neuronalen Tod Aspekt amyloidopathy 1,9,10 repliziert. Im Gegensatz zu den üblicherweise verwendeten transgenen Mausmodellen die oligomere Aß 1-42 Infusions Modell ist ideal für akut erheb Aß 1-42 Ebenen in einem räumlichen und zeitlichen Weise. Der Vorteil der Verwendung von Wildtyp-Mäusen für dieses Modell vermeidet Potentialausgleich oder Nebenwirkungen von den in transgenen Mauslinien eingeführten Mutationen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Infusion toxischen Mengen von Aß 1-42 in den Hippocampus auslöst Neuron Tod in der Nähe der Injektionsstelle innerhalb von 1 Woche 1. Darüber hinaus, in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass A &amp; bgr; 1-42 ist giftig für cholinerge Neuronen des basalen Vorderhirns 11cholinergen Neuron (BFCN) Bevölkerung, die zum Hippocampus projiziert wird 20-50% innerhalb von 7-14 Tagen folgende Beta-Amyloid-Infusion 1,10 in Mäusen verringert, so dass effektiv für die Prüfungen von isolierten neuronalen Schaltkreise im Gehirn. Da BFCN Projekt ipsilateral zu der Gyrus dentatus des Hippocampus 12, zum größten Teil Steuer- / Fahrzeug und oligomeren A &amp; bgr; 1-42-Lösungen können auf jeder Seite des Gehirns erlaubt Vergleiche zwischen den linken und rechten Hemisphären 1 erfolgen injiziert werden. In diesem Bericht werden wir eine detaillierte chirurgische und Einspritzmethode für Erwachsenen-Wildtyp C57BL / 6J-Mäusen. Dieser Mausstamm ist wegen seiner breiten Einsatz in der Forschung ausgewählt. Technisch gesehen kann jeder Hirnregion Infusionsrichtet sein, aber hier werden wir den Gyrus dentatus des Hippocampus als Ziel verwenden, um die Technik zu veranschaulichen.

<table><tbody><tr><td>Ketamin HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg Ketamin pro 1 kg Tier</td></tr><tr><td>Xylazin (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>nicht verfügbar</td><td>10 mg Xylazin pro 1 kg Tier</td></tr><tr><td>Buprenex (0,3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0,1 mg Buprenex pro 1 kg Tier</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>nicht verfügbar</td><td>100 &mu; M; Dieses Amyloid wurde in der Arbeit</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Kann anstelle von Amyloid aus dem Teplow Labor</td></tr><tr><td>A&beta verwendet werden; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Kann anstelle von Amyloid aus dem Teplow-Labor</td></tr><tr><td>verwendet werden Scrambled A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Kann als Kontrollpeptid zum Vergleich von A & beta verwendet werden; 1-42</td></tr><tr><td>NU4 Antikörper (oligomerer Amyloid-Antikörper)</td><td>Geschenk von William Klein/Northwestern U.</td><td>nicht verfügbar</td><td>1:2.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-Amyloid Oligomer Antikörper&nbsp; (Polyklonales Kaninchen)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Kann anstelle von Nu4 verwendet werden; muss vom Endbenutzer getestet werden</td></tr><tr><td>6E10 Antikörper (monoklonale Maus) (Amyloid-Antikörper)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>ChAT Antikörper (polyklonale Ziege)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>DeadEnd Fluorometrisches TUNEL-System</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für Verwenden</td></tr><tr><td>Sie Prolong Gold Antifade Reagenz mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Verwenden Sie es beim Eindecken von Objektträgern</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>nicht verfügbar</td><td>2% Lösung</td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Zur Herstellung von 70% Ethanol zur Desinfektion und Desinfektion von</td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricin Gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>Zur Trennung von A&beta; 1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricin SDS Running Buffer (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>Zum Laufen von 10-20% Tricin-Gelen</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>Zum Übertragen von 10-20% Tricin-Gelen</td></tr><tr><td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>Zur Verbesserung von A&Beta; 1-42 Signal; Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers</td></tr><tr><td>Protran BA79 Nitrocellulose-Blotting-Membran, 0,1 &mu; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>Für den Transfer von 10-20% Tricin-Gelen</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Elektrophorese-Aparatus für den Transport von 10-20% Tricin-Gelen</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricant Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>nicht verfügbar</td><td>Zum Feuchthalten der Mausaugen während der Operation; erhältlich in örtlichen Apotheken &#160; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Refresh Optive Lubricant Eye Drops</td><td>Allergan</td><td>nicht verfügbar</td><td>Um die Augen der Maus während der Operation feucht zu halten; kann in örtlichen Apotheken gefunden werden; Kann anstelle von GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td>verwendet werden Zur Desinfektion und Desinfektion</td></tr><tr><td>von runden/konischen Spateln&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>Zum Öffnen des Tiermauls</td></tr><tr><td>Bulldog Serrefines Klemmen (Maulmaße 9X1,6 mm; Länge 28 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td>Optional; Zum Auseinanderhalten der Kopfhaut während der</td></tr><tr><td>Injektion Gerade Feinschere (Schneide 25 mm; Länge 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>Zum Schneiden der Kopfhaut</td></tr><tr><td>#3 Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Chirurgische Klinge</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>Zum Durchführen von Kopfhautschnitten</td></tr><tr><td>Student Standard Pattern Pinzette (Spitzenmaße 2,5x1,5 mm; Länge 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Zum Schließen der Kopfhaut während des Nähens</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>Zum Rasieren von Haaren</td></tr><tr><td>T/Pump Warmwasser-Umwälzer&nbsp;</td><td>Kent Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>TP-700</td><td>Zum Erwärmen von Tieren während der Operation</td></tr><tr><td>Wiederverwendbares Warmining Pad (5" x 10")</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>Zur Befestigung an der T/Pump-Warmwasserumwälzung, um das Tier während der Operation zu erwärmen</td></tr><tr><td>Akku-Mikrobohrer</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td>Verwenden Sie 0,8 mm Stahlfräser, um Löcher in den Schädel zu bohren</td></tr><tr><td>Laborstandard-Stereotaxisches Instrument mit Maus & Neugeborenen-Rattenadapter</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Nur für Maus Stereotaktisches Instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Kann dies anstelle von Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Trockener Glasperlensterilisator</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>Zum Sterilisieren von Edelstahlinstrumenten</td></tr><tr><td>Steriles chirurgisches Tuch (18" x 26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze 50 ml, Modell 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>Für die Injektion in das Gehirn; verwenden Sie verschiedene Spritzen für verschiedene Lösungen</td></tr><tr><td>29 G Nadel, kleine Nabe RN NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>Zum Befestigen an der Hamilton Spritze für die Injektion des Gehirns</td></tr><tr><td>1 ml BD Tuberkulinspritzen</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>Für die Verabreichung von Anästhesie und Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>30 G Nadel (0,5")</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Für die Verabreichung von Anästhesie und Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Tragbare elektronische Waage der CS-Serie (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Zum Wiegen von Tieren zur Bestimmung der Anästhesiedosis</td></tr><tr><td>Heizplatte (obere Platte mit Abmessungen 7,25 x 7,25 Zoll)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>Zum Erwärmen von Tieren nach der Operation</td></tr><tr><td>Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>Zum Verschließen von</td></tr><tr><td>Wunden Vetbond Tissue Adhesive (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>Optional: zur Unterstützung des Wundverschlusses; Mit Naht verwenden.</td></tr><tr><td>Sterile Applikatoren mit Holzschaft aus Baumwolle</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>Zum Reinigen und Trocknen von Operationswunden</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Zum Sammeln von Hirnschnitten</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>Zum Montieren von Objektträgern</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Spritzenfilter 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>Zum Sterilisieren von Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Sterile Hautmarker mit zwei Spitzen von Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>Zum Markieren von Koordinaten auf dem Schädel</td></tr></tbody></table>

stereotaktische infusion von oligomeren amyloid-beta in die maus-hippocampus

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die Alterung der Bevölkerung. Ein wesentliches Merkmal der neuropathologischen Erkrankungen ist die Überproduktion von Amyloid-beta und die Ablagerung von Amyloid-beta-Plaques in Hirnregionen der betroffenen Individuen. Im Laufe der Jahre haben Wissenschaftler zahlreiche Alzheimer Mausmodelle, die die Amyloid-beta-Pathologie zu replizieren versuchen generiert. Leider sind die Maus-Modellen nur selektiv imitieren die Krankheitsmerkmale. Neuronalen Tod, ein bekannter Effekt im Gehirn von Alzheimer-Patienten wird spürbar fehlt in diesen Mäusen. Formen von Amyloid-beta, die nachweislich die meisten Neuronen toxisch zu sein - - stereotaktisch in das Gehirn Daher haben wir und andere ein Verfahren zum direkten Infusion löslichen oligomeren Spezies von Amyloid-beta beschäftigt. In diesem Bericht verwenden wir männliche C57BL / 6J-Mäusen, diese Operationstechnik zur Erhöhung Amyloid-beta Ebenen in einer ausgewählten Region des Gehirns zu dokumentieren. DieInfusions Ziel dem Gyrus dentatus des Hippocampus, weil diese Gehirnstruktur, zusammen mit dem basalen Vorderhirns, die durch das cholinerge Schaltung verbunden ist, für einen der Bereiche der Degeneration bei der Krankheit. Die Ergebnisse der Hebe Amyloid-beta im Gyrus dentatus über stereotaktischen Infusions offenbaren Steigerungen Verlust von Nervenzellen im Gyrus dentatus innerhalb von 1 Woche, während es einen entsprechenden Anstieg in Zelltod und cholinergen Neuronenverlust in der vertikalen Schenkel des diagonalen Bandes von Broca des basalen Vorderhirns. Diese Effekte werden bis zu 2 Wochen beobachtet. Unsere Daten weisen darauf hin, dass die aktuelle Beta-Amyloid-Infusion Modell bietet eine alternative Maus-Modell zu Region spezifische Neuronen Tod in einem kurzfristig anzugehen. Der Vorteil dieses Modells ist, dass Amyloid-beta in einer räumlichen und zeitlichen Weise erhöht werden.

Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von humanem rekombinantem oligomeren A &amp; bgr; 1-42 ergibt lösliche oligomere Spezies, bestehend aus Monomeren, Dimeren, Trimeren und Tetrameren (1A). Diese niedermolekularen Aß 1-42 Spezies, aber nicht die Fibrillen und Plaques wurden in zahlreichen Einstellungen gezeigt, die meisten Neuronen toxisch 1,4,9,17-19 sein. Um festzustellen, ob oligomeren Aß 1-42 induziert Neuron Tod im Gehirn der Maus Aß 1-42...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte stereotaktische Gehirninfusion von Amyloid-beta. Diese Methodik bietet ein alternatives In-vivo-Mausmodell, um die kurzfristigen Auswirkungen von Amyloid-Beta auf Gehirnneuronen zu untersuchen.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die stereotaktische Injektion eines Liga meric a beta 1 42 in den Gyrus dentatus des Hippocampus. Dies wird erreicht, indem zunächst ein liga meric, eine Beta-1-42-Lösung, hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Injektionskoordinaten zu bestimmen.Legen Sie anschließend chirurgisch den Schädel des Tieres frei und führen Sie zwei Löcher für das Einführen der Nadel ein. Der letzte Schritt besteht darin, die Spritzennadel in ihre endgültige Position zu bringen und ein Beta 1 42 zu infundieren. Letztendlich wird die stereotaktische Injektionsmethode Abeta 1 42 verwendet, um die toxischen Wirkungen von Abeta 1 42 bei einem lebenden Tier zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden transgenen Abeta 42 Mausmodellen besteht darin, dass oligomere ALA 42 auf spezielle und zeitliche Weise erhöht werden kann und die Zelltodpathologie, die in den transgenen Mausmodellen fehlt, zuverlässig reproduziert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Alzheimer zu beantworten, etwa wie sich krankhafte Prozesse bei der Alzheimer-Krankheit ausbreiten. Um diesen Vorgang zu starten, rasieren Sie den Kopf einer betäubten Maus, um die Haut freizulegen.Platzieren Sie anschließend die Maus auf einem Heizkissen in einem stereotaktischen Rahmen. Befestigen Sie dann die Schneidezähne im Zahnschutz und ein Nasenstück über dem Gesicht der Maus. Positionieren Sie danach die Ohrbügel in der Hörmaske, um den Kopf zur Kontrolle zu sichern.Wenn der Kopf gesichert ist, drücken Sie vorsichtig darauf und stellen Sie sicher, dass er sich nicht bewegt. Tragen Sie dann Salbe auf beide Augen auf, um die Salbe feucht zu halten. Desinfizieren Sie danach die Operationsstelle, indem Sie Betadin auf die Haut über dem Schädel auftragen, gefolgt von 70%igem Ethanol mit sterilen Wattestäbchen.Führen Sie die abwechselnde Reinigung mit Betadin und Ethanol noch zwei weitere Male durch. Machen Sie nun mit einem Skalpell einen zwei bis drei Millimeter großen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut. Verlängern Sie die Schnittlinie mit einer geraden feinen Schere auf etwa 1,0 Zentimeter, um die sagittale Naht, das BGMA und das Lambda des Schädels freizulegen.Ziehe danach die Haut mit einer Pinzette auseinander. Reinigen Sie den Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen, das mit steriler Kochsalzlösung getränkt ist. Verwenden Sie dann ein sauberes, trockenes Wattestäbchen, um den Schädel zu trocknen.Markieren Sie als Nächstes einen Punkt. Positionieren Sie die Hamilton-Spritze auf dem Brema mit dem Mikromanipulator so, dass die Nadelspitze gerade den Punkt auf dem bgma berührt. Notieren Sie dann die DV-Koordinate, markieren Sie einen Punkt auf dem Lambda-Punkt, stellen Sie sicher, dass die AP-Achse des Schädels waagerecht ist, indem Sie die Spritze nach hinten zum Lambda-Punkt bewegen.Die Spitze der Nadel sollte den Lambda-Punkt berühren, wie sie es mit dem bgma-Punkt getan hat. Nehmen Sie danach die DV-Position auf. Die DV-Koordinaten für Bre, MA und Lambda sollten innerhalb von 0,5 Millimetern liegen.Lege nun die Nadelspitze wieder auf den BMA-Punkt. Notieren Sie sich die Position des Start-Access Points Berechnen Sie dann die Position des End-AP, indem Sie zwei Millimeter vom Start-AP abziehen.Koordinieren Sie die Spritzennadel und positionieren Sie sie auf die endgültige AP-Koordinate neu. Notieren Sie sich als Nächstes die aktuelle ML-Koordinate. Berechnen Sie die linken und rechten ml-Endkoordinaten, indem Sie 1,3 Millimeter von der ml-Anfangskoordinaten addieren oder subtrahieren.Koordinieren Sie die Spritzennadel und bewegen Sie sie auf die abschließenden ML-Koordinaten. Berühren Sie die Nadelspitze mit der Oberfläche des Schädels an beiden ML-Endkoordinaten, und stellen Sie sicher, dass die DV-Koordinaten innerhalb von 0,5 Millimetern liegen. Während Sie an der letzten ml-Koordinate sind, ziehen Sie die Nadel 0,5 bis einen Zentimeter über den Schädel nach oben.Markieren Sie einen Punkt auf dem Schädel mit einem dunkelfarbenen, extra feinen Punkt. Wiederholen Sie diesen Schritt für die kontralaterale Seite des Schädels. Bewegen Sie dann die Spritze weg.Bohren Sie entweder links oder rechts ml ein Loch. Koordinieren Sie mit einem 0,8 Millimeter Bohrer auf dem Schädel. Wiederholen Sie diesen Schritt für die kontralaterale Seite.Bewegen Sie anschließend die Spritze in eines der neu eingeführten Löcher. Senken Sie die Nadel bis knapp hinter den Schädel und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu durchstechen, um sicherzustellen, dass die Nadel den Schädel passiert hat. Drücke die Nadel vorsichtig gegen den Schädel, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht aus dem Loch herauskommt.Notieren Sie als Nächstes die Start-DV-Koordinate. Berechnen Sie den End-dv. Koordinate durch Subtraktion von 2,2 Millimetern vom Start-DV.Koordinate und senke die Nadel bis zum End-db ab.Koordinieren Sie dann die stereotaktische Injektorpumpe so, dass sie vier Mikroliter eines Beta 1 42 mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Mikrolitern pro Minute in den Gyrus dentatus infundiert. Lassen Sie die Nadel nach der Infusion eine weitere Minute an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung aus der Injektionsstelle zu minimieren. Bewegen Sie danach die Nadel auf die andere Seite des Gehirns und wiederholen Sie den Vorgang.Schrauben Sie nun die Ohrbügel ab. Verwenden Sie eine Zange für Studenten, um die Kopfhaut zuzuziehen und die Wunde mit der Naht zu versiegeln. Nehmen Sie den Nasenschutz ab und entfernen Sie die Maus.Injizieren Sie der Maus zunächst einen Milliliter sterile Kochsalzlösung zur Hydratation und injizieren Sie Buprenorphin in einer Menge von 0,1 Milligramm pro Kilogramm subkutan zur Schmerzlinderung. Bringen Sie die Maus anschließend in einen sauberen, leeren Käfig, der auf einer 42 Grad heißen Platte steht, bis sie aufwacht. Bringen Sie die Maus dann mit reichlich Futter und Wasser in ihren Gehäusekäfig zurück.Diese Abbildung zeigt die Infusion eines beta 1 42 und eines Vehikels im linken und rechten Gyrus dentatus einer neun Monate alten Maus. Gestrichelte Linien zeigen den Injektionstrakt und die Pfeile den kollabierten Gyrus dentatus. Innerhalb einer Woche nach der Injektion von Abeta 1 42 wies der Gyrus dentatus nach sieben und 14 Tagen erhöhte Abeta 1 42-Spiegel in der Molekülschicht und der polymorphen Zellschicht in der Nähe der Injektionsstelle auf.Abeta 1 42 führte zu einer Zunahme der positiven Tunnelfärbung und einer Abnahme der Dicke des Gyrus dentatus, was die neurodegenerative Wirkung von Abeta 1 42 bestätigt. Hier wurde ein retrograder Tracer, Fluorgold, zusammen mit Abeta 1 42 in den Gyrus dentatus injiziert. Sieben Tage nach der Injektion wurde Fluorgold im basalen Vorderhirn nachgewiesen, was auf einen retrograden Transport der Markierung über cholinerge Neuronen hindeutet.Für die Quantifizierung wurden Fluorgold-positive Neuronen im basalen Vorderhirn ausgewählt. Sieben Tage nach der Injektion führte Abeta 1 42 zu einer Zunahme des Tunnels und einer Abnahme des Chats. Positive Neuronen im basalen vier Gehirn Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Studien zu molekularen Mechanismen, um die mechanistische Wirkung der Amyloid-Infusion auf das Gehirn zu untersuchen. Ich möchte mich bei Ihnen für das Anschauen unseres Videos bedanken und hoffe, dass die Methode bei Ihren Experimenten nützlich sein wird.

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Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der...

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Dieses Video zeigt eine Technik zur kontinuierlichen Infusion von Amyloid-beta (Aβ)-Peptid-spezifischen Antikörpern in den Hippocampus einer Ratte. In der Studie wird ein bilaterales Kanülensystem für eine kontrollierte Infusion von Aβ-Peptid-spezifischen Antikörpern in Verbindung mit der Infusion von löslichen Aβ-Oligomeren (Aβo) in den Hippocampus der Ratte implantiert, um die Wechselwirkungen zwischen den Oligomeren und den Antikörpern zu untersuchen.

Kontrollierte Infusion von Aβ-Peptid-spezifischen Antikörpern und Aβ-Oligomeren in den Hippocampus der Ratte

Dieses Video zeigt die präzise stereotaktische Infusion von Amyloid-Beta in den Gyrus dentatus, um ein Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu etablieren. Die genaue Koordinatenbestimmung und die kontrollierte Verabreichung von Amyloid-Beta-Proteinen führen zu einer neuronalen Degradation, stören die Gedächtnisverarbeitung und tragen zur Entwicklung der Alzheimer-Krankheit bei.

Direkte stereotaktische Infusion von Amyloid-Beta-Proteinen im Gehirn für ein Alzheimer-Modell

Quelle: Arango-Lievano, M. et. al., Längsschnittliche In-vivo-Bildgebung des zerebrovaskularen Systems: Relevanz für ZNS-Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung zur Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Amyloid-Plaques und zerebralen Gefäßen. Blaue Fluoreszenz markiert Plaques, während grüne Fluoreszenz die zerebralen Blutgefäße hervorhebt. Eine 3D-Karte der Region of Interest und hochauflösende Mosaik-Bildgebung zeigen detaillierte...

In-vivo-Bildgebung von Hirngefäßen und Amyloid-Plaques in einem Mausmodell für die Alzheimer-Krankheit

Quelle: Slezia, A. et al. Die elektrophoretische Abgabe von γ-Aminobuttersäure (GABA) in den epileptischen Fokus verhindert Anfälle bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die elektrophoretische Verabreichung von Gamma-Aminobuttersäure (GABA) zur Hemmung der Anfallsaktivität bei einer anästhesierten Maus. Es beschreibt die Schritte bei der Sondenimplantation, der Aufzeichnung der neuronalen Aktivität, der Anfallsinduktion und der kontrollierten GABA-Abgabe über eine mikrofluidische...

Elektrophoretische Abgabe von GABA in den epileptischen Fokus einer anästhesierten Maus

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

Die Amyloid-β (Aß) -injected Tiermodell die Verabreichung einer definierten Menge und Arten von Aß-Fragmente ermöglicht und reduziert individuelle Unterschiede innerhalb der einzelnen Studiengruppe. Dieses Protokoll beschreibt die intracerebroventricular (ICV) Injektion von A &amp; bgr; ohne stereotaktischen Instrumente, die Produktion von Alzheimer-ähnliche Verhaltensstörungen in normalen Mäusen ermöglichen.

Intracerebroventricular Injektion von Amyloid-β-Peptide in normalen Mäusen zu Akut Induce Alzheimer-ähnliche kognitive Defizite

Dieser Artikel zeigt, wie die Expression von Neurotransmitterrezeptoren quantifiziert und das Muster an Synapsen mit identifizierten prä- und postsynaptischen Elementen analysiert werden kann, indem eine Kombination aus viraler Transduktion optogenetischer Werkzeuge und der Freeze-Fracture-Replica-Immunmarkierungstechnik verwendet wird.

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Um die Wirkungen von Aβo in vivo zu untersuchen, haben wir ein Modell entwickelt, das auf wiederholten hippokampalen Infusionen von löslichem Aβo in Verbindung mit einer kontinuierlichen Infusion von Aβo-Antikörpern (6E10) im Hippocampus unter Verwendung osmotischer Pumpen basiert, um der neurotoxischen Wirkung von Aβo entgegenzuwirken.

Neurodegenerative Erkrankungen im Tiermodell der chronischen Amyloid-beta-Oligomers Infusion wird durch Antikörper-Behandlung Angereichert mit osmotische Pumpen entgegen gewirkt

In utero Überleben Chirurgie in Mäusen ermöglicht die molekulare Manipulation der Genexpression während der Entwicklung. Hier beschreiben wir den Einsatz von Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung, um die Injektion von retroviralen Vektoren in Gehirn der Maus am Embryonaltag (E) 9,5 führen.

Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion in der Maus Vorderhirnneuronen In Utero In E9.5

Erfahren Sie die stereotaktische Infusion von oligomerem Amyloid-beta in den Hippocampus der Maus. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neurotoxischer Effekte auf Neuronen im lebenden Tier.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

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