Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die stereotaktische Injektion eines Liga meric a beta 1 42 in den Gyrus dentatus des Hippocampus. Dies wird erreicht, indem zunächst ein liga meric, eine Beta-1-42-Lösung, hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Injektionskoordinaten zu bestimmen.

Legen Sie anschließend chirurgisch den Schädel des Tieres frei und führen Sie zwei Löcher für das Einführen der Nadel ein. Der letzte Schritt besteht darin, die Spritzennadel in ihre endgültige Position zu bringen und ein Beta 1 42 zu infundieren. Letztendlich wird die stereotaktische Injektionsmethode Abeta 1 42 verwendet, um die toxischen Wirkungen von Abeta 1 42 bei einem lebenden Tier zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden transgenen Abeta 42 Mausmodellen besteht darin, dass oligomere ALA 42 auf spezielle und zeitliche Weise erhöht werden kann und die Zelltodpathologie, die in den transgenen Mausmodellen fehlt, zuverlässig reproduziert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Alzheimer zu beantworten, etwa wie sich krankhafte Prozesse bei der Alzheimer-Krankheit ausbreiten. Um diesen Vorgang zu starten, rasieren Sie den Kopf einer betäubten Maus, um die Haut freizulegen.

Platzieren Sie anschließend die Maus auf einem Heizkissen in einem stereotaktischen Rahmen. Befestigen Sie dann die Schneidezähne im Zahnschutz und ein Nasenstück über dem Gesicht der Maus. Positionieren Sie danach die Ohrbügel in der Hörmaske, um den Kopf zur Kontrolle zu sichern.

Wenn der Kopf gesichert ist, drücken Sie vorsichtig darauf und stellen Sie sicher, dass er sich nicht bewegt. Tragen Sie dann Salbe auf beide Augen auf, um die Salbe feucht zu halten. Desinfizieren Sie danach die Operationsstelle, indem Sie Betadin auf die Haut über dem Schädel auftragen, gefolgt von 70%igem Ethanol mit sterilen Wattestäbchen.

Führen Sie die abwechselnde Reinigung mit Betadin und Ethanol noch zwei weitere Male durch. Machen Sie nun mit einem Skalpell einen zwei bis drei Millimeter großen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut. Verlängern Sie die Schnittlinie mit einer geraden feinen Schere auf etwa 1,0 Zentimeter, um die sagittale Naht, das BGMA und das Lambda des Schädels freizulegen.

Ziehe danach die Haut mit einer Pinzette auseinander. Reinigen Sie den Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen, das mit steriler Kochsalzlösung getränkt ist. Verwenden Sie dann ein sauberes, trockenes Wattestäbchen, um den Schädel zu trocknen.

Markieren Sie als Nächstes einen Punkt. Positionieren Sie die Hamilton-Spritze auf dem Brema mit dem Mikromanipulator so, dass die Nadelspitze gerade den Punkt auf dem bgma berührt. Notieren Sie dann die DV-Koordinate, markieren Sie einen Punkt auf dem Lambda-Punkt, stellen Sie sicher, dass die AP-Achse des Schädels waagerecht ist, indem Sie die Spritze nach hinten zum Lambda-Punkt bewegen.

Die Spitze der Nadel sollte den Lambda-Punkt berühren, wie sie es mit dem bgma-Punkt getan hat. Nehmen Sie danach die DV-Position auf. Die DV-Koordinaten für Bre, MA und Lambda sollten innerhalb von 0,5 Millimetern liegen.

Lege nun die Nadelspitze wieder auf den BMA-Punkt. Notieren Sie sich die Position des Start-Access Points Berechnen Sie dann die Position des End-AP, indem Sie zwei Millimeter vom Start-AP abziehen.

Koordinieren Sie die Spritzennadel und positionieren Sie sie auf die endgültige AP-Koordinate neu. Notieren Sie sich als Nächstes die aktuelle ML-Koordinate. Berechnen Sie die linken und rechten ml-Endkoordinaten, indem Sie 1,3 Millimeter von der ml-Anfangskoordinaten addieren oder subtrahieren.

Koordinieren Sie die Spritzennadel und bewegen Sie sie auf die abschließenden ML-Koordinaten. Berühren Sie die Nadelspitze mit der Oberfläche des Schädels an beiden ML-Endkoordinaten, und stellen Sie sicher, dass die DV-Koordinaten innerhalb von 0,5 Millimetern liegen. Während Sie an der letzten ml-Koordinate sind, ziehen Sie die Nadel 0,5 bis einen Zentimeter über den Schädel nach oben.

Markieren Sie einen Punkt auf dem Schädel mit einem dunkelfarbenen, extra feinen Punkt. Wiederholen Sie diesen Schritt für die kontralaterale Seite des Schädels. Bewegen Sie dann die Spritze weg.

Bohren Sie entweder links oder rechts ml ein Loch. Koordinieren Sie mit einem 0,8 Millimeter Bohrer auf dem Schädel. Wiederholen Sie diesen Schritt für die kontralaterale Seite.

Bewegen Sie anschließend die Spritze in eines der neu eingeführten Löcher. Senken Sie die Nadel bis knapp hinter den Schädel und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu durchstechen, um sicherzustellen, dass die Nadel den Schädel passiert hat. Drücke die Nadel vorsichtig gegen den Schädel, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht aus dem Loch herauskommt.

Notieren Sie als Nächstes die Start-DV-Koordinate. Berechnen Sie den End-dv. Koordinate durch Subtraktion von 2,2 Millimetern vom Start-DV.Koordinate und senke die Nadel bis zum End-db ab.

Koordinieren Sie dann die stereotaktische Injektorpumpe so, dass sie vier Mikroliter eines Beta 1 42 mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Mikrolitern pro Minute in den Gyrus dentatus infundiert. Lassen Sie die Nadel nach der Infusion eine weitere Minute an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung aus der Injektionsstelle zu minimieren. Bewegen Sie danach die Nadel auf die andere Seite des Gehirns und wiederholen Sie den Vorgang.

Schrauben Sie nun die Ohrbügel ab. Verwenden Sie eine Zange für Studenten, um die Kopfhaut zuzuziehen und die Wunde mit der Naht zu versiegeln. Nehmen Sie den Nasenschutz ab und entfernen Sie die Maus.

Injizieren Sie der Maus zunächst einen Milliliter sterile Kochsalzlösung zur Hydratation und injizieren Sie Buprenorphin in einer Menge von 0,1 Milligramm pro Kilogramm subkutan zur Schmerzlinderung. Bringen Sie die Maus anschließend in einen sauberen, leeren Käfig, der auf einer 42 Grad heißen Platte steht, bis sie aufwacht. Bringen Sie die Maus dann mit reichlich Futter und Wasser in ihren Gehäusekäfig zurück.

Diese Abbildung zeigt die Infusion eines beta 1 42 und eines Vehikels im linken und rechten Gyrus dentatus einer neun Monate alten Maus. Gestrichelte Linien zeigen den Injektionstrakt und die Pfeile den kollabierten Gyrus dentatus. Innerhalb einer Woche nach der Injektion von Abeta 1 42 wies der Gyrus dentatus nach sieben und 14 Tagen erhöhte Abeta 1 42-Spiegel in der Molekülschicht und der polymorphen Zellschicht in der Nähe der Injektionsstelle auf.

Abeta 1 42 führte zu einer Zunahme der positiven Tunnelfärbung und einer Abnahme der Dicke des Gyrus dentatus, was die neurodegenerative Wirkung von Abeta 1 42 bestätigt. Hier wurde ein retrograder Tracer, Fluorgold, zusammen mit Abeta 1 42 in den Gyrus dentatus injiziert. Sieben Tage nach der Injektion wurde Fluorgold im basalen Vorderhirn nachgewiesen, was auf einen retrograden Transport der Markierung über cholinerge Neuronen hindeutet.

Für die Quantifizierung wurden Fluorgold-positive Neuronen im basalen Vorderhirn ausgewählt. Sieben Tage nach der Injektion führte Abeta 1 42 zu einer Zunahme des Tunnels und einer Abnahme des Chats. Positive Neuronen im basalen vier Gehirn Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Studien zu molekularen Mechanismen, um die mechanistische Wirkung der Amyloid-Infusion auf das Gehirn zu untersuchen. Ich möchte mich bei Ihnen für das Anschauen unseres Videos bedanken und hoffe, dass die Methode bei Ihren Experimenten nützlich sein wird.