Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, röhrenförmige Konstrukte für die Regeneration von Gefäßgewebe zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst Kollagen- und glatte Muskelzellen vom Typ 1 in zylindrischer Geometrie unter Verwendung einer Formtechnik kombiniert werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Konstrukt in einem speziell entwickelten statischen Bioreaktor zu reifen.

Als nächstes werden die reifen Konstrukte sorgfältig geerntet und Endothelzellen werden mit einem rotierenden Bioreaktoraktor auf das Lumen des Konstrukts gesetzt. Letztendlich werden Histologie, metabolische Assays und mechanische Tests durchgeführt, um die Eigenschaften dieser röhrenförmigen Konstrukte zu bewerten. Die Besonderheit dieser Technik besteht darin, dass sie in nur einem Schritt Zellen und Kollagen kombiniert, um ohne zusätzliche physikalische oder chemische Behandlung ein Tissue-Engineering-Konstrukt mit gezielten mechanischen Eigenschaften zu erhalten.

Darüber hinaus kann das Konstrukt dank speziell entwickelter Griffe, die ihre Manipulation und Endglieder ermöglichen, leicht manipuliert werden. Diese Methode kann einen Einblick in das Zusammenspiel zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix während des Wachstums und des Umbaus für die Regeneration des Gefäßgewebes geben. Darüber hinaus kann es für eine Reihe von Zielgeweben wie Sehnen, Hauttransplantate, Herzpflaster und Nervensystem angewendet werden.

Um mit der Herstellung und Montage des statischen Bioreaktors zu beginnen, wie in dem begleitenden Textprotokoll beschrieben, sind Details zum Reservoir und zur Gaze, zur Herstellung des Griffs, zur Dornkappe und zu den Montage- und Sterilisationstechniken der Gehäuseform enthalten. Als nächstes expandieren Sie glatte Muskelzellen der Schweineaorta in einem 175 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben, bis sie zu 90 % konfluent sind. Ernten Sie die Zellen mit Standardkulturtechniken und resuspendieren Sie sie dann bei 4 Millionen Zellen pro Milliliter in vollständigem Kulturmedium.

Kombinieren Sie anschließend einen Teil Pufferlösung, zwei Teile sterile Kollagenlösung mit vier Gramm pro Liter und einen Teil Zellsuspension. Messen Sie in dieser Reihenfolge den pH-Wert der Mischung und stellen Sie sicher, dass er zwischen pH 7,0 und 7,4 liegt. Gießen Sie dann die Zellkollagenmischung vorsichtig in den zusammengesetzten Gehäuseformkomplex.

Achte darauf, dass sich keine Luftblasen in der Mischung befinden. Lassen Sie das Kollagengel eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer sterilen Umgebung ruhen. Entfernen Sie nach einer Stunde das Gehäuseröhrchen und überführen Sie das Konstrukt vorsichtig in das Reservoir mit 35 Millilitern vorwarmem Nährmedium.

Inkubieren Sie das Konstrukt in vertikaler Position für ein oder zwei Wochen statischer Reifung. Wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei Tage, indem Sie das alte Medium aus dem unteren Septumanschluss absaugen und das Reservoir mit der gleichen Menge frischer Kultur auffüllen. Mittel. Falls gewünscht, entnehmen Sie in den ersten 12 Stunden stündlich und danach alle 24 Stunden bei jedem Medienaustausch einen Milliliter des alten und des frischen Nährmediums für die biochemische Analyse.

Nehmen Sie das Konstrukt unter sterilen Bedingungen aus dem Nährmedium und platzieren Sie es orthogonal in den Weg eines Scanning-Laserinterferometers, um die Dicke des Konstrukts nach ein bis zwei Wochen statischer Reifung zu messen. Übertragen Sie den Bioreaktor in eine Zellkulturhaube und entfernen Sie das Konstrukt vorsichtig von seinem Dorn. Sobald es frei ist, geben Sie es in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern, die 40 Milliliter frisches Kulturmedium enthält.

Richten Sie als Nächstes einen mikromechanischen Tester ein, der mit einer Wägezelle von fünf bis 10 Newton und Griffen ausgestattet ist, die in ein bei 37 Grad Celsius gehaltenes PBS-Bad reichen. Nehmen Sie das Konstrukt aus seiner Petrischale und verbinden Sie es mit speziellen Greifvorrichtungen für Längstests, die so konzipiert sind, dass sie mit dem Gazeteil des Konstrukts verbunden werden, ohne das Gel zu zerquetschen. Verwenden Sie Teflonband, um ein Verrutschen der Greifvorrichtungen während der Prüfung zu verhindern.

Montieren Sie dann das Konstrukt auf den mikromechanischen Tester. Führen Sie anschließend einen Ermüdungstest in Längsrichtung durch, indem Sie das Konstrukt zunächst auf seine ursprüngliche Messlänge dehnen und dort 10 Minuten lang halten. Wenden Sie dann 30 Zyklen mit einer zyklischen Dehnung von 10 % mit einer Geschwindigkeit von 5 % pro Sekunde an.

Erhöhen Sie die Dehnung in inkrementellen Schritten von 10 % zyklischer Dehnung, bis die Probe keine Tests in Umfangsrichtung mehr durchführt. Zuerst wird die Probe in 10 Millimeter lange Ringkonstrukte geschnitten. Montieren Sie dann die Ringe an Edelstahlstangen, die anstelle der Griffe verwendet werden.

Wie bei den Längsrichtungstests dehnen Sie das Konstrukt zunächst auf seine ursprüngliche Messlänge und halten Sie es dort 10 Minuten lang. Wenden Sie anschließend 30 Zyklen mit einer zyklischen Dehnung von 10 % mit einer Geschwindigkeit von 5 % pro Sekunde an. Sobald das Konstrukt ausgereift und von seinem Dorn entfernt wurde, befestigen Sie das Konstrukt an beiden Enden am Reservoir und platzieren Sie es in der Reservoir-Baugruppe.

Wie hier gezeigt. Füllen Sie das Äußere des Reservoirs mit 30 Millilitern Kultur. Mittel. Füllen Sie als Nächstes 75 % des luminalen Volumens des Konstrukts mit einer Mischung aus Proteinen und schließen Sie dann beide Enden des Konstrukts.

Um ein Austreten der Proteinlösung zu vermeiden, stellen Sie den Bioreaktor in einen Inkubator und drehen Sie den Bioreaktor eine Stunde lang bei 4,02 mal 10 auf minus fünf GForce, um die luminale Oberfläche mit Proteinen zu beschichten, während das Lumin beschichtet wird. Entnahme von humanen Nabelvenen- und Tialzellen, die mit Standardtechniken kultiviert wurden, wenn sie zu 90 % konfluent sind. Resus suspendiert die Zellen und ergänzt sie mit M1 99-Kulturmedium. Als nächstes sehen Sie die menschliche Nabelvene und die Urothelzellen in das Lumen des Konstrukts.

Mit einer Dichte von 1000 Zellen pro Quadratzentimeter schließen Sie die oberen Enden des Konstrukts, um ein Auslaufen der Zelllösung zu vermeiden. Inkubieren Sie die Konstrukte, die in der rotierenden Bioreaktorkultur gehostet sind, zwei Tage lang bei einer konstanten Rotation von 4,02 mal 10 zur negativen 5G-Kraft. Während der statischen Reifung der Gefäßkonstrukte verringerte sich der Außendurchmesser der zellulären Aufstiegsstrukturen rapide.

Wie hier gezeigt, verringerte sich der Durchmesser der Konstrukte am ersten Tag der statischen Kultur um 60 % ihres ursprünglichen Wertes. Bis zum siebten Tag hatten sich die Konstrukte um fast 85 % reduziert. Sowohl die longitudinalen als auch die umlaufenden Dehnungszyklen der Konstrukte folgten viskoelastischen Eigenschaften, die für kollagenbasierte Konstrukte typisch sind. Insgesamt waren die Konstrukte in Längsrichtung im Vergleich zur Umfangsrichtung bei gleichem Dehnungsbereich stärker, Massen-Tricon-Färbungen, die an den Endothelkonstrukten durchgeführt wurden, zeigten ein sehr homogenes Endothel.

Glatte Muskelzellen wiesen eine spindelartig geformte Morphologie auf und schienen homogen durch die Wand verteilt zu sein, während die Endothelzellen auf der luminalen Seite gut verteilt erschienen. Nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern in der Biomechanik und regenerativen Medizin den Weg, um das mechanische Verhalten von künstlich hergestellten und nativen Geweben zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie vaskuläre Konstrukte schnell manipuliert werden können und schließlich stark genug werden, um für die mechanische Konditionierung in einem dynamischen Ator gehandhabt und verwendet zu werden. Wir hoffen, dass unsere Bemühungen und Ergebnisse Sie von dem hohen Potenzial der Zellen im Modell der extrazellulären Matrix für die Entwicklung biologisch funktioneller Gewebe überzeugt haben.