Name: Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung zellulärer Kollagengele für die Gefäßgeweberegeneration mittels statischem Bioreaktor und mechanischer Charakterisierung. Diese Methode ermöglicht die schnelle Fabrikation lebender Gefäßkonstrukte mit spezifischen mechanischen Eigenschaften.

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Diese Arbeit wurde von der Natural Science and Engineering Research Council of Canada, der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung und der CHU de Québec Forschungszentrum finanziert.

1. Herstellung und Montage des Static Bioreactor <ol><li> Herstellung der Reservoir <ol><li> Vorbereitung 50 ml Zentrifugenröhrchen als Nährmedium Reservoir für den Bioreaktor. </li><li> Bilden zwei Öffnungen durch Bohren von zwei 5 mm Durchmesser Bohrungen bei 20 mm von dem unteren und dem oberen Ende des Reservoirs verbunden. Dann legen Sie zwei Luer-Armaturen in 5 mm Länge Silikonschläuche. Press-fit diese Luerverbindungen durch die Löcher, und verschließen Sie alle Verbindungen mit medizinischem Silikon kleben. </li><li> Legen Sie eine 0,22 um Filter in die obere Öffnung des Behälters (Abbildung 1A). </li><li> Legen Sie eine Luer-Septum in der unteren Öffnung des Reservoirs (Abbildung 1A). </li></ol></li><li> Dorn-Cap Assembly <ol><li> Bohren Sie ein 4,5 mm Loch in der Mitte des belüfteten Kappe des Reservoirrohr ohne Beschädigung der Filtermembran, die die Belüftungsöffnungen abdeckt. </li><li> Bereiten Sie einen Rührstab (Durchmesser = 4,5 mm, Länge = 100 mm) Als Dorn für das Konstrukt. </li><li> Bereiten Sie zwei Silikon konischen Stopfen (Länge = 10 mm, Mittellochdurchmesser = 4,5 mm). </li><li> Montieren Sie den Dorn und die Kappe (Dorn-cap-Komplex), wie in 1B beschrieben. <ol><li> Press-fit der Dorn in das Loch. Stecken Sie die 2 Stopfen über den Dorn, so dass die Kappe zwischen ihnen. Einstellen der Position des Dorns, so dass seine nutzbare Länge beträgt 78 mm. </li><li> Tragen Sie eine Grundierung und dann medizinischem Silikon Leim auf die Flächen, die vor dem Verbinden der Kappe und dem Silikon konischen Stopfen miteinander in Kontakt sein wird. Entfernen Sie den überschüssigen Kleber auf der Kappe. </li></ol></li><li> Lassen Sie es für 1-3 Tage bei Raumtemperatur trocknen. </li></ol></li><li> Herstellung der Gaze-Griffe <ol><li> Vorbereitung 3 Silikonrohre (Rohr 1: Innendurchmesser = 6,4 mm, Länge = 5 mm; Röhre 2: Durchmesser = 6,4 mm, Länge = 10 mm, und das Rohr 3: Durchmesser = 3,1 mm, Länge = 12 mm). </li><li> Montieren Sie die Gaze-Griffe wie beschreibend in 1C. <ol><li> Cut Rohr 1 in Längsrichtung, und öffnen Sie sie über Rohr 2. Haften Sie sie zusammen mit dem Silikonkleber. </li><li> Schneiden Sie sterilen chirurgischen Gaze bis 5 cm x 7 cm Blatt, und dann rollen dicht die Gaze über das Rohr 3 entlang der längsten Seite der Gaze. Setzen Sie die Röhre 1-Rohr-2-Komplex über die Gaze. </li><li> In Silikonkleber zusammen auf einer Länge von 8 mm bleiben die Gaze, das Rohr 1-Rohr-2-Komplex und das Rohr 3. Schneiden Sie die Gaze. </li></ol></li></ol></li><li> Montage und Sterilisation <ol><li> Montieren Sie den Dorn-cap-Komplex und die Gaze-Griffe wie in Abbildung 2 beschrieben. <ol><li> Mantel der Dorn mit Mittelfett medizinische (2A). Platzieren der Gaze Griffe über den Dorn (2B). Entfernung der Griffe an festen Wert von 35 mm voneinander. </li><li> Bereiten Sie eine röhrenförmige Form, indem das Unterteil einer 10-ml-Spritze mit einer Tischkreissäge (endgültige Länge = 8 mm) ( <strong&gt; 2B). </li></ol></li><li> Legen Sie die Form über die Gaze Griffen ausgestatteten Dorn-Kappenbaugruppe (Gehäuse-Form-Komplex), Einrasten der Form auf dem Silikonstopper (2C). </li><li> Autoklaven dem Behälter und dem Gehäuse-Form komplex. Hinweis: Achten Sie auf die Silikonstopper fest halten Sie beim Einsetzen der Form, um seine Ablösung zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 2. Ingenieur glatte Muskelzelle Collagen Gel-basierte Konstrukte und Static Reifung <ol><li> Engineering Konstrukten <ol><li> Erweitern der Schweineaorta glatte Muskelzellen (pSMCs) in 175 cm 2 Kulturflaschen mit 20 ml vollständigem Kulturmedium, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium gefüllt, das mit 10% (v / v) Schweineserum (PS), 10% (v / v ) fötalem Rinderserum (FBS), 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep). </li><li> Bei ≈90% Konfluenz, trennen pSMCs (Passage 2-4) durch Entfernen des Kulturmediums aus derKolben pSMCs, Zugabe von 5 ml Trypsin-Lösung (1x in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS) und Inkubieren für 10 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit). </li><li> Resuspendieren pSMCs bei einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml in vollständigem Kulturmedium. </li><li> Kollagenlösung herzustellen, wie zuvor beschrieben 10. <ol><li> Zu extrahieren und zu sammeln Kollagenbündel aus Rattenschwanzsehnen in einer PBS-Lösung. </li><li> Übertragen die Kollagenfasern anschließend in Aceton (5 min), 70% Isopropanol (v / v) (5 min) und Essigsäure (0,02 N, 48 h, 4 ° C) Lösungen. </li><li> Mischung der viskosen Lösung und bei -20 ° C für 3 Tage. </li><li> Lyophilisieren der gefrorenen Lösung, um Kollagenschwämme zu erhalten. </li><li> Solubilisierung der Kollagenschwämme in Essigsäure-Lösung (0,02 N) bei einer Konzentration von 4 g / l und die Zentrifuge bei 29.581 g für 45 min Kraft. </li><li> Sterilisieren Sie die Kollagenlösung durch Dialyseverfahren gegen spätere solutions Essigsäure (0,02 N, 1 h), Chloroform 1% (v / v, 1 h) und Essigsäure (0,02 N, sterilen Lösung Wechsel alle 2 Tage für 1 Woche). </li><li> Sammeln Sie die sterile Kollagenlösung (4 g / L) in einem sterilen Zellkultur Kapuze. </li></ol></li><li> Vorbereitung cellularized Kollagengele wie in Abbildung 3 dargestellt. <ol><li> Vorbereitung 50 ml sterile Pufferlösung durch Vermischen von 35 ml DMEM (5x), 4 ml HEPES (1 N), 3 ml NaOH (1 N) in 8 ml sterilem deionisiertem Wasser. </li><li> Vorbereitung der Zellen und Kollagen-Gel-Mischung in einem Behälter, in Eis gestellt, indem 50% (v / v) von sterilen Kollagenlösung (4 g / l Essigsäure 0,02 n) mit 25% (v / v) von Pufferlösung und 25% (v / v) der Aufhängung pSMCs in komplettem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Messung des pH-Werts des Gemisches und sicherzustellen, dass sie zwischen 7,0 und 7,4 ist. </li><li> Pour sanft 9 ml Zellen-and-Kollagen-Mischung in dem oben genannten Gehäuse / Schimmel Komplex (Schritt 1.4.3, 3A-B </strong&gt;). </li><li> Ließ sie bei Raumtemperatur gelieren, für 1 h unter Zellkulturhaube (3B). </li></ol></li><li> Reifung in Static Bioreactor <ol><li> Entfernen Sie die Form (3C) und übertragen Sie sorgfältig das Konstrukt in das Reservoir, mit 35 ml Kulturmedium (3D). </li><li> Inkubieren des Konstruktes (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) in vertikaler Lage für 1 oder 2 Wochen nach der statischen Reifung. </li><li> Installieren Sie einen Web-Kamera im Inkubator vor dem Konstrukt (um Isolierung zu gewährleisten versiegelt). </li><li> Ändern des Kulturmediums alle 2 Tage durch Absaugen des alten Mediums von der Dorn Septumöffnung und Wieder Füllen des Reservoirs mit einer äquivalenten Menge von frischem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Messung der Dicke und Stoffwechselaktivität von SMCs-Kollagen-Gel-basierte Konstrukte Während Static Kultur <ol><li> Legen Sie das Scanning-Laser-Interferometer in die Zelle culture Kapuze und drehen Sie sie von der vertikalen in die horizontale Position mit einer Wasserwaage. </li><li> Übertragen Sie den Bioreaktor in die Zellkultur Kapuze und entfernen Sie das Konstrukt aus dem Reservoir. </li><li> Zu übertragen, die das Konstrukt (immer noch auf dem Dorn montiert) in den Weg des Laserstrahls, und legen es strikt orthogonal zu der Strahlachse (wie in 4 gezeigt). </li><li> Lesen den Wert auf dem Bildschirm des Scanning-Laser-Interferometer dargestellt, entsprechend dem Außendurchmesser des Konstrukts. </li><li> Berechnen der Wanddicke des Konstrukts basierend auf der Außen- und Innendurchmesser (dh der Dorndurchmesser). Hinweis: Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis jede Stunde für die ersten 12 Stunden und dann alle 24 Stunden 2.3.5. </li><li> Verwenden 1 ml des alten Kulturmedium (abgetastet bei einem Wechsel des Kulturmediums, Schritt 2.2.4) zur Messung der Lactat und Glucose-Konzentrationen mit dem Blutgasanalysegerät. </li><li> Verwenden Sie 1 ml derfrisches Kulturmedium als Ausgangsniveau für die Glukose und Laktat-Konzentrationen Messungen 14. Hinweis: Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6 und 2.3.7 alle 2 Tage nach dem Kulturmedium Wechsel. </li></ol></li><li> Baue Ernten für weitere mechanische und biologische Ccharacterizations <ol><li> Nach 1 oder 2 Wochen der statischen Reifezeit, übertragen Sie die statische Bioreaktor in die Zellkultur Kapuze. </li><li> Transfer sanft das reife Konstrukt von seinem Dorn (Supplemental Video 1) auf einen Durchmesser von 100 mm Petrischale mit 40 ml frischem Kulturmedium (Abbildungen 5 und 7A). </li></ol></li></ol> 3. Mechanische Charakterisierung der Konstrukte in der Längs- und Umfangsrichtung <ol><li> Installieren Sie den Versuchsaufbau, bestehend aus mikromechanischen Testgerät mit einem 5 oder 10 N Wägezelle und einem Bad mit PBS bei 37 ° C ausgestattet, um die Proben a haltent Pseudo physiologischen Bedingungen (Abbildung 6). </li><li> Gleichgewicht der Wägezelle und der Dehnungsmesser. Hinweis: Balancing ist ein in den mikromechanischen Tester aus in das Zurücksetzen der angezeigten Erweiterung Wert und die angezeigte Ladewert während keine Probe auf der Maschine montiert integrierte Funktion. Diese Funktion ermöglicht es, welche die Referenz für beide Messungen. </li><li> Montage der Rohr Konstrukte auf den mechanischen Apparat: Längsrichtung. Hinweis: Führen Längsermüdungstests direkt auf die gesamte Rohrkonstrukte. Verwenden Inhouse gebauten Greifvorrichtungen, um die Gaze Griffe der Konstrukte auf die Lastzelle und an die Basis des PBS-Bad verbinden. <ol><li> Montieren Sie die Schlauch bauen auf die Greifvorrichtungen (7B), im Anschluss an die Ernteverfahren (Abschnitt 2.4). </li><li> Wickeln Sie die Greifeinrichtungen und die Gaze Griffe zusammen mit Teflon-Band ein Verrutschen der Gaze Griffe während der Prüfung zu verhindern.Montieren Sie die Probe auf die mikromechanischen Tester (7C). </li></ol></li><li> Montage der ringförmigen Konstrukte auf den mechanischen Apparat: Umfangsrichtung. Hinweis: Führen Umfangsermüdungsprüfungen an Ringproben aus der rohrförmigen Konstrukte geschnitten. Verwenden Sie zwei Edelstahlstäben als Griffe, um die Proben zu halten. <ol><li> Montieren Sie die Schlauch bauen auf ein Kunststoffrohr als ein Träger mit 5 mm Lücken (7B), nach der Ernte (Abschnitt 2.4) markiert. </li><li> Schneiden 10 mm Ringe aus dem röhrenförmigen Konstrukts. </li><li> Messen Sie die Länge der Probe mit einem Messschieber für die weiteren Analysen. </li><li> Montieren Sie die ringförmige Probe auf den Stahlstangen des mikromechanischen Tester (7C) Edelstahl. Stellen Sie sicher, um die Probe in der Mitte der Stäbe zu platzieren. Hinweis: Das Kunststoffrohr in dem Schritt 3.4.1 und einem Schneidsystem, wie in 7B gezeigt, </strOng&gt; werden verwendet, um eine Beschädigung des Konstrukts während des Schneidens zu vermeiden. </li></ol></li><li> Ermüdungstest auf Konstrukte in der Längs- oder Umfangsrichtung. <ol><li> Dehnen Sie das Konstrukt in die Ausgangsmesslänge. </li><li> Pflegen Sie das Konstrukt in dieser Position für 10 Minuten in pseudo-physiologischen Umgebung. </li><li> Übernehmen 10% zyklische Belastung der Anfangsmesslänge (30 Zyklen) mit dem Konstrukt bei 5% / sec Verformungsgeschwindigkeit. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.5.3 an inkrementellen Schritten von 10% zyklische Belastung bis zum Versagen der Probe. Anmerkung: Die Verwendung des Pseudo-physiologischen Umgebung erfordert Berücksichtigung der Auftrieb und die Trägheit des Greifsystem, das die Messung der angelegten Last zu beeinflussen. </li><li> Notieren Sie den Hintergrund, wie folgt: <ol><li> Bewegen Sie den Lastrahmen auf die Anfangsmesslänge. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.5.3 und 3.5.4 ohne Proben angebracht und halten die Greifeinrichtungen an der Lastzelle verbunden ist (nur 1 Zyklus requirot). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Luminal Endothelialisierung Konstrukte Hinweis: Nach dem Anschluss an die Ernte-Protokoll (Abschnitt 2.4), die Konstrukte zu widerstehen, um in der Handhabung der rotierenden Wandbioreaktor für die weitere Endothelialisierung montiert werden. <ol><li> Drehende-Wand Bioreactor Entwurf <ol><li> Bohren Sie ein 4,5 mm Loch in der Mitte des belüfteten Kappe des Reservoirrohr ohne Beschädigung der Filtermembran, die die Belüftungsöffnungen abdeckt. </li><li> Press-fit einen Dorn (Durchmesser = 4,5 mm, Länge = 40 mm) in das Loch und befestigen Sie den Dorn, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie zwei C-förmigen Silikon-Unterstützung für das Konstrukt Außendurchmesser = 14 mm; Innendurchmesser = 8 mm). </li><li> Positionieren einer sich drehenden Motor in einem Ende der rotierenden Wand Bioreaktor und ein Lager am anderen Ende (8B). </li></ol></li><li> Lumen Endothelialisierung <ol><li> Erweitern menschlichen Nabelal Venenendothelzellen (HUVECs) in 25 cm 2 Kulturflaschen mit 5 ml M199-Kulturmedium mit 10% (v / v) PS, 10% ergänzt (v / v) FBS, 1% (v / v) Pen-Strep in Petrischalen im Inneren eines Inkubators (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit), bis 90% Konfluenz. </li><li> Vorbereitung 1,5 ml der Proteinbeschichtungslösung pro Konstrukt für eine optimale Zelladhäsion erforderlich durch Verdünnen des Konzentrats Proteinmischung auf 10,5 ng / ml in serumfreies Kulturmedium von Endothelzellen. </li><li> Messen Sie die Länge des Konstrukts mit einem Messschieber. </li><li> Berechnung der Lumenvolumen V und der luminalen Fläche A des Konstrukts als: V = D in 2 L / 4 und A = D L jeweils (wobei D in der Innendurchmesser entsprechend der Dorndurchmesser ist, und L die Länge des Konstrukts). </li><li> Positionieren Sie das Konstrukt in der Mitte des Behälters nach dem Ernteverfahren (Abschnitt 2.4).Mit C-förmigen Silikonträger um das Konstrukt zu befestigen an beiden Enden mit dem Behälter (8A). </li><li> Füllen Sie den Behälter mit 35 ml Kulturmedium. </li><li> Füllen 75% der berechneten Lumenvolumen des Konstrukts (V) mit dem in Schritt 4.2.2 protein Beschichtungslösung. Schließen beide der Enden des Konstrukts, um jede Leckage des Proteins Beschichtungslösung (8A) zu vermeiden. </li><li> Montieren Sie den rotierenden Wandbioreaktorsystem im Inneren der Zellkultur Kapuze. </li><li> Setzen Sie den Bioreaktor in einem 37 ° C Inkubator und starten Sie die Drehung der Bioreaktor bei 4,02 × 10 -5 g Kraft für 1 Stunde, um die luminale Beschichtung wie in 8B gezeigt, zu ermöglichen. </li><li> Öffnen des oberen Endes des Konstrukts und Aspiration des Proteinbeschichtungslösung aus dem Lumen. </li><li> Lösen HUVECs (Passage 2-3) durch Entfernung des Kulturmediums von den Kolben der HUVECs und Zugabe von 3 ml der Trypsin-Lösung (1x in PBS). ICHncubate für 5 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit). </li><li> Resuspendieren der HUVECs mit einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml in ergänztem M199 Kulturmedium. </li><li> Im Inneren des Zellkulturhaube, Samen HUVECs in das Lumen des Konstrukts mit einer Dichte von 1.000 Zellen / cm 2. 15 schließen die oberen Extremitäten des Konstrukts, um jede Leckage des HUVECs Lösung zu vermeiden. </li><li> Die Konstrukte (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) gehostet in den rotierenden Wandbioreaktor (8B) und die Kultur für 2 Tage Inkubieren bei einer konstanten Drehung des 4,02 x 10 -5 g Kraft. </li><li> Zu ernten, die das Konstrukt nach 2 Tagen Kultur unter sterilen Bedingungen und bereiten sie für die weitere biologische Charakterisierung, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben. </li></ol></li></ol>

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Keine Finanzierung wurde von Organisationen oder Einrichtungen mit potenziellen Interessenkonflikt erhalten.

In der Gemeinschaft der Gefäßgewebe Ingenieure, haben große Anstrengungen getan worden, um die für die mechanische Stabilität der Blutgefäße verantwortlich 16 Tunica media Schicht zu reproduzieren. Seit der Pionierarbeit von Weinberg und Bell 17, Kollagen wurde weithin als Gerüst für die Gefäßgewebezüchtung wegen ihrer Biokompatibilität, nicht-immunogene Eigenschaften und die Verfügbarkeit eingesetzt. Die Verwendung von Kollagen stellt aber eine große Herausforderung für die Forscher, da dieses Material nicht einfach zu handhaben, aufgrund der intrinsischen Mangel an mechanischer Steifigkeit. Manipulationen während der Gerüstvorbereitung können die Gerüste beschädigen, beeinträchtigen sie für die weitere Verwendung. Die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren ermöglicht: i) cellularized Kollagengele in eine röhrenförmige Geometrie zu konstruieren, ii) um biologische Gewebe zu konstruieren stark genug, um nach einer kurzen statischen Reifezeit (1 oder 2 Wochen) behandelt werden, iii) alssess mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften eines solchen rohrförmigen biologischen Geweben in 2 Richtungen. Die Zellen in dem Gel spielen eine Schlüsselrolle in der Kollagenmatrix Umbau. Während der Reifezeit, führte kontraktilen SMCs zur Verdichtung der Gele wodurch ein Konstrukt mit einer höheren mechanischen Stabilität, die in den Längs- und Umfangsrichtung beurteilt werden konnte. Danach ausgesät HUVECs in der luminalen Seite der Konstrukte erzeugt eine homogene und tragfähige Endothel und bewiesen damit die Eignung der Kollagengele für vaskuläre Gewebezüchtung. Die in dieser Arbeit vorgestellten Bioreaktor wurde speziell entwickelt, um eine optimale Umgebung für das Zellwachstum während der statischen Reifung bereitzustellen. Darüber hinaus wurden die für die Charakterisierung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Konstrukte entwickelt Vorrichtungen mit dem Ziel entwickelt, um jeden möglichen Schaden inhärent die Manipulation zu verringernwie empfindliche Materialien. Daher wurde die statische Bioreaktor ein 0,22 um Filter und einer Filtermembran auf der Kappe (Schritt 1.1.2 1A ausgestattet und B), die Gasaustausch zwischen Kulturmedium innerhalb des Behälters und dem Inkubator erlaubt, während eine sterile Kulturumgebung. Die Luer-Septum am Boden wurde als Hafen für Kulturmedium Probenahme und zum Ändern während statische Kultur. Einige wichtige Schritte müssen während Konstrukt Herstellung und Charakterisierung berücksichtigt werden. All die Manipulationen (im Schritt 2.1.1 und in den nachfolgenden Schritten durchgeführt wird), die die Sterilität des Systems nicht beeinträchtigen könnten, wurden in einer sterilen biologischen Abzug durchgeführt. Zellen und Kollagen-Gel Gemischaufbereitung wurde auf Eis, um das Gelieren verzögern behandelt (Schritte 2.1.4 bis 2.1.7). Bei Schritt 2.1.7, alle Luftblasen in der Mischung vor der Gelierung eingeschlossen sind potentielle Spannungskonzentration, die die Bereiche s gefährden könnenRentabilität der Konstrukte. Daher erfordert die Entfernung eines solchen Luftblasen leicht Schütteln der Montage oder Verwendung von Medizin Vakuum für 3 min zur Entgasung unter sterilen Bedingungen. Schließlich wurden die Griffe, die speziell für die Achse des Dorns zentral in der röhrenförmigen Form während der Gelierung zu erhalten und zu ermöglichen, dass empfindliche Manipulation der Konstrukte bei der Ernte (Entfernen des Dorns, Abschnitt 2.4) zur Endothelialisierung ausgebildet und zur Erleichterung der Montage an das mechanische System (Längs Tests). Das vorliegende Protokoll schlägt eine Original einfach zu Prozess alternativer Ansatz der Verstärkung Kollagengelen Konstrukte auf Basis des natürlichen Eigenkontraktionspotential von SMCs. Übliche Techniken von Kollagenmatrices Verstärkung beinhalten die Verwendung von physikalischen und chemischen Vernetzungsmitteln, die schädliche Wirkungen auf die Zellen-Matrix-Interaktionen 18 aufweisen kann - 20. Die Herstellungstechnik in vorgediese Arbeit ermöglicht Leiten Sie diese Zellen getriebenen Umbauprozess, um ein Tissue-Engineering-Konstrukt mit gezielten mechanischen Eigenschaften ohne physikalische oder chemische Behandlung zu erhalten. Charakterisierung von mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften von hydrierten Kollagengelen ist eine große Herausforderung. In dieser Hinsicht ist die vorliegende Protokoll beschreibt eine ursprüngliche einfache und effiziente Methode zur Beurteilung der mechanischen Eigenschaften von Rohrweichteile. Diese Charakterisierung kann nicht nur in Umfangsrichtung, sondern auch in der Längsrichtung direkt auf die gesamte Rohrstruktur durchgeführt werden. Während mechanische Charakterisierung, Temperatur, wässrigen Umgebung, pH und Ionenstärke sind einige der Umweltfaktoren, die bekanntermaßen stark beeinflussen das mechanische Verhalten von biologischem Gewebe 21. Daher ist die vorliegende Arbeit schlägt eine originelle Einrichtung und Protokoll für die mechanische Charakterisierung von biologischen Geweben in einem hochreproduzierbare Pseudo physiologische Umgebung (Kochsalzlösung bei 37 ° C und pH 7,4). Um das Beste aus unserem Wissen, hat diese Art der Charakterisierung nie anderswo gemeldet. Im Ergebnis ist die in dieser Arbeit vorgeschlagene Technik zeigt das hohe Potential der direkten Mischen der Zellen mit Kollagen für Gefäßgewebe-Engineering-Anwendungen. Diese Methode zusammen mit der mechanischen Charakterisierung und Endothelialisierung Prozess bilden Hoch polyvalenten Protokolle. Daher durch leichte Modifikationen der Set-ups und Protokolle, während die gleichen Gründe, Hauptanforderungen für Engineering Gefäßgewebeäquivalenten angegangen werden, wie eine schnelle und unkomplizierte Abwicklung, einschließlich Endothelialisierung, und die Möglichkeit, auf eine Vielzahl von weichen umgesetzt werden Geweben mit verschiedenen Längen und Durchmessern. Weiterhin verschiedenen adhärenten Zelltypen ECM Proteine ​​und Formgeometrien können für eine Anzahl ausgewählter applicati sucht werdenons, wie Engineering Sehnen, Hauttransplantationen, Herz Patches, Nerven, unter anderem. Obwohl die mechanischen Eigenschaften der Konstrukte ermutigend sind, sind sie immer noch geringer als die von nativem Gewebe. In diesem Zusammenhang haben wir davon überzeugt, dass eine sehr kurze statische Reifezeit ist ein entscheidender Schritt in Richtung der dynamischen Anregung in einen Bioreaktor und damit zu einer höheren strukturellen Integrität und mechanische Stabilität führt. Allerdings ist die Möglichkeit, schnell zu produzieren Gewebezüchtung cellularized Kollagenbasis Konstrukte für die mechanische und histologische Analysen ermöglicht die hier beschriebene eine nützliche und vielversprechende Methode, um einen Einblick in das Zusammenspiel zwischen Zellen und ECM während des Wachstums und Umbau, oder sogar bereitzustellen statischen Bioreaktor als Modell für die Therapien und Wirkstoffabgabesysteme verwendet werden.

Gefäßgewebetechnik sieht verschiedene Strategien bei der Herstellung von technischen Fahrzeuge, einschließlich Transplantaten auf Basis synthetischer Gerüste Zellage basierte Gewebezüchtung Blutgefäße (TEBVs) und extrazelluläre Matrix (ECM) Zielkomponenten basierende TEBVs. Unter diesen Ansätzen, synthetische Polymere gute mechanische Eigenschaften, aber einen gemeinsamen Nachteil, da sie keine Bioaktivität 1. Die Zellschicht basierenden Verfahren ermöglicht die Herstellung von technisch Gefäßersatz mit hohen mechanischen Eigenschaften, aber die erforderliche Zeit, um solche Transplantate herzustellen ist ungefähr 28 2 Wochen. Natürliche Biopolymere des ECM, wie Kollagen, Elastin, Fibrin 3 oder einer Kombination davon, bleiben die Goldstandardmaterialien für das Tissue Engineering Scaffolds. Dies ist vor allem aus dem Grund, dass diese Materialien besitzen im allgemeinen eine gute Biokompatibilität während in der Lage, um funktionelle zelluläre Reaktionen 4-5 induzieren. Unter diesen Biopolymers, Kollagen Typ I ist eine der häufigsten und vorherrschende tragende Protein der ECM in vielen Geweben wie Haut, Blutgefäße und Sehnen. Umfangreiche Arbeiten wurden auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagen 6 durchgeführt worden - 8, aber es wurden nur wenige Untersuchungen über zelluläre Umbildung Kollagengele bei statischer Reifung. Cellular Remodeling bezieht sich auf die strukturelle Modifikationen der Kollagenmatrix durch Zellen, die die Stabilität des Kollagen-Fibrillen-Netzwerk 9 beeinflussen könnten induziert. Als natürliches Gerüst können relativ große Mengen an Kollagen Typ I isoliert, sterilisiert und aus verschiedenen Quellen, wie beispielsweise Ratten-Schwanzsehnen 10 gespeichert. Verständnis zellulärer Wechselwirkungen mit Kollagen und die zugehörigen mechanischen Gesamtverhalten der cellularized Kollagenträger (Konstrukte) ist ein wesentlicher Schritt für den Aufbau von Gewebe. Kollagenbasis TEBVs kann durch direktes Mischen Zellen mit Kollagen verarbeitet werdenwährend Gelzubereitung und weiter in spezifische Formen wie rohrförmig und planar 11 geformt. Gefäßzellen in den Gelen vermehren und umgestalten Kollagen Typ I 12. Somit diese Methode umgeht die Notwendigkeit einer besonderen Makroporosität, die eine der wesentlichen Probleme bei der Entwicklung von Scaffolds für das Tissue Engineering-Anwendungen darstellt. Die Hauptnachteile Kollagengelen durch ihre geringe mechanische Eigenschaften jedoch gegenüber synthetischen Materialien 13. In dieser Studie wurde ein lebensfähiges Gewebe mit homogener Verteilung der Zellen, die durch direktes Mischen des Kollagens mit Zellen in einer Ein-Schritt-Verfahren ausgelegt. &quot;Static Bioreaktoren&quot; wurden für die 1 oder 2 Wochen der statischen Reifung der cellularized Kollagengelen verwendet (ohne angelegten externen dynamischen mechanischen Einschränkungen). Während der Kultur, Kollagenmatrixumbau aufgetreten ist, wodurch eine strukturelle Verstärkung an den Konstrukten. Außerdem waren r diese Konstrukteeady auf einer sich drehenden Wand Bioreaktor überführt werden, und ein homogenes Endothel erzielt. Zusätzlich wird in dieser Arbeit eine spezifische mechanische Testprotokoll wird auch vorgeschlagen, einen geeigneten neuen Ansatz bei der Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Rohrweichgewebe bereitzustellen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, ein Verfahren zur in vitro Herstellung und schnelle Reifung vaskulären Geweben, die stark genug ist, um nicht nur für die biologische und mechanische Charakteristiken, sondern auch für weitere mechanische Konditionierung in einem dynamischen Bioreaktor, der als eine zentrale gehandhabt werden sollen Schritt bei der Regeneration von Gewebe.

<table><tbody><tr><td>CellTreat 50 ml Bioreaktionsröhrchen</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229-475</td><td>Zentrifugenröhrchen Luer-Stecker</td></tr><tr><td>mit Sicherungsring x 1/8" Schlauchtülle PP. 25/pk</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-45503-04</td><td>Luer-Anschlüsse für "Gasaustauschanschluss"</td></tr><tr><td>Weiblicher Luer x 1/8" Schlauchtülle Adapter. PP. 25/pk</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-45500-04</td><td>Luer-Anschlüsse für den "Medium-Probenahmeanschluss"</td></tr><tr><td>Masterflex platinvernetzter Silikonschlauch L/S 17,25 ft.</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-17</td><td>Schlauch 1 und 2 für die Mullgreifer</td></tr><tr><td>Masterflex platinvernetzter Silikonschlauch L/S 16,25 ft.</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td>Rohr 3 für die Mullgreifer</td></tr><tr><td>Silastic Medical Haftsilikon, Typ A</td><td>Dow Corning-Silikonkleber</td><td></td> <td>für die Herstellung des statischen Bioreaktors</td></tr><tr><td>Polyvent 4 Gefäßentlüftungsfilter</td><td>Whatman</td><td>6713-0425</td><td>Filter für "Gasaustauschanschluss</td></tr><tr><td>"Stab. PP. Rühren. 8' "</td><td>Scienceware</td><td>377660008</td><td></td></tr><tr><td>Dornstopfen Silikonkautschuk 00 PK12</td><td>VWR</td><td>59590-084</td><td>Stopfen zum Einführen des Dorns in die belüftete Kappe des Zentrifugenröhrchens</td></tr><tr><td>Krytox PFPE/PTFE Fette</td><td>Dupont</td><td>GPL 202</td><td>Medizinisches Fett zum Abdecken des Dorns</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Xiameter RTV-4130-J Basis und Härter</td><td>Dow Corning-C-förmiger</td><td></td> <td>Silikonträger für die Endothelisierung</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Eagle Medium, DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>Gibco (Life Technology)</td><td>11995-065</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Reines Aceton (99%)</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>AP0102</td><td>Chemikalie zur Kollagenextraktion</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol (HPLC-Qualität, 99,9%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC610080040</td><td>Chemikalie für die Kollagenextraktion</td></tr><tr><td>0,02 N Essigsäure (Eisessig, HPLC-Qualität, 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FL070494</td><td>Chemikalie für die Kollagenextraktion</td></tr><tr><td>Chloroformlösung (99%)&nbsp;</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>CR 0179</td><td>Chemikalie für die Kollagenextraktion</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163716</td><td>Chemikalie für die Vorbereitung von Konstrukten</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>SR-0169</td><td>Chemikalie für die Vorbereitung von Konstrukten</td></tr><tr><td>LaserMike 136</td><td>LaserMike</td><td>Serie 183B</td><td>Scanning-Laserinterferometer&nbsp;</td></tr><tr><td>ElectroPulse MicroTester</td><td>Instron</td> <td>Corporation-Mikromechanischer</td> <td>Tester</td></tr><tr><td>HyClone Media M199/EBSS, 500&nbsp; ml</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30253.01</td><td>Bestandteil des Zellkulturmediums</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum HI - 500&nbsp; ml</td><td>Gibco</td><td>SH 30396.03</td><td>Bestandteil des Zellkulturmediums</td></tr><tr><td>Schweineserum (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9783</td><td>Bestandteil des Zellkulturmediums</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomicin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Bestandteil des Zellkulturmediums</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP661-50</td><td>Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben T17CN Vent Cap Red</td><td>Sarstedt Inc.</td><td>83.1812.002</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>ColorpHast- pH-Indikatorstreifen (pH = 6,5-10,0)</td><td>EMD</td><td>9583</td><td>pH-Messungen</td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembran Matrix Wachstumsfaktor reduziert, 5 ml Fläschchen</td><td>BD Biosciences - Discovery Labware</td><td>356230</td><td>Konzentrat-Proteinmischung für den Endothelisierungsprozess</td></tr><tr><td>LifeCam VX-3000</td><td></td><td></td> <td>Microsoft-Dickenmessung</td></tr><tr><td>Biochemischer Analysator, DxC600</td><td>Beckman Coulter Unicell</td> <td>Synchron-Glukose-</td> <td>und Laktatkonzentrationsmessungen</td></tr><tr><td>Kollagenfasern</td><td>Rattenschwänze-Kollagen</td><td></td> <td>wurde im Labor extrahiert</td></tr><tr><td>Schweine glatte Muskelzellen (pSMCs)</td><td>Schweineaorten-pSMCs</td><td></td> <td>wurden im Labor isoliert</td></tr><tr><td>Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs)</td><td>Menschliche Nabelvenen-</td><td> </td><td>HUVECs wurden im Labor isoliert</td></tr></tbody></table>

engineering 3d cellularized kollagengele für gefäßgeweberegeneration

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetische Materialien sind dafür bekannt, klinischen Komplikationen wie Entzündungen, Stenose und Infektionen auslösen, wenn sie als Gefäßersatz implantiert. Collagen wurde ausgiebig für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen aufgrund seiner inhärenten Biokompatibilität verwendet und wird als eine Alternative zu synthetischen Materialien (dh geringe Antigenität, Entzündung und cytotoxischen Antworten). Allerdings haben die begrenzten mechanischen Eigenschaften und die damit verbundene niedrige Hand-Fähigkeit Kollagengelen ihre Verwendung als Gerüstmaterial für die vaskuläre Gewebezüchtung behindert. Daher ist die Logik hinter dieser Arbeit wurde zum ersten Mal cellularized Kollagengelen in eine rohrförmige Geometrie und zweite Ingenieur glatten Muskelzellen verbessern angetrieben Reorganisation der Kollagenmatrix, um Gewebe steif genug, um gehandhabt werden zu erhalten. Die hier beschriebene Strategie beruht auf der direkten Montage von Kollagen und glatten Muskelzellen (Konstrukt) in einem 3D cyli basierendndrical Geometrie mit der Verwendung einer Formtechnik. Dieses Verfahren erfordert eine Reifezeit, während der die Konstrukte sind in einem Bioreaktor unter statischen Bedingungen kultiviert (ohne angewendete äußere Dynamik mechanischer Druck) für 1 oder 2 Wochen. Die &quot;statische Bioreaktor&quot; bietet eine Überwachung und Steuerung sterile Umgebung (pH, Temperatur, Gasaustausch, Nährstoffversorgung und Entsorgung), um den Konstrukten. Während der Kulturperiode wurden Dickemessungen durchgeführt, um die Zellen getriebenen Remodellierung der Kollagenmatrix zu bewerten, und Glukoseverbrauch und Lactatproduktion Raten wurden gemessen, um die Zellen zu überwachen metabolischen Aktivität. Schließlich wurden die mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften für die resultierenden röhrenförmigen Konstrukte bewertet. Hierzu spezifischen Protokollen und einer fokussierten Know-how (Manipulation, Greifen, die in hydratisierter Umgebung usw.) wurden entwickelt, um die das erzeugte Gewebe zu charakterisieren.

Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von technischen Rohr Kollagen-basierten Konstrukten, die Gefäßzellen. Bereits nach 1 Stunde der frühen Gelierung wurde Zellen-and-Kollagen-Mischung direkt in einer 3D-röhrenförmige Geometrie montiert, mit dem Außendurchmesser gleich dem Durchmesser der entsprechenden Form (etwa 14 mm). Entlang statischen Reifung zeigten Messungen der raschen Reduzierung des Außendurchmessers der rohrförmigen cellularized Strukturen, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Der Durchmesser der cellularized Kollagengele von etwa 60% des Ausgangswertes nach dem 1. Tag der statischen Kultur geschrumpft und von fast 85% innerhalb von 7 Tagen (Supplemental Video 2). SMCs innerhalb der Konstrukte für die beobachtete Schrumpfung und die damit verbundene mechanische Verstärkung verantwortlich ist, da dieser Vorgang nicht in nicht-zellularen Kollagenträger auftreten. Man beachte, daß kein Gradient von jeder Art (thermisch, biochemische, mechanischen oder anderen) aufgetragen. Die Zellen-Laufwerkn Verdichtung führte zu einem Material mit höherer Dichte, die Kollagen gehandhabt und gegen mechanische Bitten gedämpft werden könnte (Supplemental Videos 3 und 4). Um die Zellen getriebene Umbau der gesamten mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften beziehen, wurden Ermüdungsprüfungen an den Konstrukten (Supplemental Videos 5 und 6) durchgeführt wird. Diese Versuche bestanden in Radfahren den Konstrukten (30-mal) bei unterschiedlichen konstanten Stämme (10%, 20% und 30% der ursprünglichen Messlänge), und um die Spannung als Antwort der Konstrukte zur mechanischen Aufforderung über die Zeit aufzuzeichnen. Die repräsentativen Ergebnisse Pro Konstrukt werden in 9 gezeigt. Das Konstrukt widerstanden höheren Belastungen in Längsrichtung (75 kPa) als in Umfangsrichtung (16 kPa) bei dem gleichen Dehnungsbereich (30% Dehnung) unterzogen. Inzwischen bei jedem Zyklus der Spannungsspitzenwert für die ta erreichtrgeted maximale Dehnung sank im Laufe der Zeit. Dieses Verhalten ist typisch für die Hoch viskoelastischen Eigenschaften durch diese Kollagen-basierten Konstrukten ausgestellt. Die biologische Aktivität der cellularized Konstrukte wurde bei statischer Reifung beurteilt. Daher wurde die Stoffwechselaktivität der SMCs durch Messung der Glukoseverbrauch und Laktatproduktion während der statischen Kultur ausgewertet. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage und Glukose abgetastet und Laktatkonzentrationen wurden mit Hilfe eines Blutgasanalysegerät gemessen. Die ständige Zunahme der Glukoseverbrauch und Laktatproduktion kombiniert, um die wichtige Schrumpfen der Konstrukte, bezeugen die SMCs Aktivität entlang statische Kultur (Abbildung 10). Die erhöhte mechanische Stabilität aufgrund der Zellgetriebenen Umbau erlaubt die Manipulation der Konstrukte und die anschließende Endothelialisierung Prozess. Trichrom-Färbung nach Masson auf den endothelialisiert Konstrukte durchgeführtzeigte eine sehr homogene Endothel. SMCs zeigte eine spindelartige förmige Morphologie und erschien homogen durch die Wand verteilt sind, während HUVECs erschien in der luminalen Seite (Figur 11) gut verteilt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig1highres.jpg" width="700" /> Abb. 1: Die Komponenten des statischen Bioreaktor Die statische Bioreaktor bestand aus einem modifizierten 50 ml Zentrifugenröhrchen (A) und einem Dorn ausgestatteten Kappe (B). Das Röhrchen diente als Medienspeicher, und mit einem Port für ein 0,22 um-Filter, für den Gasaustausch und einem Septum ausgestattet ist, für die mittlere Abtastung und Wechsel. A in der belüfteten Kappe vorhanden Dorn erlaubt die Herstellung von Konstrukten in Röhrenform. Die Gaze-Griffe (C) wurden entworfen und hergestellt, um die Gelierung der Konstrukte über den Dorn unterstützt. Darüber hinaus sind dieseGriffe erlaubt die Konstrukte nach dem statischen Reifung behandelt werden und auf die mechanische Vorrichtung befestigt werden. Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig2highres.jpg" width="700" /> Figur 2: Montage der statischen Bioreaktor Montagephasen des Bioreaktors vor der Sterilisierung.. Die Gaze-Griffe wurden auf dem Dorn (A) in einem festen Abstand angeordnet. Es wurde eine Form eingelegt (B) und dicht an den Silikonstopfen (C) befestigt ist. Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig3highres.jpg" width="700" /> Fig. 3: Die Herstellung der Konstrukte unter sterilen Bedingungen die Zellen und Kollagen Mischung wurde in das Gehäuse-Form komplexen gegossen<html> (A) und ließ Gel 1 h lang bei Raumtemperatur (B). Danach wurde die Form entfernt (C) wurde die statische Bioreaktors montiert (D) und in einen Vorratsbehälter für das statische Reifung des Konstrukts im Inkubator (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) überführt. Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig4highres.jpg" width="700" /> Fig. 4: Messung der Schichtdicke / Außendurchmesser der Konstrukte A Laser-Scanning-Interferometer verwendet, um die Messung der Außendurchmesser der Konstrukte auszuführen. Das Konstrukt wurde in den Weg des Laserstrahls angeordnet und erzeugt einen Schatten. Die Breite des Schattens entsprechend dem Außendurchmesser des zu konstruieren, wurde dann gemessen, und auf dem Bildschirm angezeigt. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig5highres.jpg" width="500" /> Abb. 5: Die morphologische Erscheinungsbild der geernteten Konstrukt (A) Gleich nach dem Gelieren und (B), nachdem die Zellen getriebene Umbau während statische Reifung für 2 Wochen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6: Versuchsaufbau zur mechanischen Charakterisierung Es bestand der mikromechanischen Testgerät mit 5 oder 10 N Lastzelle und einem Bad, das PBS bei 37 ° C, die Proben in Form von Pseudo-physiologischen Bedingungen zu halten ausgestattet.. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig7highres.jpg" width="700" /> Abbildung 7: Probenvorbereitung f<html> oder mechanische Charakterisierungen. Beispielsernte (A) und Präparat (B) Dauertests in Längsgeführt und Umfangsrichtungen (C). Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig8highres.jpg" width="600" /> Abbildung 8: Drehwand Bioreaktor (A) Die rohrförmigen Konstrukte wurden in die Mitte des Behälters mit Hilfe der c-förmigen Silikon Träger aufgebaut.. Beide Enden des Konstrukts wurden geschlossen, um ein Austreten der Lösung zu vermeiden HUVECs. (B) Die Konstrukte wurden im Inkubator kultiviert (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) in Drehung bei 4,02 x 10 -5 g Kraft für 2 Tage. 2 / 52812fig9highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Abbildung 9:.. Mechanische Charakterisierung Ergebnisse von Ermüdungsprüfungen an Konstrukten in Längsrichtung (A) durchgeführt und Umfangs (B) Richtungen nach Zellgetriebene Umbau <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/52812fig9highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="10" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig10highres.jpg" width="600" /> Abb. 10: Stoffwechselaktivität von SMCs in den Kollagengelen Messungen der Glukoseverbrauch Frequenz und Laktatproduktionsrate wurden mit der Blutgasanalysegerät alle 2 Tage durchgeführt, nachdem das Kulturmedium Wechsel. Frisches Kulturmedium wurde als Basisniveau für die Glukose und Laktat-Konzentrationen Messungen verwendet. Abbildung 11: Lumen Endothelialisierung histologische Bilder der radialen Querschnitte der rohrförmigen Konstrukte.. Masson Trichome Färbung von Rohr Konstrukte kultiviert statisch für 1 Woche (A) und 2 Wochen (B). H &amp; E-Färbung aus einem röhrenförmigen Konstrukt (C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Zeit </td><td> Dicke (mm) </td><td> Verdichtung (%) </td></tr><tr><td> 0 hr </td><td> 4.83 ± 0.02 </td><td> 0 ± 0 </td></tr><tr><td> 2 Stunden </td><td> 4.26 ± 0.02 </td><td> 12 ± 0 </td></tr><tr><td> 4 Stunden </td><td> 4.21 ± 0.03 </td><td> 13 ± 1 </td></tr><tr><td> 6 Stunden </td><td> 4,06 ± 0,10 </td><td> 16 ± 2 </td></tr><tr><td> 12 hr </td><td> 3,16 ± 0,07 </td><td> 35 ± 1 </td></tr><tr><td> 1 Tag </td><td> 2,08 ± 0,11 </td><td> 57 ± 2 </td></tr><tr><td> 1 Woche </td><td> 0,68 ± 0,07 </td><td> 86 ± 1 </td></tr><tr><td> 2 Wochen </td><td> 0,36 ± 0,00 </td><td> 93 ± 0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: schnelle Verdichtung Konstrukt Messers während des statischen Reifung Wandstärke der Konstrukte und die Verdichtungsrate als eine Funktion der Zeit der statischen Kultur.. Verdichtung wurde durch Bestimmung der Außendurchmesser der rohrförmigen Konstrukte mit einem Abtast-Laser-Interferometer (Serie 183B, Lasermike 136) gemessen. Nach 24 Stunden verdichtet die Konstrukte auf 57% ± 2% ihrer Form Dimensionen. Daten sind ausgedrückt als Mittelwert ± SD (n = 3). Das Vorliegen und die Aktivität lebender Zellen der glatten Muskulatur war für solche wesentlichen Änderungen die nur verantwortlich. Supplemental Video. 1: Ernten der nicht umgebaut Rohr Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video 2:. Cells getriebenen Verdichtung des Rohr Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video2.m4v" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video. 3: Manipulation der nicht umgebaut Rohr Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video3.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video. 4: Manipulation der Zellen-Rohr umgebaut Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video4.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um zu sehen th</a>Video ist. Supplemental Video. 5: Längsermüdungstest (bei ​​30%) auf Zellen-Rohr umgebaut Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video5.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video. 6: Umlaufende Ermüdungstest (bei ​​30%) auf Zellen-Rohr umgebaut Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video6.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, röhrenförmige Konstrukte für die Regeneration vaskulären Gewebes zu entwickeln. Dies wird zunächst erreicht, indem Typ-I-Kollagen und glatte Muskelzellen unter Verwendung einer Formgebungstechnik in zylindrischer Geometrie kombiniert werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Konstrukt in einem speziell konzipierten statischen Bioreaktor reifen zu lassen.Anschließend werden die ausgereiften Konstrukte vorsichtig gewonnen und Endothelzellen mithilfe eines rotierenden Wand-Bioreaktors auf dem Lumen des Konstrukts angesiedelt. Abschließend erfolgen histologische Untersuchungen, Stoffwechselanalysen und mechanische Tests zur Bewertung der Eigenschaften dieser röhrenförmigen Konstrukte. Die Originalität dieses Verfahrens liegt darin, dass es nur einen einzigen Schritt benötigt, um Zellen und Kollagen zu kombinieren und so ein gewebetechnisches Konstrukt mit gezielten mechanischen Eigenschaften zu erzeugen, ohne zusätzliche physikalische oder chemische Behandlungen.Außerdem kann das Konstrukt leicht manipuliert werden, dank speziell entworfener Griffe, die deren Handhabung und Endverbindungen ermöglichen. Diese Methode kann Einblicke in das Zusammenspiel zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix während Wachstum und Umbau für die Regeneration vaskulären Gewebes liefern. Zusätzlich kann sie auf eine Reihe gezielter Gewebe angewendet werden, wie Sehnen, Hauttransplantate, Herz-Patches und das Nervensystem.Beginnen Sie mit der Herstellung und Zusammenstellung des statischen Bioreaktors, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, das Details zu Reservoir und Gaze, der Herstellung der Griffe, der Mandrelkappe sowie zur Montage der Gehäuseform und Sterilisationstechniken enthält. Danach vermehren Sie porcine aortale glatte Muskelzellen in einem Gewebekulturfläschchen mit 175 Quadratzentimetern Fläche, bis sie 90 % konfluent sind. Mit standardmäßigen Kultivierungstechniken werden die Zellen geerntet und anschließend in vollständigem Kulturmedium auf eine Dichte von 4 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendiert.Nächster Schritt: Kombinieren Sie eine Portion Pufferlösung, zwei Teile sterile Kollagenlösung mit einer Konzentration von vier Gramm pro Liter und eine Portion Zellsuspension. Messen Sie in dieser Reihenfolge den pH-Wert der Mischung und stellen Sie sicher, dass er zwischen pH 7,0 und 7,4 liegt. Gießen Sie dann die Zell-Kollagen-Mischung vorsichtig in den zusammengesetzten Formhalterkomplex.Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Mischung befinden. Lassen Sie das Kollagengel eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer sterilen Umgebung stehen. Entfernen Sie nach einer Stunde das H&uuml;llrohr und &uuml;berf&uuml;hren Sie den Konstrukt vorsichtig in das Reservoir, das 35 Milliliter vorgew&auml;rmtes Kulturmedium enth&auml;lt.Die Konstrukte für eine oder zwei Wochen in vertikaler Position zur statischen Reifung inkubieren. Wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei Tage, indem Sie das alte Medium über den unteren Septum-Port abgesaugt und das Reservoir mit einer äquivalenten Menge frischem Kulturmedium auffüllen. Falls gewünscht, sammeln Sie bei jedem Mediumwechsel je ein Milliliter des alten und des frischen Kulturmediums zur biochemischen Analyse – zunächst stündlich für die ersten 12 Stunden und danach alle 24 Stunden.Entfernen Sie das Konstrukt unter sterilen Bedingungen aus dem Kulturmedium und platzieren Sie es orthogonal zum Strahlweg eines Scanning-Laser-Interferometers, um die Dicke des Konstrukts nach einer bis zwei Wochen statischer Reifung zu messen. Überführen Sie den Bioreaktor in eine Zellkulturlaminarflow-Werkbank und entfernen Sie das Konstrukt vorsichtig von seinem Mandrel. Sobald es gelöst ist, legen Sie es in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern, die 40 Milliliter frisches Kulturmedium enthält.Als Nächstes richten Sie einen mikromechanischen Prüfstand mit einer Lastzelle von fünf bis 10 Newton und Klemmen ein, die in ein Bad aus PBS bei 37 Grad Celsius hineinragen. Entfernen Sie das Konstrukt aus seiner Petrischale und verbinden Sie es mit speziellen Haltevorrichtungen für Längstests, die so ausgelegt sind, dass sie mit dem Gazeteil des Konstrukts verbunden werden können, ohne das Gel zu beschädigen. Verwenden Sie Teflonband, um ein Verrutschen der Haltevorrichtungen während der Prüfung zu verhindern.Danach den Konstrukt auf den mikromechanischen Prüfer montieren. Anschließend einen Ermüdungstest in Längsrichtung durchführen, indem der Konstrukt zunächst auf seine Anfangsmesslänge gedehnt und 10 Minuten lang in dieser Position gehalten wird. Danach 30 Zyklen einer zyklischen Dehnung von 10 % mit einer Geschwindigkeit von 5 % pro Sekunde anwenden.Erhöhen Sie die Dehnung schrittweise um 10 % zyklische Dehnung, bis die Probe im umfassenden Versuch versagt. Schneiden Sie zunächst die Probe in ringförmige Konstrukte von 10 Millimeter Länge zu. Anschließend montieren Sie die Ringe auf Edelstahlstäben, die anstelle der Spannbacken verwendet werden.Wie bei den Tests in longitudinaler Richtung dehnen Sie zunächst den Konstrukt auf seine Anfangsmesslänge und halten Sie diese 10 Minuten lang ein. Anschließend wenden Sie 30 Zyklen einer zyklischen Dehnung von 10 % mit einer Rate von 5 % pro Sekunde an. Sobald der Konstrukt ausgereift ist und von seinem Dorn entfernt wurde, befestigen Sie den Konstrukt an beiden Enden am Reservoir und platzieren Sie ihn in der Reservoiranordnung.Wie hier gezeigt, füllen Sie das Äußere des Reservoirs mit 30 Milliliter Kulturmedium. Füllen Sie anschließend 75 % des luminalen Volumens des Konstrukts mit einer Mischung aus Proteinen und verschließen Sie beide Enden des Konstrukts.Um ein Austreten der Proteinslösung zu vermeiden, stellen Sie den Bioreaktor in einen Inkubator und rotieren Sie den Bioreaktor eine Stunde lang mit 4,02 × 10⁻⁵ GForce, um die luminalen Oberfläche mit Proteinen zu beschichten, während die Lumen beschichtet werden. Gewinnen Sie humane Nabelvenen- und tiale Zellen, die mit Standardtechniken kultiviert wurden, sobald sie 90 % konfluent sind. Resuspendieren Sie die Zellen in supplementiertem M199-Kulturmedium. Als Nächstes säen Sie humane Nabelvenen- und Urothelzellen in das Lumen des Konstrukts ein.Bei einer Dichte von 1000 Zellen pro Quadratzentimeter die oberen Enden des Konstrukts verschließen, um ein Austreten der Zellsuspension zu vermeiden. Inkubieren Sie die Konstrukte im Rotationswand-Bioreaktor-Kulturverfahren zwei Tage lang bei konstanter Rotation von 4,02 × 10⁻⁵ G-Kraft. Während der statischen Reifung der Gefäßkonstrukte verringerte sich der Außendurchmesser der zellulären Aufwuchsstrukturen rasch.Wie hier gezeigt, verringerte sich der Durchmesser der Konstrukte am ersten Tag der statischen Kultur um 60 % ihres Anfangswerts. Bis zum siebten Tag hatten sich die Konstrukte um fast 85 % verkleinert. Sowohl die longitudinalen als auch die zirkumferentiellen Dehnungszyklen der Konstrukte folgten den viskoelastischen Eigenschaften, die typisch für kollagenbasierte Konstrukte sind. Insgesamt waren die Konstrukte bei gleichem Dehnungsbereich in longitudinaler Richtung stärker als in zirkumferentieller Richtung. Die Masson-Trichrom-Färbung an den endothelialen Konstrukten zeigte ein hochgradig homogenes Endothel.Glattmuskuläre Zellen wiesen eine spindelförmige Morphologie auf und erschienen gleichmäßig in der Wand verteilt, während die Endothelzellen gut auf der luminalen Seite ausgebreitet waren. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf den Gebieten Biomechanik und regenerative Medizin den Weg, um das mechanische Verhalten von gewebekonstruierten und nativen Geweben zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie vaskuläre Konstrukte schnell ma und schließlich stark genug konstruiert werden können, um sie zu handhaben und für die mechanische Belastung in einem dynamischen ator zu verwenden. Wir hoffen, dass unsere Bemühungen und Ergebnisse Sie von dem hohen Potenzial der Zellen in dem Modell der extrazellulären Matrix für die Entwicklung biologisch funktionaler Gewebe überzeugt haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

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Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

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Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe in variablen Größen mit einer angepassten 3D-gedruckten Kunststoff-Formenbau. PDMS-negative sind in der Form 3D-gedruckten geheilt; dann wird Agarose in die ausgehärtete PDMS negative gegossen. Zellen sind in die resultierende Agarose-Brunnen gesät, wo sie ins Gewebe Ringe aggregieren.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Wir schlagen eine Zelle Erweiterung Protokoll über makroporöse Microcarriers und deren Verwendung als Delivery-System in einem Bioreaktor Perfusion eine decellularized Gewebe-Matrix zu säen. Wir gehören auch verschiedene Techniken um Zellproliferation und Lebensfähigkeit der Zellen kultiviert auf Microcarriers zu bestimmen. Darüber hinaus zeigen wir die Funktionalität der Zellen nach Bioreaktor Kulturen.

Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor

Präsentiert wird hier ein einfach zu bedienender, Kern-/Schalen-, dreidimensionaler Bioprinting-Aufbau für die einstufige Fertigung von Hohlgerüsten, geeignet für die Gewebetechnik von Gefäß- und anderen Röhrenstrukturen.

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Konstruierte Klappen erfordern ein integriertes funktionelles Gefäßnetzwerk. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung einer 3D-gedruckten Gewebeklappe vor, die ein hierarchisches Gefäßnetzwerk und seine direkten mikrochirurgischen Anastomosen an der Oberschenkelarterie der Ratte enthält.

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Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

Erfahren Sie die Herstellung zellulärer Kollagengele für die Gefäßgeweberegeneration mittels statischem Bioreaktor und mechanischer Charakterisierung. Diese Methode ermöglicht die schnelle Fabrikation lebender Gefäßkonstrukte mit spezifischen mechanischen Eigenschaften.

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