Name: Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys 2 -His 2 Zink-Finger-Domains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Erfahren Sie die direkte Proteindelivery in Säugerzellen mit zellpermeablen Zink-Finger-Domains. Diese Methode nutzt GFP-Fusionsproteine und Flusszytometrie zur Quantifizierung der Aufnahmeeffizienz.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (DP1CA174426 Carlos F. Barbas) und ShanghaiTech Universität, Shanghai, China (JL) unterstützt. Molekulare Grafiken wurden mit PyMol erzeugt.

1. Klonierung <ol><li> Erhalten Alanin-substituierten Zwei-Finger-ZiF Domänen, die in den pET-28 Expressionsvektorsystem subkloniert haben und sind auf Anfrage erhältlich (pET-2F-ZiF). 34 </li><li> PCR zu amplifizieren EmGFP aus dem Plasmid pBAD-Smaragd mit den Primern 5 &#39;XmaI-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; XmaI Website in fett) und 3&#39;-SacI-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 &#39; ; SacI-Stelle fett gedruckt). <ol><li> Verwenden 5 ng Template-DNA, 10 ul 10x-Polymerasepuffer, 1-Einheiten (U) Taq DNA-Polymerase, 0,2 mM von jedem dNTP und 0,2 &amp; mgr; M von jedem Primer in 100 &amp; mgr; l Lösung mit dem Restvolumen bis destilliertem / deionisiertem Wasser . Verwenden Sie die Zyklusbedingungen: 95 ° C für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 10 min. Ein Reinigen des PCR-Produkts durch Gel extractiauf und bestimmen, DNA-Konzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers Mess Abs 260 x 50 &amp; mgr; g / ml. </li></ol></li><li> Digest pET-2F ZIF und das Insert EmGFP mit den Restriktionsenzymen Xma kodiert I und Sac I in empfohlenen Puffer für 3 h bei 37 ° C unter Verwendung von 10 U Enzym pro 1 ug DNA. Visualisieren DNA durch Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff wie Ethidiumbromid. </li><li> Reinige den verdauten DNA durch Gelextraktionskit und bestimmen, DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer Mess Abs 260 x 50 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Ligation der gereinigten EmGFP kodierenden DNA in 50 bis 100 ng pET-2F-ZiF mit 1 U T4-DNA-Ligase für mindestens 1 h bei RT. Die besten Ergebnisse erzielen, führen Sie die Ligationsreaktion mit einem 6: Einsatz-zu-Vektor-Molverhältnis 1. </li><li> Thaw 50 ul aller chemisch kompetente XL-1 Blue E. coli Zellen auf Eis geben und vorsichtig mischen mit 10-20 ng ligierte pET-2F-ZiF-EmGFP. </li><li> Halten Sie auf Eis für 30 min. Hitzeschock die Mischung bei 42 ° C für 90 sec und erholen sich die Zellen in 2 ml SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Verbreiten Sie 100 ul der Erholung Kultur auf einem LB-Medium (LB) Agar-Platte mit 50 ug / ml Kanamycin und Inkubation O / N bei 37 ° C. </li><li> Am folgenden Tag inokulieren 6 ml Super Broth (SB) oder LB-Kultur, die 50 ug / ml Kanamycin mit einer Kolonie von der LB-Agar-Platte und Kultur O / N bei 37 ° C. Hinweis: Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer 5 &#39;XmaI-EmGFP und 3&#39;-SacI-EmGFP könnte verwendet werden, um positive Klone zu identifizieren, bevor Miniprep werden. </li><li> Reinige pET-2F ZIF-EmGFP durch Miniprep und Plasmid bestätigt durch DNA-Sequenzierung mit T7-Promotors (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;). </li></ol> 2. Expression und Reinigung <ol><li> Auftauen 50 ul chemisch kompetente BL21 E. coli-Zellen auf Eis geben und vorsichtig mischen mit 100 ng pET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transform wie in Schritten von 1,7 bis 1,8 beschrieben. </li><li> Am folgenden Tag impfen 10 ml LB-Medium, das 50 ug / ml Kanamycin mit einer Einzelkolonie und wachsen O / N bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Am folgenden Tag, verdünnt den 10 ml des O / N-Kultur in 1 l LB-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin, 0,2% Glucose und 100 &amp; mgr; M ZnCl 2 ergänzt. Die Kultur bei 37 ° C unter Schütteln bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,8 und induzieren Proteinexpression mit 2 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Nach 6 Stunden Wachstum bei 37 ° C, Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Anmerkung: Induktionsbedingungen sind sehr variabel und hängt von der Stabilität der Proteine ​​exprimiert. Überwachen der OD 600 alle 30 Minuten, bis eine OD 600 von 0,8 erreicht wird. </li><li> Zellpellet in 5 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 &amp; mgr; M ZnCl 2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM MgCl 2, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 10 mM Imidazol, pH 8,0). Lyse der Zellen auf Eis durch Ultraschallbehandlung mit folgender Einstellung: 50% der Leistung, 4 min Prozesszeit mit 5 s an / 10 sec aus Intervallen. Vermeiden Sie eine Überhitzung der Lösung. </li><li> Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 25.000 · g für 30 min bei 4 ° C und den Überstand in ein frisches Collection Tube. Die besten Ergebnisse erzielen, führen Sie alle folgenden Schritte bei 4 ° C. </li><li> Führen des Überstandes durch eine Säule mit 1 ml äquilibriert Ni-NTA Aufschlämmung vorverpackt. Mit 20 ml Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 &amp; mgr; M ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 und 30 mM Imidazol, pH 8,0) Waschen des Harzes. </li><li> Eluieren des Proteins mit 5 ml Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 &amp; mgr; M ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 und 300 mM Imidazol, pH 8,0). </li><li> Buffer tauschen die eluierte Protein mit Speicherpuffer (50 mMTris-HCl, 500 mM NaCl, 100 &amp; mgr; M ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 und 10% Glycerin, pH 8,0) und konzentriere das Protein zu mindestens 40 um unter Verwendung einer Spin-Konzentrator durch Zentrifugation gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bestimmen der Proteinkonzentration von BCA oder Bradford-Test. Mix 2 ul gereinigte Proteine ​​mit 2 &amp; mgr; l 2 × SDS-PAGE-Ladepuffer, Kochen bei 95 ° C für 10 min und dann auf 4% zu lösen -20% Tris-Glycin-SDS-PAGE, um die Proteinreinheit (2) zu bewerten. </li></ol> 3. Protein Lagerung <ol><li> Aliquot des konzentrierten Protein, Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Für EmGFP Fusionsproteine ​​umfassen das Röhrchen mit Aluminiumfolie, um das Protein vor Licht zu schützen. </li><li> Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proteinlösung. Hinweis: ZiF-Fusionsproteine ​​sind für mindestens 1 Monat unter diesen Bedingungen stabil. Brachte oder&gt; 4 Monate Lagerung führen kannum Proteinfällung oder Bleichen von EmGFP. </li></ol> 4. Protein Transduction <ol><li> Pflegen HeLa-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum-Antimykotikum bei 37 ° C in einer vollständig befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. Anmerkung: Die Zellen passagiert mehr als 30 Mal werden für Proteintransduktionsdomäne empfohlen. </li><li> Vorbeschichtung eine Platte mit 24 Vertiefungen mit 500 ul von 50 ug / ml poly-Lysin für 30 bis 60 min bei 25 ° C. Saatgutzellen auf eine Platte mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung. Bei 24 Stunden nach dem Aussäen oder einmal Zellen zwischen 80% -90% konfluent, entfernen Medien aus jeder Vertiefung und Waschen mit 500 ul vorgewärmtem serumfreiem DMEM (SFM). </li><li> Zu jeder Vertiefung, fügen Sie 250 ul SFM mit 2 uM ZiF-EmGFP Protein und 100 uM ZnCl 2. Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde. Hinweis: ZiF Domains in die Zellen primarily durch Makropinozytose, 34, die eine energieabhängige Mechanismus ist. Daher müssen die Zellen bei 37 ° C für eine effiziente Protein Internalisierung inkubiert werden. </li><li> Entfernen Medien von Zellen, und dreimal mit 500 ul calcium- und magnesiumfreien Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) mit 0.5 mg / ml Heparin ergänzt. Hinweis: Heparin ist notwendig, um oberflächengebundene Protein, das Downstream-Analysen erschweren könnten, zu entfernen. </li><li> (Optional) Wiederholen Sie die Behandlung bis zu dreimal für erhöhte Auslieferung. </li><li> Isolieren behandelten Zellen unmittelbar nach Heparin Wasch durch Verdau mit 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 2 min. Resuspendieren abgelösten Zellen in 0,5 ml DPBS mit 1% FBS ergänzt. </li><li> Messen der Fluoreszenzintensität jeder Probe durch Flusszytometrie 35 mit der Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Kanal (Abbildung 3). Stellen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC), die Bevölkerung zu platzierenInteresse auf der Skala, um sicherzustellen, dass Populationen mit unterschiedlichen Eigenschaften voneinander gelöst. </li><li> Sammle 10.000 Live-Veranstaltungen für jede Probe und die Daten mit Hilfe der Durchflusszytometrie Datenanalyse-Software. 36 Normalisieren Fluoreszenz von HeLa-Zellen mit ZiF-EmGFP auf diese Zellen nur mit SFM behandelten analysieren. </li></ol>

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<li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Aart%2C+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide%2C+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für Proteinabgabe mit zellpermeablen Zinkfinger (ZIF) Domänen dargestellt. Das ZiF Domain nicht senken die Aktivität verschmolzen enzymatische Fracht 34; erlaubt die Herstellung und Reinigung von Proteinen in Ausbeuten fast identisch mit denen mit unmodifizierten Protein beobachtet; und kann Proteine ​​und Enzyme mit Wirkungsgraden, die traditionelle zellpenetrierenden Peptid oder Proteintransduktionsdomäne Systeme übersteigen, in einer Vielzahl von Zelltypen zu tra...

Hoch effizient und vielseitig Protein Lieferstrategien sind entscheidend für viele der Grundlagenforschung und therapeutische Anwendungen. Die direkte Lieferung von gereinigten Proteinen in Zellen ist eine der sichersten und einfachsten Methoden, um dies zu erreichen. Im Gegensatz zu 1,2-Strategien, die auf die Genexpression von Nukleinsäuren beruhen, stellt 3-5 Protein Liefer kein Risiko einer Insertionsmutagenese, ist unabhängig von der zelluläre Transkriptions / Translations-Maschinen und ermöglicht eine sofortige Wirkung. Jedoch das Fehlen einfacher und verallgemeinerbar Methoden auszustatten zellpenetrierenden Aktivität an Proteine ​​routine confounds ihrer direkten Eintritt in die Zellen. Aktuelle Verfahren zur Erleichterung der intrazellulären Proteinabgabe auf der Verwendung von natürlich vorkommenden oder 6-8 ausgebildet zellpenetrierenden Peptide 9-12 aufgeladenen Transduktion Domänen 13,14 Nanopartikel 15 und Liposomen, 16 virusähnlichen Partikeln 17,18 basierend </sup&gt; und polymere Mikromaterialien. 19. Leider sind viele dieser Ansätze zeichnen sich durch geringe zelluläre Aufnahme Tarife, 20,21 schlechte Stabilität, 22 unbeabsichtigte Zelltyp-Spezifität, 23 Low endosomalen Flucht Objekte 24 und 25 neben Toxizität. behindert, viele Protein Übertragungstechnologien reduzieren die Bioaktivität der Proteine ​​geliefert. 14 In unserem Labor wurde gezeigt, dass Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Proteine ​​- chimären Restriktionsendonukleasen aus einem programmierbaren Cys 2 -His 2 Zinkfinger-DNA-Bindungsprotein und die Spaltdomäne des FokI Restriktionsendonuklease 26-28 - inhärent zell- durchlässig. Es wurde gezeigt, 29 Diese überraschende zellpenetrierenden Aktivität eine intrinsische Eigenschaft des kundenspezifischen Zinkfinger-Domäne, einer DNA-bindenden Plattform, die als ein leistungsfähiges Werkzeug für die gezielte Genom en hervorgegangen sein,Engineering, 30-32 und als das Ergebnis der Konstellation von sechs positiv geladene Reste auf der Proteinoberfläche sein. Tatsächlich haben mehrere DNA-bindenden Proteinen, einschließlich c-Jun und N-DEK wurde gezeigt, dass eine angeborene Fähigkeit, Zellmembranen zu durchqueren besitzen. 33 In jüngerer Zeit haben unser Labor auf diese Ergebnisse und zeigten, dass die Zellen eindringende Aktivität zink- Finger (ZiF) Domains können für den intrazellulären Proteintransport genutzt werden. Genetische Fusion von entweder einem oder zwei Finger ZiF Domänen an spezifische Proteinfracht, ergab einen Wirkungsgrad, die viele herkömmliche zellpenetrierende Peptid Abgabesysteme überschritten Aufnahme. 34 Vor allem ZiF-vermittelte Abgabe nicht beeinträchtigen die Aktivität des fusionierten enzymatische Ladung und erleichtert hohe cytosolische Lieferung. Zusammen zeigen diese Ergebnisse zeigen das Potenzial der ZiF Domäne zur Erleichterung der effizienten und einfachen Verabreichung von Proteinen und möglicherweise mehrere verschiedene Arten von MakroMoleküle, in Zellen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Implementierung ZiF Technologie für Proteintransport in Säugerzellen präsentiert. Wir zuvor konstruierten eine Reihe von ein-, zwei-, drei-, vier-, fünf- und sechs Finger ZiF Domänen, die die Fähigkeit zur Bindung von DNA, durch Substitution von jeder der α-helicalen DNA-bindenden Reste fehlen, aber fähig sind, liefert Proteine ​​in Zellen 34 (Abbildung 1). Die Herstellung und die Transduktion von Smaragd GFP (EmGFP) in HeLa-Zellen unter Verwendung eines Zwei-Finger-Domäne ZiF beschrieben. Dieses Protokoll ist erweiterbar, um fast jedes Protein in der Lage, lösliche Expression in Escherichia coli und fast jedem Säugerzelltyp. Erwartete Ergebnisse werden bereitgestellt und Strategien für die Maximierung der Leistung des Systems ausgelegt werden ebenfalls diskutiert.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR System</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycin Mini-Proteingele, 1,5 mm, 10 Wells</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Probenpuffer</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Kompetent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Zinkchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroseharz</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparansulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000 Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

direkter protein lieferung säugerzellen mit zellpermeable cys<sub&gt; 2</sub&gt; -his<sub&gt; 2</sub&gt; zink-finger-domains

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Aufgrund ihrer Modularität und der Fähigkeit, umprogrammiert zu werden, um eine breite Palette von DNA-Sequenzen zu erkennen, haben sich Cys2-His 2 Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen als nützliche Werkzeuge für gezieltes Genom-Engineering erwiesen. Wie viele andere DNA-bindende Proteine besitzen auch Zinkfinger die angeborene Fähigkeit, Zellmembranen zu durchqueren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese intrinsische Zellpermeabilität für die intrazelluläre Proteinverabreichung genutzt werden kann. Die genetische Fusion von Zinkfinger-Motiven führt zu einem effizienten Transport von Protein- und Enzymfracht in ein breites Spektrum von Säugetierzelltypen. Im Gegensatz zu anderen Proteintransduktionstechnologien hemmt die Verabreichung über Zinkfingerdomänen die Enzymaktivität nicht und führt zu einem hohen Maß an zytosolischer Verabreichung. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Implementierung der Zinkfinger-Technologie für den Proteintransport in Säugetierzellen vorgestellt. Die wichtigsten Schritte zum Erreichen eines hohen Niveaus an intrazellulärer Zink-Finger-vermittelter Abgabe werden hervorgehoben und Strategien zur Maximierung der Leistung dieses Systems werden diskutiert.

Zwei-Finger-ZiF-EmGFP Fusionsproteine ​​in E. ausgedrückt werden coli mit&gt; 95% Homogenität und hoher Ausbeute (&gt; 25 mg / ml) (Abbildung 2). Im allgemeinen Ein- und Zwei-Finger kann in Mengen nahezu identisch mit denen des Wildtyp-unmodifizierte Protein ZiF Fusionsproteine ​​hergestellt werden. Jedoch in einigen Kontexten sind fünf- und sechs Finger ZiF Fusionsproteine ​​nicht in Ausbeuten hoch genug für nachfolgende Anwendungen hergestellt werden. Dir...

Zinkfingerdomänen sind eigen zellpermeablen und fähig zur Vermittlung Proteinabgabe in einem weiten Bereich von Säugetierzelltypen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung Zinkfinger-Technologie für die intrazelluläre Proteinabgabe dargestellt.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie man Zinkfinger-Domänen verwendet, um funktionelle Proteine wie das grüne fluoreszierende Protein in Säugetierzellen einzuschleusen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Expressionsplasmid erzeugt wird, das das emeraldgrüne fluoreszierende Protein MGFP enthält, das translationsmäßig mit Zinkfinger-Domänen verknüpft ist. Der zweite Schritt besteht darin, das fluoreszierende Fusionsprotein in Bakterien zu exprimieren.Anschließend werden die bakteriellen Zellen lysiert und das fluoreszierende Fusionsprotein gereinigt. Im letzten Schritt werden Säugerzellen mit dem gereinigten fluoreszierenden Fusionsprotein inkubiert, um dessen Aufnahme zu ermöglichen. Schließlich kann die Fluoreszenz der behandelten Zellen mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden, um die Effizienz der Fusionsproteinaufnahme in die Zellen zu bestimmen.Der Hauptvorteil von Thief oder anderen Proteintransduktionsdomänen wie dem aus HIV stammenden TAT-Peptid oder Polyarginin besteht darin, dass sie eine hohe cytosolische Abgabe ermöglichen, ohne die Aktivität des enzymatischen Frachtmoleküls zu beeinträchtigen. Beginnen Sie mit der PCR, indem Sie die Emerald-GFP- oder MGFP-Sequenz aus einem Plasmid gemäß dem Textprotokoll amplifizieren, das PCR-Produkt mithilfe eines Gel-Extraktionskits reinigen und anschließend die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer quantifizieren. Danach beschaffen Sie sich einen PET-28-Expressionsvektor, der die Sequenz von Alanin enthält.Substituieren Sie zwei Finger, Zinkfinger oder zwei FZ-Domänen, das Spaltvektor und das MG F-P-P-C-R-Produkt mit den Restriktionsenzymen XMA und SAC unter Verwendung von 10 Einheiten Enzym pro Mikrogramm DNA und inkubieren Sie die Verdauungsansätze drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Reinigen Sie die DNA-Fragmente durch Gelextraktion und bestimmen Sie die Konzentrationen des Vektors und des MG F-P-P-C-R-Produkts. Kombinieren Sie mithilfe eines Spektrophotometers das MG F-P-P-C-R-Produkt und 50 bis 100 Nanogramm des Vektors in einem einzigen Reaktionsgefäß im molaren Verhältnis von sechs Teilen Insert zu einem Teil Vektor.Dann eine Einheit T4-DNA-Ligase hinzufügen und die Reaktion eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um Bakterien mit dem ligierten Plasmid zu transformieren. Ein 50-Mikroliter-Aliquot chemisch kompetenter *E. coli*-Zellen auf Eis auftauen. Anschließend die Zellen vorsichtig mit 100 bis 20 Nanogramm der ligierten DNA mischen und die Zellen mit der DNA 30 Minuten auf Eis inkubieren.Nach der Inkubation die Zellen für 90 Sekunden bei 42 Grad Celsius hitzebehandeln. Zwei Milliliter SOC-Medium zum Röhrchen hinzufügen und die Zellen eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter Schütteln regenerieren lassen, um Transformanten auszuwählen. 100 Mikroliter der Kultur auf LB-Agarplatten, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Canamycin enthalten, auftragen und die Platten am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.Inokulieren Sie eine sechs Milliliter große Kultur von LB, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthält, mit einer isolierten Kolonie von der Übernachtkulturplatte. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am nächsten Tag sammeln und führen Sie eine Minipräparation der Zellen durch, um das Plasmid zu isolieren, und bestätigen Sie anschließend das Plasmid durch Sequenzierung mit dem Primer.Für den T7-Promotor sollte das Plasmid eine N-terminale translationsmäßige Fusion der beiden FZ-Domänen mit MGFP enthalten. Um die Proteinreinigung zu beginnen, transformieren Sie zunächst BL21-Equalize-Zellen mit 100 Nanogramm des gereinigten Plasmids.Am nächsten Tag Transformanten auf LB-Agar mit Kanamycin auswählen, eine 10-Milliliter-Kultur aus LB-Medium mit Kanamycin mit einer einzelnen Kolonie von der Übernachtkultur beimpfen und die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren, die gesamte Übernachtkultur in einen Liter LB-Medium, ergänzt mit Kanamycin, 0,2 % Glukose und 100 Mikromolar Zinkchlorid, verdünnen. Die Kultur bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,8 erreicht ist, dann IPTG auf eine Endkonzentration von zwei Millimolar hinzufügen, um die Expression zu induzieren. Nach sechs Stunden Induktion die Kultur bei 5.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um die Zellen zu gewinnen.Suspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Lysepuffer und lysieren Sie die Zellen dann auf Eis durch Sonikation mit 50 % Leistung und einem Zyklus von fünf Sekunden an und zehn Sekunden aus für insgesamt vier Minuten. Zentrifugieren Sie danach das Zelllysat bei 25.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen Sie anschließend das Überstand in ein neues Sammelröhrchen auf Eis. Um das Protein zu reinigen, geben Sie den Überstand auf eine Säule, die zuvor mit einem Milliliter Nickel-Nitrilotriessigsäure-Schlamm vorgefüllt wurde.Nachdem das Überstand durch die Säule geleitet wurde, wird das Harz mit 20 Milliliter Waschpuffer gewaschen. Das Protein wird mit fünf Milliliter Elutionspuffer von der Säule eluiert und anschließend in Dialysefolie überführt. Nach der Dialyse über Nacht wird das Protein in Speicherpuffer dialysiert. Mithilfe eines Spin-Konzentrators wird das Protein durch Zentrifugation mit 3000×g für eine Stunde auf mindestens 40 Mikromolar konzentriert.Bestimmen Sie die Protein-Konzentration und -Reinheit, wie im Textprotokoll für die Lagerung angegeben. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter des Proteins in 1,5-Milliliter-Falztuben und decken Sie die Tube mit Aluminiumfolie ab, um MGFP-Fusionsproteine vor Photobleichen zu schützen. Anschließend schockgefrieren Sie das Protein in flüssigem Stickstoff und lagern es bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie die Proteintransduktion vor, indem Sie zuerst die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit 500 Mikrolitern einer Lösung von 50 Mikrogramm pro Milliliter präkonditionieren.Polylysin für 30 bis 60 Minuten bei 25 Grad Celsius. Die Lösung aus den Vertiefungen absaugen, bevor die Zellkultur ausgesät wird. Zellen in DMM mit 10 % FBS und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid kultivieren.Die Zellen gewinnen und sie in eine 24-Loch-Platte mit einer Dichte von 200.000 Zellen pro Loch ansäen. Anschließend die 24-Loch-Platte nach etwa 24 Stunden Inkubation in den Inkubator stellen, wenn die Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind. Das Medium von jedem Loch abziehen und die Zellen mit 500 µL vorgewärmtem serumfreiem Medium oder SFM waschen.Fügen Sie 250 Mikroliter SFM, das zwei Mikromolar Z-M-G-F-P-Protein und 100 Mikromolar Zinkchlorid enthält, zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Danach aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen und waschen die Zellen dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern kalzium- und magnesiumfreier docosphosphatgepufferter Salzlösung, bekannt als DPBS, die mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Heparin ergänzt ist. Fügen Sie danach 200 Mikroliter 0,05 % Trisphin-EDTA zu den Brunnen hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen von der Platte zu lösen.Überführen Sie die abgelösten Zellen in ein neues Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang mit 300 × g. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 500 Milliliter DPBS, ergänzt mit 1 % FBS, und messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität der Probe mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des fite-Kanals, wie zuvor beschrieben. Stellen Sie den Forward- und Side-Scatter so ein, dass die Population von Interesse im geeigneten Messbereich liegt.Verwenden Sie anschließend definierte Gating-Strategien, um die Kontroll- und Testproben zu analysieren. Sammeln Sie jeweils 10.000 lebende Ventrikulärzellen pro Probe und verarbeiten Sie die Daten mit der Durchflusszytometrie-Analysesoftware. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität der mit Protein behandelten Zellen anhand der mit Kontrollserum behandelten Zellen.Zif-MGFP-Fusionsproteine wurden in E. coli hergestellt, gereinigt und mittels SDS-PAGE analysiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das ZIF-MG-FP-Fusionsprotein mit einer Homogenität von über 95 % gereinigt wurde. Als HELO-Zellen mit steigenden Konzentrationen des ZIFF-MG-FP-Fusionsproteins behandelt wurden.Sie zeigten eine dosisabhängige Zunahme der mittleren Fluoreszenzintensität, gemessen mittels Durchflusszytometrie. Aufeinanderfolgende Behandlungen mit dem Z-MG-FP-Fusionsprotein in einer Konzentration von zwei Mikromolar führten zu nahezu 100 % der Zellen mit MGFP-Fluoreszenz. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Translokationsdomänen des Thiefs-Proteins nutzen kann, um funktionelle Proteine in meine Zellen zu befördern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

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Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

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Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

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Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys

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