Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie man Zinkfinger-Domänen verwendet, um funktionelle Proteine wie das grüne fluoreszierende Protein in Säugetierzellen einzuschleusen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Expressionsplasmid erzeugt wird, das das emeraldgrüne fluoreszierende Protein MGFP enthält, das translationsmäßig mit Zinkfinger-Domänen verknüpft ist. Der zweite Schritt besteht darin, das fluoreszierende Fusionsprotein in Bakterien zu exprimieren.

Anschließend werden die bakteriellen Zellen lysiert und das fluoreszierende Fusionsprotein gereinigt. Im letzten Schritt werden Säugerzellen mit dem gereinigten fluoreszierenden Fusionsprotein inkubiert, um dessen Aufnahme zu ermöglichen. Schließlich kann die Fluoreszenz der behandelten Zellen mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden, um die Effizienz der Fusionsproteinaufnahme in die Zellen zu bestimmen.

Der Hauptvorteil von Thief oder anderen Proteintransduktionsdomänen wie dem aus HIV stammenden TAT-Peptid oder Polyarginin besteht darin, dass sie eine hohe cytosolische Abgabe ermöglichen, ohne die Aktivität des enzymatischen Frachtmoleküls zu beeinträchtigen. Beginnen Sie mit der PCR, indem Sie die Emerald-GFP- oder MGFP-Sequenz aus einem Plasmid gemäß dem Textprotokoll amplifizieren, das PCR-Produkt mithilfe eines Gel-Extraktionskits reinigen und anschließend die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer quantifizieren. Danach beschaffen Sie sich einen PET-28-Expressionsvektor, der die Sequenz von Alanin enthält.

Substituieren Sie zwei Finger, Zinkfinger oder zwei FZ-Domänen, das Spaltvektor und das MG F-P-P-C-R-Produkt mit den Restriktionsenzymen XMA und SAC unter Verwendung von 10 Einheiten Enzym pro Mikrogramm DNA und inkubieren Sie die Verdauungsansätze drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Reinigen Sie die DNA-Fragmente durch Gelextraktion und bestimmen Sie die Konzentrationen des Vektors und des MG F-P-P-C-R-Produkts. Kombinieren Sie mithilfe eines Spektrophotometers das MG F-P-P-C-R-Produkt und 50 bis 100 Nanogramm des Vektors in einem einzigen Reaktionsgefäß im molaren Verhältnis von sechs Teilen Insert zu einem Teil Vektor.

Dann eine Einheit T4-DNA-Ligase hinzufügen und die Reaktion eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um Bakterien mit dem ligierten Plasmid zu transformieren. Ein 50-Mikroliter-Aliquot chemisch kompetenter *E. coli*-Zellen auf Eis auftauen. Anschließend die Zellen vorsichtig mit 100 bis 20 Nanogramm der ligierten DNA mischen und die Zellen mit der DNA 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Nach der Inkubation die Zellen für 90 Sekunden bei 42 Grad Celsius hitzebehandeln. Zwei Milliliter SOC-Medium zum Röhrchen hinzufügen und die Zellen eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter Schütteln regenerieren lassen, um Transformanten auszuwählen. 100 Mikroliter der Kultur auf LB-Agarplatten, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Canamycin enthalten, auftragen und die Platten am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Inokulieren Sie eine sechs Milliliter große Kultur von LB, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthält, mit einer isolierten Kolonie von der Übernachtkulturplatte. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am nächsten Tag sammeln und führen Sie eine Minipräparation der Zellen durch, um das Plasmid zu isolieren, und bestätigen Sie anschließend das Plasmid durch Sequenzierung mit dem Primer.

Für den T7-Promotor sollte das Plasmid eine N-terminale translationsmäßige Fusion der beiden FZ-Domänen mit MGFP enthalten. Um die Proteinreinigung zu beginnen, transformieren Sie zunächst BL21-Equalize-Zellen mit 100 Nanogramm des gereinigten Plasmids.

Am nächsten Tag Transformanten auf LB-Agar mit Kanamycin auswählen, eine 10-Milliliter-Kultur aus LB-Medium mit Kanamycin mit einer einzelnen Kolonie von der Übernachtkultur beimpfen und die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren, die gesamte Übernachtkultur in einen Liter LB-Medium, ergänzt mit Kanamycin, 0,2 % Glukose und 100 Mikromolar Zinkchlorid, verdünnen. Die Kultur bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,8 erreicht ist, dann IPTG auf eine Endkonzentration von zwei Millimolar hinzufügen, um die Expression zu induzieren. Nach sechs Stunden Induktion die Kultur bei 5.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um die Zellen zu gewinnen.

Suspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Lysepuffer und lysieren Sie die Zellen dann auf Eis durch Sonikation mit 50 % Leistung und einem Zyklus von fünf Sekunden an und zehn Sekunden aus für insgesamt vier Minuten. Zentrifugieren Sie danach das Zelllysat bei 25.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen Sie anschließend das Überstand in ein neues Sammelröhrchen auf Eis. Um das Protein zu reinigen, geben Sie den Überstand auf eine Säule, die zuvor mit einem Milliliter Nickel-Nitrilotriessigsäure-Schlamm vorgefüllt wurde.

Nachdem das Überstand durch die Säule geleitet wurde, wird das Harz mit 20 Milliliter Waschpuffer gewaschen. Das Protein wird mit fünf Milliliter Elutionspuffer von der Säule eluiert und anschließend in Dialysefolie überführt. Nach der Dialyse über Nacht wird das Protein in Speicherpuffer dialysiert. Mithilfe eines Spin-Konzentrators wird das Protein durch Zentrifugation mit 3000×g für eine Stunde auf mindestens 40 Mikromolar konzentriert.

Bestimmen Sie die Protein-Konzentration und -Reinheit, wie im Textprotokoll für die Lagerung angegeben. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter des Proteins in 1,5-Milliliter-Falztuben und decken Sie die Tube mit Aluminiumfolie ab, um MGFP-Fusionsproteine vor Photobleichen zu schützen. Anschließend schockgefrieren Sie das Protein in flüssigem Stickstoff und lagern es bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie die Proteintransduktion vor, indem Sie zuerst die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit 500 Mikrolitern einer Lösung von 50 Mikrogramm pro Milliliter präkonditionieren.

Polylysin für 30 bis 60 Minuten bei 25 Grad Celsius. Die Lösung aus den Vertiefungen absaugen, bevor die Zellkultur ausgesät wird. Zellen in DMM mit 10 % FBS und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid kultivieren.

Die Zellen gewinnen und sie in eine 24-Loch-Platte mit einer Dichte von 200.000 Zellen pro Loch ansäen. Anschließend die 24-Loch-Platte nach etwa 24 Stunden Inkubation in den Inkubator stellen, wenn die Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind. Das Medium von jedem Loch abziehen und die Zellen mit 500 µL vorgewärmtem serumfreiem Medium oder SFM waschen.

Fügen Sie 250 Mikroliter SFM, das zwei Mikromolar Z-M-G-F-P-Protein und 100 Mikromolar Zinkchlorid enthält, zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Danach aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen und waschen die Zellen dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern kalzium- und magnesiumfreier docosphosphatgepufferter Salzlösung, bekannt als DPBS, die mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Heparin ergänzt ist. Fügen Sie danach 200 Mikroliter 0,05 % Trisphin-EDTA zu den Brunnen hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen von der Platte zu lösen.

Überführen Sie die abgelösten Zellen in ein neues Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang mit 300 × g. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 500 Milliliter DPBS, ergänzt mit 1 % FBS, und messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität der Probe mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des fite-Kanals, wie zuvor beschrieben. Stellen Sie den Forward- und Side-Scatter so ein, dass die Population von Interesse im geeigneten Messbereich liegt.

Verwenden Sie anschließend definierte Gating-Strategien, um die Kontroll- und Testproben zu analysieren. Sammeln Sie jeweils 10.000 lebende Ventrikulärzellen pro Probe und verarbeiten Sie die Daten mit der Durchflusszytometrie-Analysesoftware. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität der mit Protein behandelten Zellen anhand der mit Kontrollserum behandelten Zellen.

Zif-MGFP-Fusionsproteine wurden in E. coli hergestellt, gereinigt und mittels SDS-PAGE analysiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das ZIF-MG-FP-Fusionsprotein mit einer Homogenität von über 95 % gereinigt wurde. Als HELO-Zellen mit steigenden Konzentrationen des ZIFF-MG-FP-Fusionsproteins behandelt wurden.

Sie zeigten eine dosisabhängige Zunahme der mittleren Fluoreszenzintensität, gemessen mittels Durchflusszytometrie. Aufeinanderfolgende Behandlungen mit dem Z-MG-FP-Fusionsprotein in einer Konzentration von zwei Mikromolar führten zu nahezu 100 % der Zellen mit MGFP-Fluoreszenz. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Translokationsdomänen des Thiefs-Proteins nutzen kann, um funktionelle Proteine in meine Zellen zu befördern.