Eine neue Anwendung der Electrical Penetration Graph (EPG) zur Erfassung und Messung elektrischer Signale in Phloem Siebelemente

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die elektrischen Signale über große Entfernungen zu untersuchen, die über die Strömungssiebelemente von einem Bereich, der von einer Raupe gefressen wird, zu einem intakten Bereich in einer Pflanze übertragen werden. Dies wird durch den Zusammenbau eines elektrischen Penetrationsdiagramms oder einer EPG-Schaltung erreicht, die ein Hämin-Insekt, wie z. B. eine Blattlaus und eine Pflanze, integriert. Die Blattlaus fügt ihren Stil in die Pflanze ein, schließt damit den Kreislauf und die EPG-Aufnahme beginnt.

Schließlich führt die Blattlaus ihren Stil in ein Siebelement ein und speichelt einige Minuten lang hinein, gefolgt von der lang anhaltenden Einnahmephase, in der sowohl die Speichel- oder E-Ein-Phase als auch die Verschluckung oder E Zwei-Phase kleine und rhythmische Strömungspotentiale enthalten. Als nächstes wird eine Raupe auf ein Blatt gesetzt und von einem Blatt gefressen. Während die im EPG aufgezeichnete Blattlaus weiterhin aus dem Fluss in einem benachbarten Blatt frisst, löst die Schädigung, die die Raupe der Mittelvene zufügt, ein elektrisches Signal aus, das über das Phem an die anderen Blätter übertragen wird, einschließlich des Blattes, von dem sich die EPG-verdrahtete Blattlaus ernährt.

Die Größe des Signals kann durch Vergleich mit einem Kalibrierimpuls bekannter Größe gemessen werden, der zuvor während der E 2- oder Verschluckphase angelegt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die durch Caterpillar vermittelte Schädigung eines Flügels konsistent ein komplexes und signifikant großes elektrisches Signal in der Strömung eines Nachbarflügels induziert, wobei eine erste langsame Komponente und eine zweite und der ersten schnellen Komponente überlagert werden. Die Technik des elektrischen Eindringdiagramms wurde in den 1960er Jahren eingeführt.

Das EPG-Monitoring hat wesentlich zu unserem Wissen über das Eindringen von Pflanzen durch Blattläuse und andere Sauminsekten beigetragen. Das wirtschaftliche Hauptinteresse liegt in der Untersuchung der Mechanismen der Wirtspflanzenresistenz sowie der Mechanismen der Übertragung von Pflanzenviren. Also kam ich auf ein Konzept, EPG als Methode für die intrazelluläre Elektrophysiologie in Pflanzen zu verwenden, indem ich eine Assoziation zwischen EPG-Aufzeichnungen und intrazellulären Aufzeichnungen herstellte, die mit herkömmlichen Glaselektroden gemacht wurden, die mit Kaliumchlorid gefüllt sind, sowohl bei EPC-Aufzeichnungen als auch bei herkömmlichen Aufnahmen, die mit Glaselektroden gemacht wurden.

Es gibt zwei Spannungsebenen, einen relativ hohen Spannungspegel, der der intrazellulären Position der Spitze der Glaselektrode oder der Spitze des AEs-Stils entspricht, und einen relativ niedrigen Spannungspegel, der der intrazellulären Position der Glaselektrode oder der AEs-Öse entspricht. Im Falle von EPG. Bei der Aufzucht von Blattläusen für eine PG-Aufnahme hängt die Wahl der Pflanzen- und Blattlausarten von der Forschung ab. Ziel ist Studien über die schnelle Opana, die Blattlaus ist geeignet, ziehen Sie sie in einem Gewächshaus auf den Käfigen auf, die die Aufzucht umgeben.

Die Pflanzen müssen durch ein feinmaschiges Gitter mit Öffnungen von weniger als einem Millimeter gegen Blattläuse und Parasitoide geschützt gemacht werden, aber die Käfigoberseiten sollten aus transparentem Material bestehen, um die Photosynthese zu ermöglichen. Alle zwei Wochen muss die Blattlauspopulation in frische Pflanzen umgesiedelt werden. 10 bis 20 erwachsene Tiere sind alles, was benötigt wird, die restlichen Blattläuse können entsorgt werden.

Für EPG-Aufnahmen von Insekten muss eine spezielle Elektrode aus Messingsteckerstiften, ein bis zwei Zentimeter langem Kupferdraht, wie z. B. Filamenten von einem Stromkabel, und einem sehr dünnen Golddraht von etwa 1,5 Zentimetern Länge aufgebaut werden. Verwenden Sie außerdem einen Silberkleber auf Wasserbasis und einen einfachen kleinen Lötbolzen mit Lötflüssigkeit und Lötdraht aus Harz. Um zu beginnen, schmelzen Sie ein Stück Lötmetalldraht auf der Spitze eines Lötbolzens.

Tauchen Sie dann den Kopf des Messingnagels in einen Tropfen Lötflüssigkeit. Berühren Sie sofort die Spitze des Kupferdrahtes mit der Spitze des Lötbolzens und schmelzen Sie ihn so mit dem Messingstift zusammen. Schütteln oder wirbeln Sie nun den Silberkleber gründlich auf, damit sich die Emulsion nicht absetzt.

Öffnen Sie die Flasche und tauchen Sie das freie Ende des Kupferdrahtes unter einem Stereoskop in den Kleber auf dem Deckel. Verbinden Sie das Goldgeflecht mit einer Überlappung von mindestens einem Millimeter und lassen Sie den Silberkleber trocknen. Versuchen Sie, den Kleber nach dem Trocknen des Klebers nicht auf die Mikroskopplatte zu schmieren, überprüfen Sie den Kontakt zwischen dem Silberkleber und dem Golddraht, wo Teile der Verbindungsdrähte nicht verklebt sind.

Füge frischen Kleber mit einer kleinen Stecknadel oder einem Kupferdraht hinzu, bis das Insekt fertig ist. Die fertige Elektrode kann sicher auf Styropor gelagert werden. Um die Blattlaus zu reparieren, verwenden Sie ein einfaches, selbstgebautes Staubsaugergerät.

Die Absaugung wird durch ein kleines Stück Papier über einem Einlaufloch gesteuert. Schalten Sie das Vakuumgerät ein und bewegen Sie es auf der Platte des Stereomikroskops, um seine Saugspitze zu zentrieren. Sammeln Sie eine Blattlaus auf einem kleinen Aquarellpinsel oder kleiner, und montieren Sie die Blattlaus auf ihrer Bauchseite in Richtung der Saugspitze, um einen einfachen Zugang zum Rücken zu erhalten.

Entfernen Sie mit der Bürste das Oberflächenwachs vom Bauch, das in der Kohlblattlaus reichlich vorhanden ist. Schütteln oder wirbeln Sie nun den Silberkleber gründlich und tragen Sie mit einer feinen Insektennadel ein kleines Tröpfchen Silberkleber auf den Rücken der Blattläuse auf. Lassen Sie dies zwei bis drei Minuten trocknen.

Schütteln Sie das Fläschchen erneut und tragen Sie ein Leimtröpfchen auf das getrocknete erste Tröpfchen auf. Befestigen Sie dann den Golddraht der vorbereiteten Insektenelektrode in das zweite Tröpfchen Silberkleber. Während er noch nass ist, halten Sie den Draht in Position, während der Kleber trocknet.

Wenn Klebstoff an die Beine oder in eine der Blattläuse gelangt, beginnen Sie mit dem neuen Tier von vorne. Die Insektenelektrode kann recycelt werden. Sobald der Kleber getrocknet ist.

Schalten Sie die Absaugung aus und befreien Sie die Blattlaus aus dem Vakuumgerät. Das kabelgebundene Insekt ist nun bereit, für EPG-Aufnahmen verwendet zu werden. Einige Blattläuse können ohne Vakuumfixierung verdrahtet werden.

Legen Sie in diesem Fall die Blattlaus auf ein Stück Laborgewebe, das rau genug ist, damit die Blattlaus greifen kann. Beim Auftragen des Klebers kann ein Golddraht in das erste Tröpfchen Silberkleber eingeführt werden. Wenn dieses Tröpfchen zu klein ist oder zu schnell trocknet, haftet der Golddraht nicht richtig.

In diesem Fall legen Sie einfach ein kleines Tröpfchen Silberkleber auf den ersten und setzen Sie den Golddraht ein, warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist. Hebe dann die Blattlaus mit Hilfe einer feinen Bürste vom Seidenpapier ab. Lagern Sie die Drahtblattläuse, indem Sie den Messingnagel in das Styropor einführen, bis er benötigt wird.

Setzen Sie die Versuchspflanzen zunächst in den Faradayschen Käfig auf einem nicht leitenden Träger wie einer Petrischale. Führe nun eine Pflanzenelektrode in die Erde jedes Topfes ein. Die Pflanzenelektrode ist keine Erdungselektrode, die im Faradayschen Käfig gesammelt werden muss.

Stecken Sie dann den Messingstift der Elektrode in den EPG. Stellen Sie die Position der Pflanze und des Insekts vor, bis sie mit dem Insekt in Kontakt kommen, an der gewünschten Position auf der Pflanze. Geben Sie mit der Schnittstellensoftware Style plus, die über eine feste Abtastfrequenz von 100 Hertz verfügt, einen Dateinamen ein, geben Sie die Aufnahmezeit an und schreiben Sie Text, um Details zum Experiment in den Kommentarzeilen anzugeben.

Starten Sie dann die Aufnahme über die Software, indem Sie auf den Start-Button in der oberen linken Ecke klicken. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die verdrahtete Blattlaus um bis zu acht Kanäle auf die Pflanze absenken, was bedeutet, dass acht verdrahtete Insekten gleichzeitig mit einem EPG-Setup aufgezeichnet werden können, entweder eine pro Pflanze oder mehr Blattläuse auf einer Pflanze. Wenn die Blattlaus ihren Stil in die Pflanze einfügt, ist der Kreislauf abgeschlossen.

Die schwankenden Spannungen des EPG-Signals erscheinen auf dem Computerbildschirm, passen die Anlagenspannung und die Verstärkung für eine optimale Aufnahme an. In den meisten Fällen dauert es mindestens eine Stunde, bis eine Blattlaus in die Fließphase eintritt. Eine anhaltende Strömungsfütterung wird durch mindestens 10 Minuten Wellenform E zwei angezeigt.

Zu diesem Zeitpunkt ist die Elektrode bereit, elektrische Signale vom Siebelement zu erfassen, die nur induziert werden sollten, wenn das Signal E zwei stabil ist. Es ist wichtig, einen oder mehrere Kalibrierimpulse zu liefern, die später zur Abschätzung der Größe der elektrischen Signale verwendet werden. Das Schneiden eines Blattes mit einer Schere induziert konsistent ein elektrisches Signal über große Entfernungen, das von der im EPG aufgezeichneten Blattlaus erfasst wird.

In einem realistischeren Experiment wird eine hungrige Raupe als Verwundungsmittel verwendet. Von der Raupe zugefügte Schäden induzieren durchweg langsame und schnelle elektrische Signale, die zu den anderen Blättern gelangen und mit EPG-Elektroden erfasst werden können. Das Geräusch, das durch das Einführen der Raupe erzeugt wird, beeinflusst die elektrophysiologische Reaktion der Pflanze nicht, kann sie jedoch maskieren, um dieses Geräusch zu minimieren.

Der Experimentator sollte geerdet werden, um zu testen, ob eine fressende Raupe elektrische Signale in dem zu fressenden Blatt induziert. Eine hungrige Raupe wird auf das Blatt gelegt, das auch die im EPG aufgezeichnete Blattlaus hält, wenn zwei verschiedene Blätter nacheinander mit einer Schere an der peralen Lamina-Verbindung geschnitten wurden. Eine EPG-Elektrode, die auf der Mittelvene eines intakten Blattes platziert wurde, das ein Nachbar beider zu schneidenden Blätter war, detektierte ähnliche elektrophysiologische Reaktionen desselben Siebelements auf diese Wunden.

Diese elektrophysiologischen bestanden aus einer langsamen Depolarisation und einer schnellen Depolarisation, die der langsamen Depolarisation überlagert war. In einem anderen Experiment wurden ebenfalls zwei Blätter abgeschnitten, aber in diesem Fall war eines ein Nachbar des Blattes, das die EPG-Elektrode enthielt, während das andere kein Nachbar des Blattes mit der EPG-Elektrode war. In diesem Fall reagierte das einzelne Siebelement unterschiedlich auf die Wunden.

Die Wicklung auf das nicht benachbarte Blatt, die zuerst hergestellt wurde, induzierte nur ein langsames elektrisches Signal, während die Wicklung auf das Nachbarblatt ein komplexes Signal mit langsamen und schnellen Komponenten induzierte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SIV-Elemente in der Lage sind, den Ort des Schadens hier anhand einer Blattlaus zu detektieren. Intrazelluläre Aufzeichnungen wurden von einem marginalen Siebelement in einem Blatt einer Arabidopsis-Pflanze gemacht. Beim Schneiden eines Nachbarblattes wurde ein elektrisches Signal ausgelöst, das an das Siebelement weitergeleitet wurde, in das das Blattlaus-Stilett eingesetzt wurde.

Im Gegensatz zu Siebelementen in großen Venen reagierten die Siebelemente in marginalen Venen auf Fernschäden mit nur einer einzigen langsamen Depolarisationswelle, die der langsamen Depolarisationswelle in zentralen Siebelementen entsprechen könnte. Electrical Penetration Graph oder Repeat ist eine Methode, die helfen kann, Schlüsselfragen in den Bereichen Pflanzenelektrophysiologie und Pflanzenphysiologie zu beantworten, wie zum Beispiel, welche Kanäle sich auf Kanälen befinden, den elektrischen Signalen über große Entfernungen zugrunde liegen, die von Blatt zu Blatt wandern, und vor allem, welche Rolle spielen diese Signale bei der Anpassung der Pflanzen an ihre Umgebung? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine Vorstellung davon haben, wie Sie Pflanzen und Insekten für das EPG vorbereiten können.

Die Aufzeichnung von Insektenkabeln scheint kompliziert zu sein, aber wir haben gezeigt, dass sie ziemlich einfach ist und Sie dazu ermutigen kann, sie in Ihrer eigenen Forschung umzusetzen.