Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Antikörper, die von B-Zellen produziert werden, zu klonen und zu exprimieren. Dies wird erreicht, indem zunächst B-Zellen aus einem geeigneten Quellgewebe wie Blut oder Thymus isoliert werden. Im zweiten Schritt werden FACS-Analysen durchgeführt, um die B-Zell-Population auszuwählen, die positiv für die Produktion von IgG ist.

Anschließend werden die Zellen durch eine Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus in Kombination mit der Aktivierung des Toll-ähnlichen Rezeptors neun durch C-P-G-O-D-N 2006 immortalisiert und in Kultur gehalten. Die abschließenden Schritte bestehen darin, RNA aus Klone zu isolieren, die mittels ELISA positiv auf IgG-Produktion getestet wurden, und komplementäre DNA sowohl aus der leichten als auch aus der schweren IgG-Kette zu erzeugen. Letztendlich können die IgG-Sequenzen in Säugerzelle-Expressionsvektoren kloniert werden, um große Mengen monoklonaler humaner IgG-Antikörper herzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Phagen-Display-Technologie besteht darin, dass die ursprüngliche Paarung der IgG-schweren und -leichten Ketten nicht verloren geht. Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der Autoimmunität beantworten, beispielsweise die Entdeckung und funktionelle Charakterisierung pathogener Autoantikörper. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Patientenmaterial und EBV-Virus riskant sein kann.

EB-Virus ist ein humanes Pathogen, und es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie VSL-Stufe zwei-PROEs und das Tragen angemessener Schutzausrüstung getroffen werden, während diese Schritte durchgeführt werden. Bevor die P-BMCs gefärbt werden, geben Sie sie in einen 25 cm²-Flasche mit sechs Millilitern vollständigem RPMI 1640-Medium und lassen Sie sie über Nacht regenerieren. Nach dem Blockieren und Waschen der Zellen sammeln Sie die PBMCs in einem Reagenzglas mit einem halben Milliliter Medium und zentrifugieren sie. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in Markierungspuffer und zählen Sie diese.

Als Nächstes bereiten Sie zwei FACS-Röhrchen mit jeweils 5 Millionen Zellen in 200 Mikroliter Puffer vor. Geben Sie 10 Mikroliter anti-CD22-PE-Cy5 oder 40 Mikroliter anti-IgG-PE hinzu und lassen Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln inkubieren. Anschließend waschen, filtern und sortieren Sie die Zellen. Ziel ist es, die doppelt positiven Zellen zu zählen.

Beginnen Sie damit, die sortierten P-BMCs mit einem Verdünnungsverhältnis von einer Zelle pro Mikroliter in RPMI 1640, komplettes Medium, unter Zugabe von CPG 2006 und EBV zu verdünnen. Anschließend geben Sie in einem Sicherheitswerkbank 110 Mikroliter der Zellverdünnung mit EBV und CPG 2006 in zwei Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte, die zuvor mit bestrahlten WI-38-Zellen beschichtet wurde. Die Infektion mit 50 Zellen pro Vertiefung ist optimiert und erhöht die Wahrscheinlichkeit, einen monoklonalen Antikörper zu erhalten.

Es wird jedoch empfohlen, dies mittels einer PCR zu bestätigen. Nach einer Woche der Inkubation die Zellen unter dem Mikroskop auf B-Zell-Wachstum untersuchen. Nach zwei Wochen das Medium wechseln, indem langsam 90 Mikroliter Medium aus jedem Well abgesaugt und in eine neue Platte übertragen werden.

Um die IgG-Produktion mittels ELISA zu testen. Danach 100 µL frisches, supplementiertes Medium, einschließlich IL-2, zu jedem Ansatz hinzufügen. Die Überwachung des Klonenwachstums erfolgt weiterhin in der dritten und vierten Wachstumswoche.

Wöchentlich den Mediumwechsel wiederholen. Die Methoden zur klonalen Expansion im Textprotokoll nachlesen. Die Überstände der Mediumwechsel auf IgG-Produktion mittels eines enzymgekoppelten Immunosorbens-Assays oder ELISA überprüfen.

Zunächst bereiten Sie die ELIZA-Platten vor, indem Sie in jedes Loch 50 Mikroliter Ziegen-Anti-Mensch-FC-Antikörper, verdünnt im Verhältnis 1 zu 200 in Puffer zum Beschichten, pipettieren. Nach der Inkubation und dem Waschen der Platte blockieren Sie die Löcher mit jeweils 100 Mikrolitern Blockpuffer und inkubieren die Platte erneut. Nach der Block-Inkubation klopfen Sie die Flüssigkeit aus der Platte auf ein Papiertuch.

Bei vorbereiteter Platte: Verdünnen Sie die Überstände mit vier Volumina RPMI. Stellen Sie anschließend für Standardkontrollen eine serielle Verdünnung einer humanen IgG-Lösung in RPMI von 1000 Nanogramm pro Milliliter bis 15,6 Nanogramm pro Milliliter her.

Schließen Sie außerdem eine Leerprobe ein. Geben Sie 50 Mikroliter des Überstandes oder des Standards in jedes Loch und inkubieren Sie die ELISA-Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter den gleichen Bedingungen; zusätzliche ELISA-S-Platten können eingerichtet werden, um weitere Verdünnungen der Überstände zur Bestimmung der Antikörperaffinität zu analysieren. Nach der Inkubation waschen Sie die Platte.

Danach 50 µL Inkubationspuffer mit peroxidasekonjugiertem Fab2 in jedes Loch geben. Nach einer weiteren Stunde Inkubation und einem erneuten Waschschritt 100 µL Substratlösung mit TMB in jedes Loch hinzufügen. Anschließend die Platte bis zu 10 Minuten inkubieren, bis die entstehende blaue Farbe stabil ist.

Dann stoppen Sie die Reaktion und messen die Absorption. Alle Klonüberstände mit einem gemessenen Absorptionswert, der drei Standardabweichungen über dem Leerwert liegt, gelten als positiv.

Für humane IgG-Antikörper kann die antigene Spezifität durch weitere Assays nachgewiesen werden. Zunächst befolgen Sie die Textanleitung, um Kopier-DNA aus den positiven Klonen zu synthetisieren. Danach richten Sie PCR-Reaktionen für die IgG-schwere Kappa- und Lambda-Kette ein.

Suchen Sie im Ergebnis die schwere Kette bei 400 bis 550 Basenpaaren. Suchen Sie die leichte Kette bei 300 bis 400 Basenpaaren. Falls diese nicht vorhanden sind, verwenden Sie ein Mikroliter der Produktmengen als Vorlage für eine weitere PCR.

Die neuen Produkte sollten im geeigneten Bereich liegen. Fahren Sie dann mit dem Klonen der besten Produkte fort. Sequenzieren Sie diese zunächst. Ihre Elektropherogramme sollten sauber sein und einer einzelnen Immunglobinsequenz entsprechen.

Befolgen Sie das Textprotokoll. Klonen Sie das gereinigte PCR-Produkt in ein Mikrogramm Plasmid-DNA. Stellen Sie sicher, dass die Ligierung über Nacht bei 16 Grad Celsius erfolgt.

Unter Verwendung von T4-DNA-Ligase die HX-Zellen in ergänztem DMEM vorbereiten und in 75 cm²-Kulturflaschen bis zu einer Konfluenz von 75 % heranzüchten. Für jede schwere-leichte-Kette-Transfektion eine Mischung aus 1,75 Milliliter DMEM ohne Serum, 4,5 Mikrogramm schwerem Kettenvektor, 3 Mikrogramm leichtem Kettenvektor und 50 Mikroliter Polyethalin-Lösung herstellen. Diese Mischung vorsichtig einer Platte mit HX-Zellen hinzufügen und die Lösung über die Platte schwenken.

Die Platte über Nacht inkubieren und anschließend täglich mit der Sammlung der Kulturmedien beginnen. Dabei das Medium jeden Tag durch serumsfreies Medium ersetzen. Das Medium enthält die Antikörper und kann vier Tage lang täglich gesammelt werden, nachdem CD22- und IgG-positive pBMCs mittels FACS sortiert wurden.

Der Bereich der doppelt positiven Zellen, B-Zellen, die IgG-Antikörper produzieren, wurde separat zur Expansion gesammelt. Etwa 1 % der PBMC befanden sich in dieser doppelt positiven Population. Nach fünf Wochen EBV-Immortalisierung und Stimulierung mit CPG 2006 wurden immortalisierte Klone isoliert.

WI 30-Füttererzellen weisen eine stärker gestreckte, fibroblastenähnliche Form auf, während die B-Zellklone als sehr kleine, runde Zellen erscheinen, die in Clustern in der Mitte der rundbodigen Mehrlochplatte wachsen. Das Überstandmedium der wachsenden Klone wurde mittels ELISA auf IgG getestet. Eine positive Klon wurde anhand eines ELISA-Werts ausgewertet, der drei Standardabweichungen über dem Leerwert lag.

Mindestens drei Überstände von einem positiven Klon testeten im ELISA positiv. Antikörper von einem positiven Klon wurden sequenziert, nachdem die variablen und konstanten Bereiche der Immunglobulin-Heavy- und Lambda-Ketten gepaart geklont wurden, sodass die schweren und leichten Ketten charakterisiert werden konnten. Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie die Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich des Antikörpers, des Genverbrauchs und der genetischen Diversität. Durch diese Entwicklung eröffnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Autoimmunität die Möglichkeit, Krankheiten, deren Pathologie sowie relevante therapeutische Strategien für autoimmune Erkrankungen wie die Myasthenia gravis zu erforschen. Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis in die Diagnose und Therapie von Erkrankungen wie der Myasthenia gravis, da die Entdeckung pathogener Antikörper zur Entwicklung neuer Behandlungsansätze führen kann, beispielsweise von konkurrierenden Antikörpern, die über keine entzündungsfördernde Aktivität verfügen.