Name: Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung rekombinanter humaner IgG-Antikörper aus immortalisierten B-Zellen. Diese Methode nutzt EBV-Immortalisierung und ELISA-Validierung für die Forschung zu Autoimmunität und therapeutischen Antikörpern.

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Forschungsvertrag Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) bis (GN-G.). Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung &quot;Graduate School of Translational Neuroscience Program&quot; (022005019) an (CH). Zuschüsse aus dem Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) und der Association Française contre les Myopathien zu (PM-M.); sowie durch eine Veni Fellowship der Niederlande Organisation für wissenschaftliche Forschung (916.10.148) ein Stipendium des Gehirns Foundation der Niederlande (FS2008 (1) -28) und dem Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) (ML ). Wir danken Jozien Jaspers für ihre Hilfe in der B-Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie.

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<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

In diesem Manuskript, werden alle Schritte für die Erzeugung von IgG-Antikörpern aus humanen PBMCs im Einzelnen dargestellt. Dieses Protokoll umfasst einige Vorteile gegenüber zuvor veröffentlichten Verfahren. Einer der Vorteile ist, dass die produzierten Antikörpers behält die schweren und leichten Ketten der Vorlage entsprechende Paar in der B-Zell-Klon. Die Identifizierung von IgG-Antikörpern kann in jeder Art von menschlichen Spender durchgeführt werden und es besteht keine Notwendigkeit für Exazerbation der Immunan...

Das Ziel dieses Artikels ist, im Detail zu beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung human IgG monoklonaler Antikörper aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) erhalten. Das Interesse für die menschliche Antikörper zu untersuchen hat in vielen Bereichen der Forschung gewachsen. Insbesondere sind viele Forschungsgruppen Interesse in der Pathologie von Autoantikörpern verursacht 1-3. Wir kloniert und charakterisiert pathogene Autoantikörper 1. Die Studie von Autoantikörpern kann helfen, ihre Ziele zu identifizieren und therapeutische Strategien zu entwickeln, beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern Wettbewerber 4. Außerdem kann die Untersuchung der menschlichen Antikörper auch von Interesse in anderen Forschungsgebieten, dh, um die Immunantwort nach der Impfung 5 zu bewerten, um die Antikörperprofil von Individuen, die belichtet und wurde resistent gegen bestimmte Krankheitserreger 6 bzw. zu untersuchen, wurden die kenn Antikörper sind indas natürliche Repertoire 7,12. Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um rekombinante menschliche monoklonale Antikörper 8-12 zu erzeugen; die meisten von ihnen verwenden, Phagen-Display und B-Zell-Immortalisation. Die Verwendung von Phagen-Display wurde ausgiebig für die Entdeckung von neuen Antikörpern 13 angelegt. Es hat jedoch einen großen Nachteil, nämlich, daß die schweren und leichten Kettenpaaren des menschlichen Immunglobulins werden in dem Verfahren dissoziiert. Herstellung von Hybridomen mit menschlichen B-Zellen oder EBV-Transformation überwindet diesen Nachteil. Wir verwenden Infektion von Thymus-B-Zellen mit EBV in Kombination mit polyklonalen B-Zell-Stimulation über Toll-like Rezeptor 9 (TLR-9) 6,12. In diesem Papier beschreiben wir ausführlich die Technik, die wir für die Entwicklung von menschlichen Antikörpern IgG, mit einem kompletten Überblick über alle Schritte von PBMC Isolierung auf die In-vitro-Antikörpern. DieseProtokoll für die Analyse von jeder Form von menschlichem IgG-Profil verwendet werden. In unserem Labor, B-Zellen, die IgG-Antikörper wurden erfolgreich aus dem Rest der PBMCs nach der Sortierung getrennt. Fünfzig sortiert B-Zellen 8 kann dann in Multiwell-Platten plattiert und mit EBV immortalisiert und TLR-9-Aktivierung, die klonale Expansion von einzelnen B-Zellen sein. Als Feeder-Zellen, Fibroblasten aus menschlichen embryonalen Lungengewebe verwendet wurden, Zellinie WI38, die die Visualisierung der immortalisierten B-Zellen ermöglicht. Von diesen B-Zellen, können die Sequenzen der schweren und leichten Ketten des Immunglobulins durch PCR erhalten werden, und der Antikörper-Gene in Immunglobulin-G-Expressionsvektoren kloniert und in vitro produziert. Mit dieser Technik können einzelne Antikörper mit genau der gleichen Antikörpersequenz in dem Spender gefunden sucht werden.

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>Lösung, die Polysaccharose und Natriumdiatrizoat</td></tr><tr><td>enthält FACSAria II Zellsortierer&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Mikrotiterplatten mit U-Boden&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mittel;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>30 % v/v EBV-haltiger Überstand der B95-8-Zelllinie&nbsp; &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3,4 x 108 Kopien/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38 Zellen&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-2</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>ELISA-Platten</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc&gamma; Fragmentspezifisch (unkonjugiert)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% fettfreie Trockenmilch (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>IgG beim Menschen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>HUMAN IgG gereinigtes Immunglobulin, 5,6 mg/ml</td></tr><tr><td>Ziege F(ab)2 Antihuman-IgG Fc&gamma; (konjugiert mit Peroxidase (PO))</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>ELISA-Lesegerät (Perkin Elmer 2030)</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-konjugiertes AffiniPure Kaninchen Anti-Human-IgM, Fc5&micro; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Zellen Direktes cDNA-Synthesesystem&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR-System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochreines RNA-Isolationskit&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Kit für das reverse Transkriptionssystem&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Taq-DNA-Polymerase</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Primer (2 & mu; l)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrareine Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp Leiter</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Menge One 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Zyklussequenzierungskit&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>0,1 ml Reaktionsplatte (MicroAMP Optical 96-Well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Genanalysator ABI300&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha-kompetente Zellen (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4.493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4.484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td>SOC-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB-basiertes Agarmedium, ergänzt mit Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broce (TB)-basiertes flüssiges Medium, ergänzt mit Zeocin (Fast-Media Zeo TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (ND1000 Spektralphotometer)</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-basiertes Agarmedium, ergänzt mit Blasticidin (Fast-Media Blast Agar)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB)-basiertes flüssiges Medium, ergänzt mit Blasticidin (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20.000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA Leiter</td><td>New England</td><td>Biolabs N3200S</td><td>0,1-10,0 kb, 1.000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10.000 U/ml, in 10x CutSmart Puffer&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5.000 U/ml, in 10x CutSmart Puffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Thermosensitive alkalische Phosphatase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 μμ; l, in 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha; kompetente Zellen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Human-IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von rekombinanten humanen igg monoklonalen antikörpern aus immortalisierte sortiert b cells

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Die Suche nach neuen Methoden zur Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper ist ein aktives Forschungsfeld, das sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandte Wissenschaft, einschließlich der Entwicklung von Immuntherapeutika, wichtig ist. Die Techniken zur Identifizierung und Herstellung solcher Antikörper sind jedoch in der Regel mühsam, und manchmal werden das schwere und das leichte Kettenpaar der Antikörper dissoziiert. Hier beschreiben wir ein relativ einfaches, unkompliziertes Protokoll zur Herstellung humaner rekombinanter monoklonaler Antikörper aus humanen mononukleären Zellen im peripheren Blut unter Verwendung der Immortalisierung mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) und der Aktivierung des Toll-like-Rezeptors 9. Bei einer adäquaten Färbung können B-Zellen, die Antikörper produzieren, für die anschließende Immortalisierung und klonale Expansion isoliert werden. Die von den immortalisierten B-Zell-Klonen produzierten Antikörpertranskripte können mittels PCR amplifiziert, als entsprechende schwere und leichte Kettenpaare sequenziert und in Immunglobulin-Expressionsvektoren kloniert werden. Die mit dieser Technik gewonnenen Antikörper können leistungsstarke Werkzeuge sein, um relevante menschliche Immunreaktionen, einschließlich Autoimmunität, zu untersuchen und die Grundlage für neue Therapeutika zu schaffen.

Die Sortierung Gating nach Färbung CD22 und IgG-positiven Zellen wird in Abbildung 1 gezeigt, in diesem Bild die Fläche der doppelt positiven Zellen. - B-Zellen, die IgG-Antikörper - ausgewählt ist, um all diese Zellen in ein separates Röhrchen sortieren. In der Analyse ca. 1% der Gesamt PBMCs entsprechen dieser doppelt positiven Bevölkerung. Die Anzahl der sortierten Zellen erhalten wird von der Anzahl von Zellen in Abschnitt 1 erhaltenen abhängen. Die unterschiedlichen Erg...

Die Synthese von humanen monoklonalen Antikörpern ist der erste Schritt in Studien, die darauf abzielen, die pathophysiologischen Mechanismen von Autoantikörper-vermittelten Immunantworten zu entschlüsseln. Wir haben ein Protokoll zur Erzeugung rekombinanter monoklonaler Immunglobulin G (IgG)-Antikörper aus blutsortierten B-Zellen entwickelt, einschließlich B-Zellisolierung, Antikörperklonierung und In-vitro-Synthese.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Antikörper, die von B-Zellen produziert werden, zu klonen und zu exprimieren. Dies wird erreicht, indem zunächst B-Zellen aus einem geeigneten Quellgewebe wie Blut oder Thymus isoliert werden. Im zweiten Schritt werden FACS-Analysen durchgeführt, um die B-Zell-Population auszuwählen, die positiv für die Produktion von IgG ist.Anschließend werden die Zellen durch eine Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus in Kombination mit der Aktivierung des Toll-ähnlichen Rezeptors neun durch C-P-G-O-D-N 2006 immortalisiert und in Kultur gehalten. Die abschließenden Schritte bestehen darin, RNA aus Klone zu isolieren, die mittels ELISA positiv auf IgG-Produktion getestet wurden, und komplementäre DNA sowohl aus der leichten als auch aus der schweren IgG-Kette zu erzeugen. Letztendlich können die IgG-Sequenzen in Säugerzelle-Expressionsvektoren kloniert werden, um große Mengen monoklonaler humaner IgG-Antikörper herzustellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Phagen-Display-Technologie besteht darin, dass die ursprüngliche Paarung der IgG-schweren und -leichten Ketten nicht verloren geht. Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der Autoimmunität beantworten, beispielsweise die Entdeckung und funktionelle Charakterisierung pathogener Autoantikörper. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Patientenmaterial und EBV-Virus riskant sein kann.EB-Virus ist ein humanes Pathogen, und es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie VSL-Stufe zwei-PROEs und das Tragen angemessener Schutzausrüstung getroffen werden, während diese Schritte durchgeführt werden. Bevor die P-BMCs gefärbt werden, geben Sie sie in einen 25 cm²-Flasche mit sechs Millilitern vollständigem RPMI 1640-Medium und lassen Sie sie über Nacht regenerieren. Nach dem Blockieren und Waschen der Zellen sammeln Sie die PBMCs in einem Reagenzglas mit einem halben Milliliter Medium und zentrifugieren sie. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in Markierungspuffer und zählen Sie diese.Als Nächstes bereiten Sie zwei FACS-Röhrchen mit jeweils 5 Millionen Zellen in 200 Mikroliter Puffer vor. Geben Sie 10 Mikroliter anti-CD22-PE-Cy5 oder 40 Mikroliter anti-IgG-PE hinzu und lassen Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln inkubieren. Anschließend waschen, filtern und sortieren Sie die Zellen. Ziel ist es, die doppelt positiven Zellen zu zählen.Beginnen Sie damit, die sortierten P-BMCs mit einem Verdünnungsverhältnis von einer Zelle pro Mikroliter in RPMI 1640, komplettes Medium, unter Zugabe von CPG 2006 und EBV zu verdünnen. Anschließend geben Sie in einem Sicherheitswerkbank 110 Mikroliter der Zellverdünnung mit EBV und CPG 2006 in zwei Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte, die zuvor mit bestrahlten WI-38-Zellen beschichtet wurde. Die Infektion mit 50 Zellen pro Vertiefung ist optimiert und erhöht die Wahrscheinlichkeit, einen monoklonalen Antikörper zu erhalten.Es wird jedoch empfohlen, dies mittels einer PCR zu bestätigen. Nach einer Woche der Inkubation die Zellen unter dem Mikroskop auf B-Zell-Wachstum untersuchen. Nach zwei Wochen das Medium wechseln, indem langsam 90 Mikroliter Medium aus jedem Well abgesaugt und in eine neue Platte übertragen werden.Um die IgG-Produktion mittels ELISA zu testen. Danach 100 µL frisches, supplementiertes Medium, einschließlich IL-2, zu jedem Ansatz hinzufügen. Die Überwachung des Klonenwachstums erfolgt weiterhin in der dritten und vierten Wachstumswoche.Wöchentlich den Mediumwechsel wiederholen. Die Methoden zur klonalen Expansion im Textprotokoll nachlesen. Die Überstände der Mediumwechsel auf IgG-Produktion mittels eines enzymgekoppelten Immunosorbens-Assays oder ELISA überprüfen.Zunächst bereiten Sie die ELIZA-Platten vor, indem Sie in jedes Loch 50 Mikroliter Ziegen-Anti-Mensch-FC-Antikörper, verdünnt im Verhältnis 1 zu 200 in Puffer zum Beschichten, pipettieren. Nach der Inkubation und dem Waschen der Platte blockieren Sie die Löcher mit jeweils 100 Mikrolitern Blockpuffer und inkubieren die Platte erneut. Nach der Block-Inkubation klopfen Sie die Flüssigkeit aus der Platte auf ein Papiertuch.Bei vorbereiteter Platte: Verdünnen Sie die Überstände mit vier Volumina RPMI. Stellen Sie anschließend für Standardkontrollen eine serielle Verdünnung einer humanen IgG-Lösung in RPMI von 1000 Nanogramm pro Milliliter bis 15,6 Nanogramm pro Milliliter her.Schließen Sie außerdem eine Leerprobe ein. Geben Sie 50 Mikroliter des Überstandes oder des Standards in jedes Loch und inkubieren Sie die ELISA-Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter den gleichen Bedingungen; zusätzliche ELISA-S-Platten können eingerichtet werden, um weitere Verdünnungen der Überstände zur Bestimmung der Antikörperaffinität zu analysieren. Nach der Inkubation waschen Sie die Platte.Danach 50 µL Inkubationspuffer mit peroxidasekonjugiertem Fab2 in jedes Loch geben. Nach einer weiteren Stunde Inkubation und einem erneuten Waschschritt 100 µL Substratlösung mit TMB in jedes Loch hinzufügen. Anschließend die Platte bis zu 10 Minuten inkubieren, bis die entstehende blaue Farbe stabil ist.Dann stoppen Sie die Reaktion und messen die Absorption. Alle Klonüberstände mit einem gemessenen Absorptionswert, der drei Standardabweichungen über dem Leerwert liegt, gelten als positiv.Für humane IgG-Antikörper kann die antigene Spezifität durch weitere Assays nachgewiesen werden. Zunächst befolgen Sie die Textanleitung, um Kopier-DNA aus den positiven Klonen zu synthetisieren. Danach richten Sie PCR-Reaktionen für die IgG-schwere Kappa- und Lambda-Kette ein.Suchen Sie im Ergebnis die schwere Kette bei 400 bis 550 Basenpaaren. Suchen Sie die leichte Kette bei 300 bis 400 Basenpaaren. Falls diese nicht vorhanden sind, verwenden Sie ein Mikroliter der Produktmengen als Vorlage für eine weitere PCR.Die neuen Produkte sollten im geeigneten Bereich liegen. Fahren Sie dann mit dem Klonen der besten Produkte fort. Sequenzieren Sie diese zunächst. Ihre Elektropherogramme sollten sauber sein und einer einzelnen Immunglobinsequenz entsprechen.Befolgen Sie das Textprotokoll. Klonen Sie das gereinigte PCR-Produkt in ein Mikrogramm Plasmid-DNA. Stellen Sie sicher, dass die Ligierung über Nacht bei 16 Grad Celsius erfolgt.Unter Verwendung von T4-DNA-Ligase die HX-Zellen in ergänztem DMEM vorbereiten und in 75 cm²-Kulturflaschen bis zu einer Konfluenz von 75 % heranzüchten. Für jede schwere-leichte-Kette-Transfektion eine Mischung aus 1,75 Milliliter DMEM ohne Serum, 4,5 Mikrogramm schwerem Kettenvektor, 3 Mikrogramm leichtem Kettenvektor und 50 Mikroliter Polyethalin-Lösung herstellen. Diese Mischung vorsichtig einer Platte mit HX-Zellen hinzufügen und die Lösung über die Platte schwenken.Die Platte über Nacht inkubieren und anschließend täglich mit der Sammlung der Kulturmedien beginnen. Dabei das Medium jeden Tag durch serumsfreies Medium ersetzen. Das Medium enthält die Antikörper und kann vier Tage lang täglich gesammelt werden, nachdem CD22- und IgG-positive pBMCs mittels FACS sortiert wurden.Der Bereich der doppelt positiven Zellen, B-Zellen, die IgG-Antikörper produzieren, wurde separat zur Expansion gesammelt. Etwa 1 % der PBMC befanden sich in dieser doppelt positiven Population. Nach fünf Wochen EBV-Immortalisierung und Stimulierung mit CPG 2006 wurden immortalisierte Klone isoliert.WI 30-Füttererzellen weisen eine stärker gestreckte, fibroblastenähnliche Form auf, während die B-Zellklone als sehr kleine, runde Zellen erscheinen, die in Clustern in der Mitte der rundbodigen Mehrlochplatte wachsen. Das Überstandmedium der wachsenden Klone wurde mittels ELISA auf IgG getestet. Eine positive Klon wurde anhand eines ELISA-Werts ausgewertet, der drei Standardabweichungen über dem Leerwert lag.Mindestens drei Überstände von einem positiven Klon testeten im ELISA positiv. Antikörper von einem positiven Klon wurden sequenziert, nachdem die variablen und konstanten Bereiche der Immunglobulin-Heavy- und Lambda-Ketten gepaart geklont wurden, sodass die schweren und leichten Ketten charakterisiert werden konnten. Nach diesem Verfahren.Andere Methoden wie die Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich des Antikörpers, des Genverbrauchs und der genetischen Diversität. Durch diese Entwicklung eröffnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Autoimmunität die Möglichkeit, Krankheiten, deren Pathologie sowie relevante therapeutische Strategien für autoimmune Erkrankungen wie die Myasthenia gravis zu erforschen. Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis in die Diagnose und Therapie von Erkrankungen wie der Myasthenia gravis, da die Entdeckung pathogener Antikörper zur Entwicklung neuer Behandlungsansätze führen kann, beispielsweise von konkurrierenden Antikörpern, die über keine entzündungsfördernde Aktivität verfügen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein High-Throughput-, automatisierten Plattform zur Herstellung von Zelllinien-Entwicklung für die Herstellung von Protein-Therapeutika wird beschrieben. Implementierung von BD FACS Aria Cell Sorter hat CloneSelect Imager und Tecan Freedom EVO Liquid-Handling-System deutlich erhöht Verarbeitungskapazität in Zelllinien-Entwicklung mit verbesserten Zell-Linie Qualität und hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von Antikörpern aus Säugetierzellen durch Einführung von Plasmidvektoren mit schweren und leichten Kettengenen. Diese Vektoren interagieren mit Polyethylenimin und gelangen durch Bildung von Polyplexen in die Zellen; Später werden sie in einzelne Proteine übersetzt und zu vollständigen Antikörpern zusammengesetzt, die in das extrazelluläre Medium sezerniert werden.

Erzeugung rekombinanter monoklonaler Antikörper aus Säugetierzellkulturen

Das Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen. Eukaryotische Expressionsvektoren, die für die schweren und leichten Ketten von Antikörpern kodieren, die von isolierten antigenspezifischen B-Zellen kloniert wurden, werden mit Hilfe von Polyplexen in Säugetierzellen eingeführt. Sobald sich diese Vektoren in den Zellen befinden, durchlaufen sie eine Translation, und die resultierenden schwer- und leichtkettigen Peptide lagern sich zu...

Eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern auf Basis der Hybridom-Technologie vorgestellt. Die Mäuse wurden mit einem Immunkonjugat immunisiert. Milzzellen wurden durch PEG und einen elektrischen Impuls mit unsterblichen Myelomzellen fusioniert. Antikörper-produzierende Hybridomzellen wurden mittels HAT und antigenspezifischem ELISA-Screening selektiert.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in...

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

C57BL / 6 Mäuse wurden verwendet, um Hc Pathogenese zu studieren und bieten das beste Modell. Wir erforschen die potenziellen Vorteile der humoralen Immunität gegen diesen Pilz erzeugt und mehrere mAbs [zum Histon H2B und ein heat shock protein 60kDa], dass wir für ihre Schutzwirkung nach intraperitonealer Verabreichung getestet.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

Lernen Sie die Erzeugung rekombinanter humaner IgG-Antikörper aus immortalisierten B-Zellen. Diese Methode nutzt EBV-Immortalisierung und ELISA-Validierung für die Forschung zu Autoimmunität und therapeutischen Antikörpern.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

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