Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Stammzellen sicher und effektiv in Alginat- und Hydrogelkapseln einzubetten und sie innerhalb der Kapseln zu kultivieren, um die Aggregation und Mikroumgebung zu kontrollieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine gefilterte Stammzellsuspension und eine Natriumalginatlösung gemischt werden. Die Mischung wird dann auf eine Spritze übertragen und eine Koaxialdüse wird auf der Spritze installiert, bevor sie auf eine Spritzenpumpe gesetzt wird. Als nächstes werden die Tröpfchen hergestellt, indem die Zellsuspension mit koströmendem Stickstoffgas ausgestoßen wird, gefolgt von der Sammlung und der Calciumchloridlösung.

Die Kapseln werden dann mit Poly-L-Lysin behandelt, um Zellleckagen zu verhindern, und EDTA, um die inneren Kapseln zu fluidisieren, bevor die verkapselten Zellen in einem rotierenden Schüttelzustand kultiviert werden. Schließlich werden die Zellen durch EDTA und physikalische Zerstörung der Membran aus den Kapseln entnommen. Letztendlich verhindert die Alginatverkapselung von pluripotenten Stammzellen eine übermäßige Aggregation der Zellen und begrenzt den Stress, dem die Zellen in der Suspensionskultur ausgesetzt sind.

Diese Methode kann helfen, die zentralen Fragen im biologischen und biomedizinischen Bereich zu beantworten, wie z.B. die große Expansion der Zelltransplantation und die Erforschung der Stammzellnische. Beginnen Sie mit der Zellverkapselung, indem Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben sammeln, nachdem Sie drei Minuten lang bei 160-fachem G zentrifugiert haben. Waschen Sie das induzierte pluripotente Stamm- oder IPS-Zellpellet durch Resus, suspendieren Sie gepufferte Kochsalzlösung in Haufen und zentrifugieren Sie sie dreimal nach der Reanimation, wobei die Zellen und Haufen gepufferte Kochsalzlösung suspendiert werden.

Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb, um große Aggregate zu entfernen, die sonst die Düse verstopfen könnten. Mischen Sie anschließend zwei Milliliter gefilterte Zellsuspension und drei Milliliter 5%ige Natriumalginatlösung. Um eine Zellsuspension von fünf Millilitern in 3% Natriumalginat zu erhalten, beträgt die Zelldichte DIR mehr als 1 Million Zellen pro Milliliter.

Nachdem Sie die Zellsuspension in eine Fünf-Milliliter-Spritze gesammelt haben, installieren Sie eine Koaxialdüse auf der Spritze und setzen Sie sie auf eine Spritzenpumpe, geben Sie einen Stickstoffgasstrom durch die äußere Nadel der Koaxialdüse ab und stoßen Sie die Zellsuspension durch die innere Düse aus. Sammeln Sie Tröpfchen in 250 Milliliter 0,5%iger Calciumchloridlösung und warten Sie 10 bis 20 Minuten auf die Datierung, während Sie bei 60 bis 90 U/min rühren. Nach dem Waschen mit gepufferter Kochsalzlösung werden die gesammelten Kapseln als nackte Kapseln verwendet, um die Kapseln zu behandeln, die Kalziumalginatkapseln in 0,05% Gewicht pro Volumen inkubieren.

Poly L Lysinlösung für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid unter Schütteln. Nachdem Sie die Kapseln in einer Tube gesammelt und mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen haben, inkubieren Sie sie in DMEM mit 10% FBS. Um die elektrische Ladung auf ihrer Oberfläche zu neutralisieren, verwenden Sie die resultierenden Kapseln als beschichtete Kapseln, um Hohlkapseln zu erzeugen.

Inkubieren Sie die Kapseln fünf Minuten lang in gepufferter Kochsalzlösung mit 10 Millimolar EDTA. Die EDTA-behandelten Kapseln werden als Hohlkapseln verwendet. Inkubieren Sie die verkapselten Zellen bei 75 U/min mit Schütteln bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 10 Tage nach der Inkubation, sammeln und inkubieren Sie die Kapseln in 10 Millimolar EDTA bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 10 Minuten.

Sammeln Sie die Zellen aus den Alginatkapseln ohne Polylycin-Behandlung durch Zentrifugation bei 1000-fachem G für drei Minuten. Wenn Alginatkapseln mit Poly-L-Lysin behandelt werden, brechen Sie die Alginat-Poly-L-Lysinmembran auf, indem Sie mit einer Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, etwa 10 Mal auf und ab pipettieren. Der Nadeldurchmesser sollte kleiner als die Kapselgröße sein, und in diesem Experiment werden 25-Gauge-Nadeln verwendet.

Nach der Zentrifugation bei 1000 bis 5.000 G für fünf Minuten ist das Zellpellet ausschließlich aus gebrochenen Alginat-Poly-L-Lycin-Membranen zu entnehmen. Wenn mRNA-Proben aus Zellen entnommen werden, ist zu beachten, dass verbleibende Alginat-Poly-L-Lycin-Membranen die mRNA-Aufreinigung verhindern können, wie sie von einer Hochgeschwindigkeitskamera sichtbar gemacht wird. Die ausgestoßene Alginatlösung bildet unmittelbar nach der Austreibung eine kugelförmige Form. Wird die Suspension mit einem Stickstoffdurchfluss von weniger als einem Liter pro Minute ausgestoßen, ist die Größe der Tröpfchen gleichmäßig.

Ist der Stickstofffluss jedoch höher als ein Liter pro Minute, zerfällt das Tröpfchen und die Größe der Tröpfchen wird heterogen. Angesichts dessen ist es schwierig, mit dieser Methode Tröpfchen mit einer Größe von weniger als 500 Mikrometern herzustellen. Beim Gelieren bilden Natriumalginattröpfchen kugelförmige Calciumalginatkapseln in Calciumchloridlösung.

Wenn die Konzentration von Natriumalginat jedoch hoch genug ist, führt eine niedrige Konzentration von Natriumalginat zu Nons, kugelförmigen und Nonoo-Form von Kapseln, die ein Problem im Codierungsprozess haben. Auch wenn die Natriumalginatkonzentration nicht ausreicht, können durch Erhöhung der Kalziumkonzentration kugelförmige Kapseln gebildet werden. Etwa 50 Millimolar Calciumchlorid sind jedoch für die Verkapselung geeignet, da eine zu hohe Konzentration von Calciumchlorid das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit verringert.

In den Kapseln können verkapselte Zellen wachsen, aber in Kapseln ohne die Alginat-Poly-L-Lysin-Beschichtung kann es zu Zellleckagen kommen. Bei IPS-Zellen der Maus bilden die Zellen in jeder Calciumalginatkapsel scheibenförmige Aggregate, während die Zellen verklumpen und in jeder Hohlkapsel einzelne kugelförmige Aggregate bilden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen verkapselt und kultiviert, um die Größe zu kontrollieren.

Wasserstoff wird ohne spezielle Ausrüstung abgeschieden, kein organisches Absorptionsmittel.