Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Stammzellen sicher und effektiv in Alginate-Hydrogelkapseln einzubetten und sie innerhalb der Kapseln zu kultivieren, um Aggregation und Mikroumgebung zu kontrollieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine gefilterte Stammzell-Suspension mit einer Natriumalginate-Lösung vermischt wird. Das Gemisch wird anschließend in eine Spritze überführt, und eine koaxiale Düse wird an der Spritze angebracht, bevor diese auf einer Spritzenpumpe positioniert wird. Danach werden die Tropfen erzeugt, indem die Zellsuspension unter gleichzeitigem Durchfluss von Stickstoffgas ausgestoßen wird, gefolgt von der Sammlung und Zugabe einer Calciumchloridlösung.

Anschließend werden die Kapseln mit Poly-L-Lysin behandelt, um einen zellulären Austritt zu verhindern, und mit EDTA, um das Innere der Kapseln zu fluidisieren, bevor die eingeschlossenen Zellen unter rotierenden Schüttelbedingungen kultiviert werden. Schließlich werden die Zellen durch EDTA und mechanische Zerstörung der Membran aus den Kapseln gewonnen. Letztendlich verhindert die Alginateinschließung von pluripotenten Stammzellen, dass sich die Zellen übermäßig aggregieren, und begrenzt die Scherkräfte, denen die Zellen in Suspensionkultur ausgesetzt sind.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im biologischen und biomedizinischen Bereich beantworten, beispielsweise zur großflächigen Expansion von Zelltransplantationen und zur Erforschung der Stammzellnische. Beginnen Sie die Zellkapselung, indem Sie die Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll sammeln, nachdem Sie sie drei Minuten lang mit 160 × g zentrifugiert haben. Waschen Sie das Pellet der induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPS-Zellen durch Resus, indem Sie die Zellen in gehäufte gepufferte Salzlösung suspendieren und nach Resus dreimal zentrifugieren, wobei Sie die Zellen erneut in gehäufte gepufferte Salzlösung suspendieren.

Filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen Zellsieb mit 40 Mikrometer, um große Aggregate zu entfernen, die andernfalls die Düse verstopfen könnten. Anschließend mischen Sie zwei Milliliter gefilterte Zellsuspension mit drei Millilitern einer 5%igen Natriumalginatlösung. Um eine fünf Milliliter umfassende Zellsuspension in 3%igem Natriumalginat zu erhalten, muss die Zelldichte mehr als eine Million Zellen pro Milliliter betragen.

Nachdem die Zellsuspension in einer Fünf-Milliliter-Spritze gesammelt wurde, befestigen Sie eine koaxiale Düse an der Spritze und stellen Sie diese auf eine Spritzenpumpe. Leiten Sie einen Stickstoffgasstrom durch die äußere Nadel der koaxialen Düse und pressen Sie die Zellsuspension durch die innere Düse. Sammeln Sie die Tropfen in 250 Milliliter 0,5%iger Calciumchloridlösung und warten Sie 10 bis 20 Minuten unter Rühren bei 60 bis 90 U/min auf die Gelierung. Nach dem Waschen mit gepufferter Salzlösung werden die gesammelten Kapseln als nackte Kapseln verwendet, um die Kapseln zu behandeln, indem man Calciumalginatkapseln in 0,05 % Gewicht pro Volumen inkubiert.

Poly-L-Lysin-Lösung fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid unter Schütteln. Nach dem Sammeln der Kapseln in einem Reagenzglas und Waschen mit gepuffertem Salzlösungspüler inkubieren Sie diese in DMEM, das 10 % FBS enthält. Um die elektrische Ladung auf ihrer Oberfläche zu neutralisieren, verwenden Sie die resultierenden Kapseln als beschichtete Kapseln zur Herstellung hohler Kapseln.

Inkubieren Sie die Kapseln in gepuffertem Salzlösung mit 10 Millimolar EDTA für fünf Minuten. Die mit EDTA behandelten Kapseln werden als hohle Kapseln verwendet. Inkubieren Sie die verkapselten Zellen bei 75 U/min unter Schütteln bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 10 Tage. Nach der Inkubation sammeln Sie die Kapseln und inkubieren sie für 10 Minuten in 10 Millimolar EDTA bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Sammeln Sie die Zellen aus den Alginate-Kapseln ohne Poly-L-Lysin-Behandlung durch Zentrifugation bei 1.000 × g für drei Minuten. Falls die Alginate-Kapseln mit Poly-L-Lysin behandelt wurden, brechen Sie die Alginate-Poly-L-Lysin-Membran auf, indem Sie sie etwa 10-mal mit einer an eine Spritze angebrachten Nadel auf- und abpipettieren. Der Nadel-Durchmesser sollte kleiner als die Kapselgröße sein; in diesem Experiment werden 25-Gauge-Nadeln verwendet.

Nach der Zentrifugation bei 1.000 bis 5.000 × g für fünf Minuten sammeln Sie das Zellpellet streng von gebrochenen Alginate-Poly-L-Lysin-Membranen. Wenn mRNA-Proben aus Zellen gewonnen werden, beachten Sie, dass verbleibende Alginate-Poly-L-Lysin-Membranen die mRNA-Reinigung behindern können, wie durch eine Hochgeschwindigkeitskamera sichtbar gemacht werden kann. Die ausgestoßene Alginate-Lösung bildet unmittelbar nach der Ausscheidung eine kugelförmige Gestalt. Wenn die Suspension mit einer Stickstoffströmungsrate von weniger als einem Liter pro Minute ausgestoßen wird, ist die Größe der Tröpfchen einheitlich.

Wenn jedoch der Stickstoffstrom höher als ein Liter pro Minute ist, zerfällt der Tropfen und die Größe der Tropfen wird heterogen. Daher ist es schwierig, mit dieser Methode Tropfen herzustellen, die kleiner als 500 Mikrometer sind. Im Gelierprozess bilden Natriumalginat-Tropfen kugelförmige Calciumalginat-Kapseln in Calciumchloridlösung.

Wenn die Konzentration von Natriumalginat jedoch hoch genug ist, führt eine niedrige Konzentration von Natriumalginat zu nichtkugelförmigen und unregelmäßigen Kapseln, die Probleme im Kodierungsprozess verursachen. Selbst wenn die Natriumalginatkonzentration nicht ausreicht, können kugelförmige Kapseln durch Erhöhung der Calciumkonzentration gebildet werden. Dennoch ist eine Konzentration von etwa 50 Millimolar Calciumchlorid für die Einschließung geeignet, da eine zu hohe Konzentration von Calciumchlorid das Zellwachstum und die Zellviabilität verringert.

Eingeschlossene Zellen können in den Kapseln wachsen, jedoch kann ein Austritt der Zellen bei Kapseln ohne die Alginate-Poly-L-Lysin-Beschichtung auftreten. Im Fall von mausartigen iPS-Zellen bilden die Zellen scheibenförmige Aggregate in jeder Calcium-Alginat-Kapsel, während sie zusammenklumpen und in jeder hohlen Kapsel einzelne sphärische Aggregate bilden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen eingeschlossen und in der Kultur bezüglich ihrer Größe kontrolliert werden können.

Wasserstoff wird ohne spezielle Ausrüstung und ohne organischen Absorber gebunden.