Name: Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Erfahren Sie Calcium-Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur Messung intrazellulärer Calciumkonzentrationen in Podozyten frisch isolierter Glomeruli. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analyse einzelner Ionenkanäle.

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Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopie Experimente danken. Gregory Blass ist für kritische Korrekturlesen des Manuskripts anerkannt. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschuss HL108880 und American Diabetes Association unterstützt gewähren 1-15-BS-172 (als), und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

Tierversuche und Tierschutz sollte auf die NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren folgende Protokolle überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt einzuhalten. 1. Kidney Flush <ol><li> Verwenden Sie 8 bis 12 Wochen alte männliche Ratten (empfohlen ist ein Stamm Sprague Dawley, aber andere Stämme von unterschiedlichen Alters und Geschlechts mit entsprechenden Änderungen verwendet werden). </li><li> Betäuben das Tier nach dem Verfahren von IACUC Protokoll erlaubt; Narkosetiefe zu überwachen und zu kontrollieren das Tier. Die detaillierte Beschreibung der Operation in 1.3 durchgeführt werden - 1.8 kann in Ilatovskaya et al 7. </li><li> Nach entsprechender Anästhesie, legen Sie das Tier auf einem temperaturgesteuerten Operationstisch, einen Mittellinienschnitt des Bauches (bis zu 3 cm in der Länge), und entdecken Sie die Hohlvene und die Aorta. </li><li> Legen Ligatur um die Zöliakie und mesenterica superior Arterien und der BauchAorta über denen; nicht zu ligieren. </li><li> Stumpf sezieren der abdominalen Aorta unterhalb der Nierenarterien, und legen Sie zwei Ligaturen um ihn herum, aber nicht unterbinden, dann klemmen die Aorta oberhalb der Ligaturen und binden Sie den Unterfaden. </li><li> Katheterisierung der Aorta mit einer Polyethylen PE50-Schlauch (mit einer Spritzenpumpe mit PBS gefüllt befestigt) unterhalb der Klemme und Fixierung des Katheters mit dem zweiten Ligatur; entfernen Sie die Klammer, schalten Sie die Pumpe und ligieren der Aorta und der Mesenteriallymphknoten mit abdominaler Arterien. Schnell zu machen Einschnitt in Nierenvene, um den Druck zu entlasten. </li><li> Infundieren die Aorta mit vorgekühltem PBS für 2 oder 3 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 6 ml / min. </li><li> Stoppen Perfusion, Verbrauchsteuern und decapsulate 7 die Nieren, und legte sie auf Eis in der PBS-Lösung. Euthanize das Tier nach Protokoll IACUC genehmigt. </li></ol> 2. Isolierung des Ratten-Glomeruli <ol><li> Vorbereitung 30 ml frische Lösung von 5% BSA in RPMI 1640. </li><li> Mit einer Rasierklinge und Scheren,isolieren die Rinde beider Nieren, und dann, bis sie homogen Blatt vor den Mund. Dieses Verfahren wurde zuvor 7 beschrieben. </li><li> Schieben Sie das Gewebe während der vorherigen Schritt Hackfleisch durch ein 100-Mesh-Sieb aus rostfreiem Stahl (in 5% BSA / RPMI-Lösung vorgeweicht) mit einem Spatel. Sammeln Sie die Durchfluss und durch Schwerkraft ermöglicht die Durchfluss um durch ein 140-Mesh-Sieb passieren. </li><li> Filtern Sie die Durchfluss von den 140 mesh Sieb gesammelt unter Verwendung eines vorher eingeweicht 200-Mesh-Sieb, Filtrat verwerfen und waschen Sie die Spitze des Sieb mit 10 bis 15 ml der vorbereiteten BSA / RPMI-Lösung, um den Glomeruli, die auf sedimentieren sammeln das Sieb. </li><li> Legen Sie die BSA / RPMI-Lösung, die Glomeruli auf Eis in einem 15-ml-Tube und lassen Sie die Glomeruli Sediment am Boden des Rohres für bis zu 20 min. Glomeruli Konzentrat auf der Unterseite des Rohres deutlich sichtbar. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, so dass etwa 2 ml in die Röhre. </li></ol> 3. Single-Channel-Patch-Clamp Electrophysiology <ol><li> Bereiten Sie 5 x 5 mm Deckglas-Chips durch Beschichtung mit MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-Lysin, und trocknen lassen. Verwenden Sie ca. 30 &amp; mgr; l 0,01% steril filtriert Lösung in Wasser pro Deckglas. </li><li> Warm up die experimentellen Lösungen für RT und füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer und Pipette. Für TRPC Kanäle Überwachung, verwenden Sie ein Bad-Lösung in mM: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 Glucose, pH 7,4; Pipette: 126 NaCl, 1,5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose; pH 7,4. <ol><li> In Inhibitoren auf die Pipettenlösung, um die Aktivität von endogenen Kanäle, die nicht für die Studien (empfohlen relevanten blockieren: 100 uM Nifluminsäure oder DIDS (auf Ca 2+ -aktivierte Cl blockieren - Kanäle), 10 mM TEA (um das zu verhindern mit großer Leitfähigkeit Ca 2 + - abhängigen K + Kanal), 10 nM Iberiotoxin (um die Ca 2+ -aktivierten K + Kanäle zu blockieren), 10 &amp; mgr; M Nicardipin (N-Typ-Ca blockieren2+ Kanäle)) unmittelbar vor der Patch-Clamp-Experiment. </li></ol></li><li> Vorsichtig mischen die Glomeruli haltigen Lösung, und dann etwa 50 &amp; mgr; l davon gelten für die poly-ʟ-Lysin beschichteten Deckglas-Chips. Lassen Sie die Glomeruli legen für ca. 5 min. </li><li> Verschieben Sie die Glas-Chips mit Glomeruli auf die Patch-Clamp-Kammer mit der Badlösung vorgefüllt; versorgen die Kammer bei einer Rate von 3 ml / min für 1 min, um die Entfernung der ungebundenen Glomeruli gewährleisten. </li><li> Durchführung einer konventionellen Patch-Clamp-Experiment in einem Cell-Attached-Modus 7. Mit einer Glaspipette (7-10 MOhm Pipette Widerstand) einen hochohmigen Dichtung zwischen einer Pipette und Podozyten Membran durch leichten Sog (einer Pipette, eine Podozyten auf der Oberfläche des isolierten Glomeruli angebracht zu bilden, wird in Abbildung 2 dargestellt, auf die linke). </li><li> Für die Cell-Attached-Messungen, Tiefpass die Ströme bei 300 Hz durch einen achtpoligen Bessel-Filter. </li><li> Use isoliert Glomeruli in Patch-Clamp-Experimente für bis zu 4 - 6 Std. Bewahren Sie die Lager Glomeruli Fraktion auf Eis. </li></ol> 4. Ratiometrisch konfokalen Fluoreszenzmessungen von intrazellulären Calciumkonzentration in den Podozyten <ol><li> Platzieren Sie 500 ul der Glomeruli Fraktion (bei 2.5 beschrieben) in 0,5 ml konischen Röhrchen und fügen Kalzium Farbstoffe Fura Red, AM und Fluo-4, AM. Verwenden Sie 2 mm und 1 mm Lager Konzentrationen von Fura Red, AM und Fluo-4, AM, bzw. (bei -20 ° C, gelöst in DMSO) und verwenden Sie 2,5 ul jeder Farbstoff für ein 500 ul Glomeruli Fraktion. Unmittelbar nach der Zugabe der Farbstoffe decken das Röhrchen mit Aluminiumfolie. </li><li> Die Röhrchen auf einem rotierenden Schüttler für mindestens 20 min bis zu 1 h bei RT. Anmerkung: Die pharmakologische Mittel können während dieses Schritts zugegeben werden. </li><li> Bereiten Sie Deckgläser, decken Sie sie mit poly-ʟ-Lysin und trocknen mit beheizten Plattensatz auf 70 ° C. </li><li> Sobald die Beladung des Calcium Farbstoffe completE gelten 100 ul der Glomeruli enthaltenden Lösung auf das Poly-ʟ-Lysin beschichtete Deckgläser und ließ sie an der Oberfläche für etwa 5 min zu haften. Halterung Glomeruli losen Deck in eine Abbildungskammer und Perfusion mit dem Bad-Lösung (enthaltend (in mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7,35) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml / min zu entfernen die ungebunden Glomeruli und die verbleibenden Farbstoffe. </li><li> Stellen Sie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 488 nm Anregungswellenlänge und Emissionsfiltern (525/25 und 650/25 nm für Fluo-4 und Fura Red, respectively). Legen Sie die Imaging-Software auf eine gewünschte Frequenz und Auflösung. </li><li> Finden Sie die Glomeruli in Hellfeld und dann auf der Detektion des Fluoreszenzsignals zu drehen. Einstellen der Intensität des Laserstrahls für jeden Farbstoff, um die Sättigung des Signals zu vermeiden. Wählen der Brennebene mit den podocytes die direkt auf das Glas angebracht sind. Dies minimiert den Effekt, der durch Kontraktion eines Glomerulus verursacht in Reaktion auf ArzneimittelAnwendung. Überprüfen Sie, dass die Glomeruli der Wahl ist gut an das Glas gebunden ist; </li><li> Starten Sie die Abbildung der Brennebene der Wahl (nehmen 512 x 512 Bilder mit der Frequenz bei 4 s eingestellt, um schnelle Ca 2+ vorübergehende Veränderungen sichtbar zu machen. Verwenden Sie einen 60X / NA 1.4 oder ähnliche Objektiv für hochauflösendes Bild) gelten Drogen von Interesse, und notieren Sie die Antwort. <ol><li> Wählen einer gewünschten Fokusebene (möglichst nahe an der Oberfläche des Glases als möglich zu Bildgebung podocytes auf der Oberfläche des Glomerulus zu gewährleisten). Überprüfen Sie die Intensität der Fluoreszenz auf der Fluo4 und FuraRed Kanäle und stellen Sie sicher, dass die Glomerulus ist eindeutig in Hellfeld gesehen. </li><li> Starten Bildgebung. Vor der Anwendung von Drogen, Rekord mindestens 1 min von Fluoreszenzbasis, um sicherzustellen, dass das Signal stabil ist (es gibt keine plötzlichen Spitzen oder Verblassen des Signals). </li><li> Gelten gewünschten Medikamente mit Hilfe einer Mikropipette; vorsichtig sein und sicherstellen, das Medikament in der Lage, gut diffundieren und erreichen die glomerUlus. Mischen Sie die Badlösung vorsichtig, wenn nötig, die Überwachung der ausgewählten Brennebene und überprüfen Sie, dass es nicht aus dem Fokus wegen der Medikamentenapplikation zu bewegen. </li><li> Aufzeichnung der Änderungen der Fluoreszenzintensität für die Fluo4 und FuraRed Signalen. Achten Sie darauf, die Aufnahme ist lang genug, um zu warten, bis das Signal den Plateauniveau erreicht oder einen Spitzenwert erreicht und kehrt zum Ausgangswert dann. Führen Lösung Änderung oder Ergänzung von irgendwelchen anderen Drogen, wenn nötig. </li><li> Beenden Sie die Aufnahme, und speichern Sie die Datei im nativen Format der Software. </li></ol></li></ol> 5. Bildanalyse für die Calcium-Messungen <ol><li> Führen Sie die Bildanalyse mit dem ImageJ offene Software mit dem ND-Dienstprogramm-Plugin, das Importieren von Bildern in der nativen ND2-Format ermöglicht. </li><li> Importieren Sie die Bildsequenz; stellen Sie sicher, um die Kanäle aufgeteilt und mit einem Hyperstack-Graustufen-Modus. </li><li> Folgen Sie dem Analysieren → Werkzeuge → ROI Manager Pfad im ImageJ Software oStift ein ROI-Manager-Fenster. Wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse (Podozyten) mit einem ovalen Auswahlwerkzeug und die &quot;hinzufügen (t)&quot; Funktion in der ROI-Manager. Als das letzte ROI, wählen Sie den Bereich, in den Hintergrund; speichern Sie die ausgewählten ROIs (Mehr → Speichern). </li><li> Markieren Sie das Fenster mit der für die Analyse ausgewählten Kanal. Verwenden Sie die Optionen → Multi Funktion Messen in der ROI-Manager, markieren Sie die &quot;eine Zeile pro Scheibe&quot;-Box in der Dialog, der herausspringt, und klicken Sie dann auf OK. Die Ergebnisse werden in dem Format, das sich im Ergebnisfenster eingestellt werden kann gezeigt werden: in die Menüoption Ergebnisse → Set Maße geben, wählen Sie &quot;Mittlerer Grauwert&quot; und berechnen die Pixelintensitätswerte für jede ROI, die in der angezeigt wird, Ergebnisfenster in separaten Spalten für jede ROI. </li><li> Kopieren Sie die gemessenen ROI Intensitätswerte für jeden Kanal (Fluo-4 und Fura Red) in bevorzugten Datenanalyse-Software; subtract Hintergrund Intensitätswerte von jedem datein Punkt. </li><li> Für jeden Zeitpunkt wird das Verhältnis der Intensitäten des Fluo-4 zu Fura Red-Kanälen. Plot Scatter / Linienpunkt-Zeitänderungen von Ca 2+ Transienten für jede ROI. Berechnen Sie Mittelwert / SE Werte für ausgewählte Glomeruli. Hinweis: Zeitspalte sollte nach Bildgebungsfrequenz bei 4,5 ausgewählt eingestellt werden. </li></ol> 6. intrazellulären Calciumkonzentration Berechnungen mit Fluo-4 Fluoreszenz-Signal <ol><li> Nehmen Sie eine Probe der Glomeruli und führen Sie die experimentelle Protokoll bis zu Schritt 4.7. Nach der Aufnahme der Hintergrundfluoreszenz hinzufügen Ionomycin (Endkonzentration in der Badewanne Kammer sollte 10 &amp; mgr; M) zu der Badlösung und Rekordfluoreszenzintensität zu erhöhen. Sobald die Intensität erreicht sein Maximum und der Zerfall beginnt, fügen MnCl 2 (Endkonzentration sollte 5 mM), die Fluoreszenz 8 quenchen. </li><li> Analysieren Sie die in 6.1 erhaltenen Daten. Kopieren Sie die Fluo-4-Signal ROI Intensitätswerte erhalten nachzu der am 5.1 Protokoll - 5,5 von bevorzugten Analysesoftware. </li><li> Berechnen intrazellulären Calciumkonzentration (in nM) in der podocyte entsprechend dem ROI durch eine Formel: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> wobei K d ein vorbestimmter Dissoziationskonstante für Fluo-4 (345 nM) konstant ist F die Intensität an dem Zeitpunkt, dass man die Berechnung werden die Calciumkonzentration (Grundlinie) und F min und F max die Intensitätswerte bei der Punkt maximaler Calciumlast (nach Ionomycin Anwendung) und nach Löschung der Fluoreszenz (mit MnCl 2), bzw. (siehe Abbildung 3). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht die Analyse von Calcium Handhabung durch den Podozyten der Glomeruli Nagetier. Diese Technik ermöglicht die Anwendung der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Einzelkanal-Fluoreszenz ratiometrische konfokale Bildgebung. Jedoch beide Ansätze können einzeln, für sich allein verwendet werden. Das vorgeschlagene Protokoll hat mehrere relativ einfache Schritte, einschließlich 1) Nieren flush; 2) Isolierung der Glomeruli durch Differential Sieben; 3) Durchführen von Patch-Clamp-elektrophy...

Nieren halten homöostatischen Gleichgewicht für verschiedene Stoffe und Regulierung des Blutvolumens in einer Weise, die Gesamtblutdruck bestimmt. Störungen der Nierenfiltration, Resorption oder Sekretion führen zu begleiten oder pathologische Zustände, die von Hyper- oder Hypotonie, um Nierenerkrankungen im Endstadium, die schließlich erfordert Nierentransplantation beenden. Die Nieren-Filtereinheit (Glomerulus) besteht aus drei Schichten - die Kapillarendothel, Basalmembran und eine Einzelzellschicht von Epithelzellen - Podozyten, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Spaltmembran Integrität und Funktion 1 zu spielen. Dysfunktion bei permselektiven glomerulären Filter verursacht Urinverlust von Makromolekülen, wie Proteinurie. Verschiedene Mittel können die Struktur der podocytes und deren Fuß Verfahren, die die Integrität der Glomeruli Filtrationsbarriere bestimmen beeinflussen. Die podocytes in der Aufrechterhaltung der glom beteiligtenEruli Filterfunktion. Es wurde festgestellt, dass Fehlcalcium Handhabung durch den podocyte führt zu Zellschäden und spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der verschiedenen Formen von Nephropathien 2,3. Daher ist die Entwicklung eines Modells, das für die direkte Messung der intrazellulären Calciumkonzentration Veränderungen ermöglicht wird entscheidend für die Untersuchung der Podozyten Funktion sein. Isolated Glomeruli waren zuvor in einer Vielzahl von Studien, einschließlich Messung der Albuminreflexionskoeffizient ändert 4 und Beurteilung des integralen Zellströme in den Ganzzellelektrophysiologische Patch-Clamp-Messungen 5,6 verwendet. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir das Protokoll, das die Forscher ermöglicht, intrazelluläre Calcium-Konzentration sich in Abhängigkeit von Anwendungen von pharmakologischen Mitteln zu messen, abzuschätzen Basalniveaus von Calcium in den Zellen und zu beurteilen einzelnen Calciumkanäle Aktivität. Ratometric Calciumkonzentration Messungen und Patch-Clamp-electrophysiology wurden verwendet, um Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration innerhalb des podocyte und Kanalaktivität zu bestimmen sind.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic-Säure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>Lösung</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchrotator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Deutschland</td></tr><tr><td>Nikon-Konfokalmikroskop (invertiert)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Laseranregung 488 nm. Emissionsfilter 500–550 nm und 570–620 nm</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1,4 Öl</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Silikonverbindung</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Aufzeichnungs-/Perfusionskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg;-System</td></tr><tr><td>Tiefpassfilter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8-Pol-Bessel</td></tr><tr><td>Borsilikatglas-Kapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown-Typ Mikropipettenzieher</td></tr><tr><td>Mikroschleuder</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>motorisierter Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovibrationsisolationsplatte</td><td>TMC</td><td></td><td>ausgestattet mit Faradayscher Käfig</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Ventil-Perfusionssystem</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Aufzeichnungs-/Perfusionskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Nifluminsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA-Chlorid</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>ohne Antibiotika</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30 % Albuminlösung</td></tr><tr><td>temperaturgesteuerter Operationsplatz</td><td>MCW core</td><td></td><td>für Nagetiere</td></tr><tr><td>Stahlsiebe:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>Netz 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>Sieb für CD-1</td></tr><tr><td>Stereo-Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionssystem mit Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Anästhesie</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Weitere grundlegende Reagenzien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einkanal-analyse und calcium imaging in den podozyten der frisch isolierten glomeruli

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podozyten (renale glomeruläre Epithelzellen) sind dafür bekannt, die glomeruläre Permeabilität zu regulieren und die glomeruläre Struktur zu erhalten; eine Schlüsselrolle für diese Zellen in der Pathogenese verschiedener Nierenerkrankungen wurde etabliert, da eine Podozytenschädigung zu Proteinurie und einer Auslöschung des Fußfortsatzes führt. Es wurde bereits berichtet, dass verschiedene endogene Wirkstoffe eine dramatische Überlastung der intrazellulären Ca2+-Konzentration in Podozyten verursachen können, was vermutlich zu Albuminurie führt, und dies geschieht wahrscheinlich über kalziumleitende Ionenkanäle. Daher erschien es wichtig, den Umgang mit Kalzium in den Podozyten sowohl unter normalen Bedingungen als auch in verschiedenen pathologischen Zuständen zu untersuchen. Die verfügbaren experimentellen Ansätze blieben jedoch etwas auf kultivierte und transfizierte Zellen beschränkt. Obwohl sie ein gutes Basismodell für solche Studien darstellen, werden sie im Wesentlichen aus der natürlichen Umgebung des Glomerulus extrahiert. Hier beschreiben wir die Methodik der Untersuchung von Podozyten als Teil des frisch isolierten ganzen Glomerulus. Dieses Präparat behält das funktionelle Potenzial der Podozyten bei, die noch an den Kapillaren befestigt sind; Daher verbleiben Podozyten in der Umgebung, in der die größten Teile des Glomeruli-Filtrationsapparates konserviert werden. Das vorliegende Manuskript befasst sich mit zwei experimentellen Ansätzen, die es ermöglichen, 1) Änderungen der Kalziumkonzentration mit Hilfe der ratiometrischen konfokalen Fluoreszenzmikroskopie in Echtzeit zu detektieren und 2) die Aktivität der einzelnen Ionenkanäle in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli zu erfassen. Diese Methoden nutzen die Vorteile der nativen Umgebung des Glomerulus, die es den Forschern ermöglichen, akute Veränderungen im intrazellulären Kalziumhandling als Reaktion auf die Anwendung verschiedener Wirkstoffe aufzuklären, die basale Konzentration von Kalzium in den Zellen zu messen (z. B. um das Fortschreiten der Krankheit zu bewerten) und die Kalziumleitfähigkeit auf der Ebene einzelner Ionenkanäle zu beurteilen und zu manipulieren.

Hier haben wir uns mit dem Problem der Messung der akuten Veränderungen der Calciumspiegel in den podocytes. 1 zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Protokolls, um eine hohe Auflösung Live Fluoreszenz konfokale Bildgebung und Einzelionenkanalaktivität in den Aufnahmen podocytes des frisch zuführen entworfen isoliert Nagetier Glomeruli. Kurz nachdem die Ratte betäubt, die Nieren sollten mit PBS gespült werden, um sie von Blut zu löschen. Dann werden die Nieren herausgeschnitten und entk...

Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels in den Podozyten sind eines der wichtigsten Mittel, um die Filtrationsfunktion von Glomeruli zu kontrollieren. Hier erklären wir einen Hochdurchsatz-Ansatz, der es ermöglicht, die Kalziumhandhabung und die Aktivität einzelner Ionenkanäle in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli in Echtzeit zu detektieren.

Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration als Reaktion auf pharmakologische Substanzen zu messen. Dabei werden die basalen Kalziumspiegel geschätzt und die Aktivität einzelner Kanäle in den Podocyten im Rahmen des gesamten frisch isolierten Glomerulus bewertet. Dies wird erreicht, indem zunächst das Blut aus den Ratten-Nieren durch Spülen über die Aorta abdominalis entfernt wird.Anschließend werden die Nieren entnommen, die Nierenrinde isoliert und mit einem Rasiermesser zerkleinert. Im dritten Schritt werden die kortikalen Glomeruli durch differentielles Zentrifugieren isoliert. Danach können die isolierten entkappten Glomeruli entweder elektrophysiologischen Experimenten unterzogen oder mit fluoreszenten Farbstoffen beladen und für konfokale Kalziumkonzentrationsmessungen verwendet werden.Letztlich ermöglichen diese Verfahren es Forschern, akute Veränderungen der intrazellulären Kalziumregulation in Reaktion auf die Applikation verschiedener Substanzen aufzuklären und die Kalziumleitfähigkeit auf Ebene einzelner Ionenkanäle zu bewerten und gezielt zu beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Podocyten als Teil des gesamten isolierten Glomerulus untersucht werden können. Unsere Präparation erhält das funktionelle Potenzial der Podocyten.Sie verbleiben an den Kapillaren angeheftet und beteiligen sich an der Homöostase in der Umgebung, die tatsächlich die Hauptanteile der Glomeruli-Filtrationsapparatur erhält. Die Anwendung dieser Technik erweitert unsere pharmakologische Untersuchung. In normalen und pathologischen Zuständen spielt der Kalziumhaushalt in den Podocyten eine wesentliche regulatorische Rolle bei der Entstehung und Verhinderung von Nierenkomplikationen bei Erkrankungen wie diabetischer Nephropathie, fokaler segmentaler Glomerulosklerose oder Hypertonie. Es ist von großer Bedeutung, die Reaktion des Kalziumeinstroms in diesen Zellen auf Medikamente zu beobachten, die leicht untersucht werden können.In dieser Vorbereitung demonstriert VLA Hunka, wie die Niere für die folgenden Verfahren gespült wird. Ich zeige die Isolierung der Glomeruli und die V-Clamp-Elektrophysiologie, und Dr. GaN führt Sie durch die konfokale Kalzium-Bildgebung. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine anästhesierte Ratte auf den temperaturgeregelten Operationstisch. Machen Sie unter dem Mikroskop einen medianen Schnitt im Bauchbereich, um die Vena cava und die Aorta freizulegen.Als Nächstes die Ligatur um die Arteria coeliaca, die Arteria mesenterica superior und die Aorta abdominalis oberhalb dieser legen. Die Aorta abdominalis unterhalb der Nierenarterien stumpf dissezieren. Anschließend zwei Ligaturen darum platzieren, jedoch nicht abbinden.Klemmen Sie die Aorta oberhalb der Ligaturen und binden Sie den unteren Faden fest. Danach katheterisieren Sie die Aorta mit einem Polyäthylen-Schlauch, der an eine Spritzenpumpe mit PBS unterhalb der Klemme angeschlossen ist, und fixieren Sie den Katheter mit einer zweiten Ligatur. Entfernen Sie anschließend die Klemme und ligieren Sie die Stelle. Me enterische und zöliakale Arterien. Spülen Sie die Aorta drei Minuten lang mit vorab gekühlter PBS mit einer Geschwindigkeit von sechs Milliliter pro Minute aus. Gleichzeitig wird ein Schnitt in die Vena cava in der Nähe der Nierenvenen gemacht, um den Druck zu entlasten.Nach drei Minuten stoppen Sie die Perfusion, entnehmen und umhüllen Sie die Nieren. Legen Sie sie in PBS-Lösung auf Eis. Bereiten Sie nun 30 Milliliter frisches 5% BSA in RPMI 1640 Medium vor.Isolieren Sie mit einem Rasiermesser und einer Schere die Rinde beider Nieren und homogenisieren Sie diese anschließend mit einem Mörser und Stößel. Danach pressen Sie das zerkleinerte Gewebe durch ein 100-Maschen-Edelstahlsieb, das zuvor in einer 5%igen P-S-A-R-P-M-I-Lösung vorbenetzt wurde. Sammeln Sie den Durchlauf und lassen Sie ihn durch ein 140-Maschen-Sieb passieren.Filtern Sie anschließend die gesammelte Durchflüssung durch das 140er-Sieb mit einem vorbenetzten 200er-Sieb. Verwerfen Sie das Filtrat und waschen Sie das obere Sieb mit 10 bis 15 Milliliter der zubereiteten B-S-A-R-P-M-I-Lösung, um die Glomeruli von der Oberseite des Siebs zu sammeln. Danach geben Sie die B-S-A-R-P-M-I-Lösung, die G-Glomeruli enthält, in ein 15-Milliliter-Zweikammer-Eis und lassen die Glomeruli bis zu 20 Minuten lang am Boden des Gefäßes sedimentieren.Bei diesem Verfahren beschichten Sie fünf mal fünf Millimeter große Deckgläser mit Poly-Lysin der Molekularmasse 70.000 bis 150.000 und trocknen sie auf einer beheizten Platte. Danach erwärmen Sie die experimentellen Lösungen auf Raumtemperatur und füllen die Patch-Clamp-Kammer sowie die Pipette. Vorsichtig mischen Sie die Lösung, die Glomeruli enthält. Anschließend geben Sie etwa 50 Mikroliter dieser Lösung auf jedes polylysingebundene Deckglas.Anschließend überführen Sie die Glaschips mit den Glomeruli in die Patch-Clamp-Kammer, die vorab mit der Beth-Lösung gefüllt wurde. Spülen Sie die Kammer eine Minute lang mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute durch, um nicht angeheftete Glomeruli zu entfernen, bevor Sie die konventionelle Patch-Clamp-Aufnahme im zellangehefteten Modus durchführen.Geben Sie nun 500 Mikroliter der Glomeruli-Fraktion in je eine 0,5-Milliliter-Konustube und fügen Sie die Calcium-Farbstoffe Pure Red AM und Fluoh 4:00 AM hinzu. Stellen Sie anschließend die Tubes auf einen rotierenden Schüttler und lassen Sie sie bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Glas-Deckgläser mit Polylysin vor und lassen Sie sie auf der beheizten Platte bei 70 Grad Celsius trocknen. Sobald die Beladung mit den Calcium-Farbstoffen abgeschlossen ist, geben Sie 100 Mikroliter der Glomeruli-haltigen Lösung auf die mit Polylysin beschichteten Deckgläser und lassen Sie diese etwa fünf Minuten lang an der Oberfläche haften.Danach montieren Sie die mit Glomeruli besetzten Deckgläser in eine Messkammer und spülen sie mit einer Badlösung mit einer Geschwindigkeit von drei Milliliter pro Minute, um nicht angeheftete Glomeruli und restliche Farbstoffe zu entfernen. Anschließend stellen Sie das konfokale Laserscanningmikroskop auf eine Anregungswellenlänge von 488 Nanometern ein. Danach stellen Sie die Bildaufnahmesoftware auf die gewünschte Frequenz und Auflösung ein.Als Nächstes finden Sie die Glomeruli im Hellfeld. Schalten Sie anschließend die Detektion des Fluoreszenzsignals ein. Danach wählen Sie eine gewünschte Fokusebene aus und überprüfen die Intensität der Fluoreszenz in den Kanälen für Flu oh vier und Firo Rot.Stellen Sie sicher, dass die Glomeruli im Hellfeld deutlich sichtbar sind. Nehmen Sie dann die Änderungen der Fluoreszenzintensität für die Fluorescein- und Furo-Rot-Signale auf. Um die Bildsequenz zu importieren, trennen Sie die Kanäle und verwenden Sie den Hyperstack-Graustufenmodus.Öffnen Sie in der ImageJ-Software ein Fenster für den ROI-Manager über die Analysewerkzeuge und den Pfad ROI-Manager. Wählen Sie mithilfe des ovale Auswahl-Werkzeugs ein oder mehrere Regionen von Interesse aus und fügen Sie diese mit der Funktion „Add“ (Hinzufügen) im ROI-Manager hinzu. Wählen Sie anschließend einen Bereich im Hintergrund aus und speichern Sie die ausgewählten ROIs.Markieren Sie anschließend in der Dialogbox je Slice eine Zeile und klicken Sie im Menü auf „OK“. Legen Sie die Messungen fest. Wählen Sie den mittleren Grauwert aus und berechnen Sie die Pixelintensitätswerte für jede ROI, die im Ergebnisfenster in separaten Spalten angezeigt werden.Kopieren Sie für jede ROI die gemessenen Intensitätswerte der ROI für jeden Kanal in die bevorzugte Datenanalyse-Software und subtrahieren Sie die Hintergrundintensitätswerte von jedem Datenpunkt für jeden Zeitpunkt. Berechnen Sie danach das Intensitätsverhältnis von flu oh four zu URA red und tragen Sie die zeitlichen Veränderungen des Kalziumtransienten für jede ROI auf. Dieses Bild zeigt die Patch-Clamp-Pipette, die an dem Oxidkörper an der Oberfläche des Rattenglomerulus befestigt ist.Während einer elektrophysiologischen Ableitung ist ein Teil eines verkapselten Glomerulus in der rechten unteren Bildecke sichtbar. Hier ist eine repräsentative Stromspur der tripy-ähnlichen Kanalaktivität aus einer an die Podocytenzelle angelegten Patch-Clamp-Messung zur Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Die Glomeruli wurden mit Fluoh 4:00 AM beladen, um das intrazelluläre Kalzium zu markieren.Dieses Video veranschaulicht die Wirkung von CIN und Manganchlorid auf den Calciumeinstrom in den Glomeruli. Dieses Diagramm quantifiziert die Änderungen der Fluoreszenzsignalintensität, die von einem einzelnen Podocyten als Reaktion auf CIN und Manganchlorid aufgezeichnet wurden. Wie erwartet führt CIN zur maximalen Fluoreszenz, während Manganchlorid den Farbstoff löscht und zu der geringsten Fluoreszenzintensität führt.Die Anwendung dieser Wirkstoffe ermöglicht es dem Forscher, später die exakte Kalziumkonzentration innerhalb der Zelle zu bestimmen. Dieses Video zeigt die Wirkung von 10 µmol TP auf die Kalziumkonzentration in den Glomeruli. Beachten Sie den Anstieg der grünen Fluoreszenz von FluO-4 und den Rückgang der roten Fluoreszenz von FuRed, was auf eine erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration hinweist.Diese Technik bietet eine einzigartige Gelegenheit, Veränderungen des Kalziumeinstroms auf Ebene einzelner Ionenkanäle und einzelner Zellen nach pharmakologischen Behandlungen oder anderen Manipulationen zu überwachen. Daher stellt dieser Ansatz ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug dar, insbesondere angesichts der Vielzahl verfügbarer genetisch veränderter Nagetiermodelle. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Kalziumionsmessungen in den Podocyten durchgeführt werden, ebenso wie der elektrophysiologischen Methoden, einschließlich der Spannungs- und Stromklemme, die entweder allein oder in Kombination angewendet werden.Diese Techniken ermöglichen einen detaillierten und mechanistischen Einblick in die Regulation des Calciumhaushalts in Podocyten unter normalen und pathologischen Bedingungen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

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Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert.

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Ionenkanäle in renale tubuläre Epithel ausgedrückt spielen eine bedeutende Rolle in der Pathologie der polyzystischen Nierenerkrankung. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle verwendet, um Patch-Clamp-Analyse und intrazellulären Calcium-Pegelmessungen in Zystenepithel frisch aus Nagetier Nieren getrennt durchzuführen.

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Ziel dieses Protokolls ist es, intakte Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens der Maus mittels Vibratomschnitt zu isolieren. Diese Abschnitte können dann für die in situ Ca2+ Bildgebung verwendet werden, um Ca2+ transiente Eigenschaften von Herzschrittmacherzellen und anderen interstitiellen Zellen in Vibratomscheiben aufzuklären.

Isolierung und Bildgebung von live, intakten Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens der Maus durch Vibratom-Schnitte

Die vorgestellte Methode ermöglicht die Visualisierung fluoreszierend markierter zellulärer Proteine mit Erweiterungsmikroskopie, die zu einer Auflösung von 70 nm auf einem herkömmlichen Mikroskop führt.

Bildgebung der podozytischen Proteine Nephrin, Actin und Podocin mit Erweiterungsmikroskopie

Die Zellkalziumbildgebung ist eine vielseitige Methodik zur Untersuchung der dynamischen Signalgebung einzelner Zellen, an gemischten Populationen in Kultur oder sogar an erwachten Tieren, basierend auf der Expression von kalziumdurchlässigen Kanälen / Rezeptoren, die einzigartige funktionelle Signaturen ergeben.

Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

In diesem Artikel wird eine Methode zur quantitativen Echtzeitüberwachung der Calciumionenkonzentration (Ca2+) in Zellen unter Verwendung von Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung mit dem Fura-2/AM-Farbstoff vorgestellt. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Farbstoffbeladung und eine genaue Berechnung des Ca2+ -Gehalts durch Fluoreszenzintensitätsverhältnisse, was sie zu einem einfachen und schnellen Ansatz für Forschungsanwendungen macht.

Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Erfahren Sie Calcium-Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur Messung intrazellulärer Calciumkonzentrationen in Podozyten frisch isolierter Glomeruli. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analyse einzelner Ionenkanäle.

Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

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