Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels in den Podozyten sind eines der wichtigsten Mittel, um die Filtrationsfunktion von Glomeruli zu kontrollieren. Hier erklären wir einen Hochdurchsatz-Ansatz, der es ermöglicht, die Kalziumhandhabung und die Aktivität einzelner Ionenkanäle in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli in Echtzeit zu detektieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die intrazellulären Änderungen der Kalziumkonzentration als Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe zu messen. Schätzen Sie den basalen Kalziumspiegel und beurteilen Sie die Aktivität einzelner Kanäle in den Podozyten als Teil des gesamten frisch isolierten Glomerulus. Dies wird erreicht, indem zuerst Blut aus den Nieren der Ratte entfernt wird, indem über die Bauchaorta gespült wird.

Als nächstes werden die Nieren entnommen und die Nierenrinde isoliert und mit einer Rasierklinge zerkleinert. Im dritten Schritt werden die kortikalen Glomeruli durch differentielles Cing isoliert. Anschließend können die isolierten enthaupteten Glomeruli entweder elektrophysiologischen Experimenten unterzogen oder mit Fluoreszenzfarbstoffen beladen und für konfokale Kalziumkonzentrationsmessungen entnommen werden.

Letztendlich ermöglichen diese Verfahren den Forschern, akute Veränderungen in der intrazellulären Kalziumhandhabung als Reaktion auf die Anwendung verschiedener Wirkstoffe aufzuklären und die Kalziumleitfähigkeit auf der Ebene einzelner Ionenkanäle zu beurteilen und zu manipulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, Podozyten als Teil des gesamten isolierten Glomerulus zu untersuchen. Unser Präparat behält das funktionelle Potenzial der Podozyten bei.

Sie bleiben an den Kapillaren befestigt und nehmen an der Homöostase in der Umgebung teil, die tatsächlich die größten Teile des Glomeruli-Filtrationsapparates konservieren kann. Die Implikation dieser Technik erweitert unser pharmakologisches Screening In normalen und pathologischen Zuständen spielt der Mechanismus der Kalziumbehandlung durch die Podozyten eine wesentliche regulatorische Rolle bei der Entwicklung und Vorbeugung von Nierenkomplikationen bei Krankheiten wie diabetischer Nephropathie, Omerosklerose im Fokalsegment oder Bluthochdruck. Es ist von großer Bedeutung, die Reaktion des Kalziumeinstroms in diesen Zellen auf Medikamente zu beobachten, die leicht gescreent werden können.

In dieser Vorbereitung zeigt VLA Hunka, wie die Niere für die folgenden Verfahren gespült wird. Ich zeige die Glomeruli-Isolierung und die Elektrophysiologie der V-Klemme, und Dr. GaN führt Sie durch die konfokale Kalziumbildgebung. Um diesen Eingriff zu beginnen, legen Sie eine anästhesierte Ratte auf den temperaturgesteuerten Operationstisch. Machen Sie unter dem Mikroskop einen Mittellinienschnitt am Bauch, um die Venen-CVA und die Aorta freizulegen.

Führen Sie anschließend die Ligatur um die Arteria coeliacus und die Arteria mesenterica superior sowie die darüber liegende Bauchschlagader ein. Stumpf die Bauchschlagader unterhalb der Nierenarterien präparieren. Legen Sie dann zwei Ligaturen um ihn herum, aber lizieren Sie nicht.

Klemme die Aorta über die Ligaturen und binde den Unterfaden fest. Danach katheterisieren Sie die Aorta mit einem Polyethylenschlauch, der an einer mit PBS gefüllten Spritzenpumpe unterhalb der Klemme befestigt ist, und fixieren den Katheter mit einer zweiten Ligatur. Entfernen Sie dann die Klemme und ligieren Sie sie.

Ich enterische und Zöliakie-Arterien. Ziehen Sie die Aorta drei Minuten lang mit vorgekühltem PBS mit einer Geschwindigkeit von sechs Millilitern pro Minute auf. Machen Sie gleichzeitig einen Schnitt in der Vene der Cava in der Nähe der Nierenvenen, um den Druck zu verringern.

Stoppen Sie nach drei Minuten die Durchblutung, exzitieren Sie die Nieren und kapseln Sie sie ein. Legen Sie sie in PBS-Lösung auf Eis. Bereiten Sie nun 30 Milliliter frisches 5%BSA in RPMI 1640 Medium vor.

Isolieren Sie mit einer Rasierklinge und einer Schere die Rinde beider Nieren und MIT, bis sie homogen sind. Als nächstes schieben Sie das gehackte Gewebe durch ein 100-mesh-Edelstahlsieb, das in 5%iger P-S-A-R-P-M-I-Lösung eingeweicht wurde. Sammeln Sie den Durchfluss und lassen Sie ihn durch einen 140-Mesh-Siv fließen.

Filtrieren Sie anschließend den gesammelten Durchfluss aus dem 140-Mesh-Sieb mit einem vorgetränkten 200-Mesh-Sieb. Das Filtrat verwerfen und das obere Sieb mit 10 bis 15 Millilitern der vorbereiteten B-S-A-R-P-M-I-Lösung waschen und Glomeruli von der Oberseite des Siebs auffangen. Geben Sie anschließend die G-S-A-R-P-M-I-Lösung, die G Glomeruli enthält, in ein 15 Milliliter großes Eis mit zwei Bons und lassen Sie die Glomeruli bis zu 20 Minuten lang am Boden des Röhrchens sedimentieren.

Bei diesem Verfahren werden fünf mal fünf Millimeter große Deckglassplitter mit einem Molekulargewicht von 70.000 bis 150.000 Polylysin beschichtet und auf einer erhitzten Platte getrocknet. Erwärmen Sie anschließend die experimentellen Lösungen auf Raumtemperatur und füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer und pipettieren Sie die Glomeruli-haltige Lösung vorsichtig. Tragen Sie dann etwa 50 Mikroliter davon auf jeden mit Polylysin beschichteten Deckglaschip auf.

Bewegen Sie danach die Glassplitter mit Glomeruli in die Patch-Klemmkammer. Vorgefüllt mit der Beth-Lösung. Perfusionieren Sie die Kammer eine Minute lang mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute, um alle nicht angeschlossenen Glomeruli zu entfernen, bevor Sie die herkömmliche Patch-Clamp-Aufzeichnung im zellgebundenen Modus durchführen.

Geben Sie nun 500 Mikroliter der Glomeruli-Fraktion in jedes konische 0,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie Calciumfarbstoffe reines Rot am und Grippe oh 4:00 AM hinzu. Legen Sie die Röhrchen anschließend bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur auf einen rotierenden Schüttler. Bereiten Sie dann die Glasdeckgläser mit Polylysin vor und lassen Sie sie auf der erhitzten Platte bei 70 Grad Celsius trocknen. Sobald das Beladen der Calciumstempel abgeschlossen ist, tragen Sie 100 Mikroliter der Glomeruli enthaltenden Lösung auf die mit Polylysin beschichteten Deckgläser auf und lassen Sie sie etwa fünf Minuten lang an der Oberfläche haften.

Montieren Sie dann die an den Glomeruli befestigten Deckgläser auf eine Bildgebungskammer und perfundieren Sie sie mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute, um die nicht befestigten Glomeruli und die restlichen Farbstoffe zu entfernen. Stellen Sie anschließend das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop auf eine Anregungswellenlänge von 488 Nanometern ein. Stellen Sie dann die Bildgebungssoftware auf die gewünschte Frequenz und Auflösung ein.

Als nächstes finden Sie die Glomeruli im Hellfeld. Schalten Sie anschließend die Detektion des Fluoreszenzsignals ein. Wählen Sie danach eine gewünschte Brennebene aus und überprüfen Sie die Intensität der Fluoreszenz auf den Kanälen flu oh four und firo red.

Achten Sie darauf, dass der Glomerulus im Hellfeld deutlich zu sehen ist. Zeichnen Sie dann die Änderungen der Fluoreszenzintensität für die Signale Flu oh four und furor red auf. Um die Bildsequenz zu importieren, teilen Sie die Kanäle und verwenden Sie den Hyper-Stack-Graustufenmodus.

Öffnen Sie in der Image J-Software ein ROI-Manager-Fenster, indem Sie den Analysewerkzeugen, ROI-Manager-Pfad, folgen. Wählen Sie einen oder mehrere interessante Bereiche mit einem ovalen Auswahlwerkzeug und der Funktion "T hinzufügen" im ROI-Manager aus. Wählen Sie dann den Bereich im Hintergrund aus und speichern Sie die ausgewählten ROIs.

Markieren Sie als Nächstes das Feld Eine Zeile pro Slice im Dialog und klicken Sie in den Ergebnissen der Menüoptionen auf OK. Legen Sie Messungen fest. Wählen Sie den mittleren Grauwert aus und berechnen Sie die Pixelintensitätswerte für jeden ROI, die im Ergebnisfenster in separaten Spalten angezeigt werden.

Kopieren Sie dann für jeden ROI die gemessenen ROI-Intensitätswerte für jeden Kanal in die bevorzugte Datenanalysesoftware und subtrahieren Sie die Hintergrundintensitätswerte von jedem Datenpunkt für jeden Zeitpunkt. Berechnen Sie das Verhältnis der Intensitäten der Grippe oh vier zu den roten Kanälen der URA nach diesem Diagramm, die Punkt-Zeit-Änderungen des Kalziums vorübergehend für jeden ROI. Dieses Bild zeigt die Patch-Clamp-Pipette, die am Oxidkörper auf der Oberfläche des Glomerulus der Ratte befestigt ist.

Bei einer elektrophysiologischen Aufzeichnung ist in der rechten unteren Ecke des Bildes ein Teil des verkapselten Glomerulus zu sehen. Hier ist eine repräsentative Stromspur der tripyartigen Kanalaktivität von einem zellgebundenen Pflaster, das auf dem Podozyten hergestellt wurde, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration zu messen. Glomeruli sind mit Grippe oh 4:00 AM beladen, um intrazelluläres Kalzium zu markieren.

Dieses Video veranschaulicht die Auswirkungen von CIN und Manganchlorid auf den Kalziumeinstrom in den Glomeruli. Dieses Diagramm quantifiziert die Veränderungen der Signalintensität von Flu oh four, die von einem einzelnen Podozyten als Reaktion auf CIN und Manganchlorid aufgezeichnet wurden. Erwartungsgemäß erzeugt CIN das Maximum der Fluoreszenz und Manganchlorid löscht den Farbstoff und führt zu der geringsten Fluoreszenzintensität.

Die Anwendung dieser Medikamente ermöglicht es dem Forscher, später die genaue Kalziumkonzentration in der Zelle zu bestimmen. Dieses Video zeigt die Wirkung von 10 Mikromol a TP auf die Calciumkonzentration in den Glomeruli. Es ist zu beachten, dass es eine Zunahme der Fluoreszenz der grünen Grippe O vier und einen Abfall der roten und roten Fluoreszenz gibt, was zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration führt.

Diese Technik bietet eine einzigartige Möglichkeit, Veränderungen des Kalziumeinstroms auf der Ebene des Einzelionenkanals und der einzelnen Zellen nach pharmakologischen Behandlungen oder anderen Manipulationen zu überwachen. Daher stellt dieser Ansatz ein sehr leistungsfähiges Werkzeug dar, wenn man die Vielzahl der verfügbaren gentechnisch veränderten Nagetiermodelle berücksichtigt. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kalziumationsmessungen in den Podozyten der durchführt, sowie die elektrophysiologischen, die Klemmexperimente zusammen verwenden.

Diese Techniken bieten einen detaillierten und mechanistischen Einblick in die Regulation des Umgangs mit Kalzium mit Podozyten unter normalen und pathologischen Bedingungen.