Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration als Reaktion auf pharmakologische Substanzen zu messen. Dabei werden die basalen Kalziumspiegel geschätzt und die Aktivität einzelner Kanäle in den Podocyten im Rahmen des gesamten frisch isolierten Glomerulus bewertet. Dies wird erreicht, indem zunächst das Blut aus den Ratten-Nieren durch Spülen über die Aorta abdominalis entfernt wird.

Anschließend werden die Nieren entnommen, die Nierenrinde isoliert und mit einem Rasiermesser zerkleinert. Im dritten Schritt werden die kortikalen Glomeruli durch differentielles Zentrifugieren isoliert. Danach können die isolierten entkappten Glomeruli entweder elektrophysiologischen Experimenten unterzogen oder mit fluoreszenten Farbstoffen beladen und für konfokale Kalziumkonzentrationsmessungen verwendet werden.

Letztlich ermöglichen diese Verfahren es Forschern, akute Veränderungen der intrazellulären Kalziumregulation in Reaktion auf die Applikation verschiedener Substanzen aufzuklären und die Kalziumleitfähigkeit auf Ebene einzelner Ionenkanäle zu bewerten und gezielt zu beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Podocyten als Teil des gesamten isolierten Glomerulus untersucht werden können. Unsere Präparation erhält das funktionelle Potenzial der Podocyten.

Sie verbleiben an den Kapillaren angeheftet und beteiligen sich an der Homöostase in der Umgebung, die tatsächlich die Hauptanteile der Glomeruli-Filtrationsapparatur erhält. Die Anwendung dieser Technik erweitert unsere pharmakologische Untersuchung. In normalen und pathologischen Zuständen spielt der Kalziumhaushalt in den Podocyten eine wesentliche regulatorische Rolle bei der Entstehung und Verhinderung von Nierenkomplikationen bei Erkrankungen wie diabetischer Nephropathie, fokaler segmentaler Glomerulosklerose oder Hypertonie. Es ist von großer Bedeutung, die Reaktion des Kalziumeinstroms in diesen Zellen auf Medikamente zu beobachten, die leicht untersucht werden können.

In dieser Vorbereitung demonstriert VLA Hunka, wie die Niere für die folgenden Verfahren gespült wird. Ich zeige die Isolierung der Glomeruli und die V-Clamp-Elektrophysiologie, und Dr. GaN führt Sie durch die konfokale Kalzium-Bildgebung. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine anästhesierte Ratte auf den temperaturgeregelten Operationstisch. Machen Sie unter dem Mikroskop einen medianen Schnitt im Bauchbereich, um die Vena cava und die Aorta freizulegen.

Als Nächstes die Ligatur um die Arteria coeliaca, die Arteria mesenterica superior und die Aorta abdominalis oberhalb dieser legen. Die Aorta abdominalis unterhalb der Nierenarterien stumpf dissezieren. Anschließend zwei Ligaturen darum platzieren, jedoch nicht abbinden.

Klemmen Sie die Aorta oberhalb der Ligaturen und binden Sie den unteren Faden fest. Danach katheterisieren Sie die Aorta mit einem Polyäthylen-Schlauch, der an eine Spritzenpumpe mit PBS unterhalb der Klemme angeschlossen ist, und fixieren Sie den Katheter mit einer zweiten Ligatur. Entfernen Sie anschließend die Klemme und ligieren Sie die Stelle.

Me enterische und zöliakale Arterien. Spülen Sie die Aorta drei Minuten lang mit vorab gekühlter PBS mit einer Geschwindigkeit von sechs Milliliter pro Minute aus. Gleichzeitig wird ein Schnitt in die Vena cava in der Nähe der Nierenvenen gemacht, um den Druck zu entlasten.

Nach drei Minuten stoppen Sie die Perfusion, entnehmen und umhüllen Sie die Nieren. Legen Sie sie in PBS-Lösung auf Eis. Bereiten Sie nun 30 Milliliter frisches 5% BSA in RPMI 1640 Medium vor.

Isolieren Sie mit einem Rasiermesser und einer Schere die Rinde beider Nieren und homogenisieren Sie diese anschließend mit einem Mörser und Stößel. Danach pressen Sie das zerkleinerte Gewebe durch ein 100-Maschen-Edelstahlsieb, das zuvor in einer 5%igen P-S-A-R-P-M-I-Lösung vorbenetzt wurde. Sammeln Sie den Durchlauf und lassen Sie ihn durch ein 140-Maschen-Sieb passieren.

Filtern Sie anschließend die gesammelte Durchflüssung durch das 140er-Sieb mit einem vorbenetzten 200er-Sieb. Verwerfen Sie das Filtrat und waschen Sie das obere Sieb mit 10 bis 15 Milliliter der zubereiteten B-S-A-R-P-M-I-Lösung, um die Glomeruli von der Oberseite des Siebs zu sammeln. Danach geben Sie die B-S-A-R-P-M-I-Lösung, die G-Glomeruli enthält, in ein 15-Milliliter-Zweikammer-Eis und lassen die Glomeruli bis zu 20 Minuten lang am Boden des Gefäßes sedimentieren.

Bei diesem Verfahren beschichten Sie fünf mal fünf Millimeter große Deckgläser mit Poly-Lysin der Molekularmasse 70.000 bis 150.000 und trocknen sie auf einer beheizten Platte. Danach erwärmen Sie die experimentellen Lösungen auf Raumtemperatur und füllen die Patch-Clamp-Kammer sowie die Pipette. Vorsichtig mischen Sie die Lösung, die Glomeruli enthält. Anschließend geben Sie etwa 50 Mikroliter dieser Lösung auf jedes polylysingebundene Deckglas.

Anschließend überführen Sie die Glaschips mit den Glomeruli in die Patch-Clamp-Kammer, die vorab mit der Beth-Lösung gefüllt wurde. Spülen Sie die Kammer eine Minute lang mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute durch, um nicht angeheftete Glomeruli zu entfernen, bevor Sie die konventionelle Patch-Clamp-Aufnahme im zellangehefteten Modus durchführen.

Geben Sie nun 500 Mikroliter der Glomeruli-Fraktion in je eine 0,5-Milliliter-Konustube und fügen Sie die Calcium-Farbstoffe Pure Red AM und Fluoh 4:00 AM hinzu. Stellen Sie anschließend die Tubes auf einen rotierenden Schüttler und lassen Sie sie bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Glas-Deckgläser mit Polylysin vor und lassen Sie sie auf der beheizten Platte bei 70 Grad Celsius trocknen. Sobald die Beladung mit den Calcium-Farbstoffen abgeschlossen ist, geben Sie 100 Mikroliter der Glomeruli-haltigen Lösung auf die mit Polylysin beschichteten Deckgläser und lassen Sie diese etwa fünf Minuten lang an der Oberfläche haften.

Danach montieren Sie die mit Glomeruli besetzten Deckgläser in eine Messkammer und spülen sie mit einer Badlösung mit einer Geschwindigkeit von drei Milliliter pro Minute, um nicht angeheftete Glomeruli und restliche Farbstoffe zu entfernen. Anschließend stellen Sie das konfokale Laserscanningmikroskop auf eine Anregungswellenlänge von 488 Nanometern ein. Danach stellen Sie die Bildaufnahmesoftware auf die gewünschte Frequenz und Auflösung ein.

Als Nächstes finden Sie die Glomeruli im Hellfeld. Schalten Sie anschließend die Detektion des Fluoreszenzsignals ein. Danach wählen Sie eine gewünschte Fokusebene aus und überprüfen die Intensität der Fluoreszenz in den Kanälen für Flu oh vier und Firo Rot.

Stellen Sie sicher, dass die Glomeruli im Hellfeld deutlich sichtbar sind. Nehmen Sie dann die Änderungen der Fluoreszenzintensität für die Fluorescein- und Furo-Rot-Signale auf. Um die Bildsequenz zu importieren, trennen Sie die Kanäle und verwenden Sie den Hyperstack-Graustufenmodus.

Öffnen Sie in der ImageJ-Software ein Fenster für den ROI-Manager über die Analysewerkzeuge und den Pfad ROI-Manager. Wählen Sie mithilfe des ovale Auswahl-Werkzeugs ein oder mehrere Regionen von Interesse aus und fügen Sie diese mit der Funktion „Add“ (Hinzufügen) im ROI-Manager hinzu. Wählen Sie anschließend einen Bereich im Hintergrund aus und speichern Sie die ausgewählten ROIs.

Markieren Sie anschließend in der Dialogbox je Slice eine Zeile und klicken Sie im Menü auf „OK“. Legen Sie die Messungen fest. Wählen Sie den mittleren Grauwert aus und berechnen Sie die Pixelintensitätswerte für jede ROI, die im Ergebnisfenster in separaten Spalten angezeigt werden.

Kopieren Sie für jede ROI die gemessenen Intensitätswerte der ROI für jeden Kanal in die bevorzugte Datenanalyse-Software und subtrahieren Sie die Hintergrundintensitätswerte von jedem Datenpunkt für jeden Zeitpunkt. Berechnen Sie danach das Intensitätsverhältnis von flu oh four zu URA red und tragen Sie die zeitlichen Veränderungen des Kalziumtransienten für jede ROI auf. Dieses Bild zeigt die Patch-Clamp-Pipette, die an dem Oxidkörper an der Oberfläche des Rattenglomerulus befestigt ist.

Während einer elektrophysiologischen Ableitung ist ein Teil eines verkapselten Glomerulus in der rechten unteren Bildecke sichtbar. Hier ist eine repräsentative Stromspur der tripy-ähnlichen Kanalaktivität aus einer an die Podocytenzelle angelegten Patch-Clamp-Messung zur Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Die Glomeruli wurden mit Fluoh 4:00 AM beladen, um das intrazelluläre Kalzium zu markieren.

Dieses Video veranschaulicht die Wirkung von CIN und Manganchlorid auf den Calciumeinstrom in den Glomeruli. Dieses Diagramm quantifiziert die Änderungen der Fluoreszenzsignalintensität, die von einem einzelnen Podocyten als Reaktion auf CIN und Manganchlorid aufgezeichnet wurden. Wie erwartet führt CIN zur maximalen Fluoreszenz, während Manganchlorid den Farbstoff löscht und zu der geringsten Fluoreszenzintensität führt.

Die Anwendung dieser Wirkstoffe ermöglicht es dem Forscher, später die exakte Kalziumkonzentration innerhalb der Zelle zu bestimmen. Dieses Video zeigt die Wirkung von 10 µmol TP auf die Kalziumkonzentration in den Glomeruli. Beachten Sie den Anstieg der grünen Fluoreszenz von FluO-4 und den Rückgang der roten Fluoreszenz von FuRed, was auf eine erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration hinweist.

Diese Technik bietet eine einzigartige Gelegenheit, Veränderungen des Kalziumeinstroms auf Ebene einzelner Ionenkanäle und einzelner Zellen nach pharmakologischen Behandlungen oder anderen Manipulationen zu überwachen. Daher stellt dieser Ansatz ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug dar, insbesondere angesichts der Vielzahl verfügbarer genetisch veränderter Nagetiermodelle. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Kalziumionsmessungen in den Podocyten durchgeführt werden, ebenso wie der elektrophysiologischen Methoden, einschließlich der Spannungs- und Stromklemme, die entweder allein oder in Kombination angewendet werden.

Diese Techniken ermöglichen einen detaillierten und mechanistischen Einblick in die Regulation des Calciumhaushalts in Podocyten unter normalen und pathologischen Bedingungen.