Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Ex-vivo-Beobachtung des Schlagens von Motr-Anhängsel-CLIA zu ermöglichen, die sich in den Ventrikeln des Mausgehirns befinden. Dies wird erreicht, indem zunächst das gesamte Gehirn entnommen und anschließend dünne Schnitte durch die Seitenventrikel gewonnen werden. Danach werden die Schnitte in einer speziell angefertigten Glasbodenplatte inkubiert, die ein Glukose-reiches Medium bei Körpertemperatur enthält, um das Gewebe während des Experiments lebend zu erhalten.

Schließlich wird das Schlagen der Cilien mit einem hochauflösenden Differentialinterferenzkontrastmikroskop aufgezeichnet. Letztendlich können Struktur und Proteinlokalisierung der Cilien mittels Immunfluoreszenzbildgebung sichtbar gemacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unserer bisherigen Methode besteht darin, dass es die erste Technik ist, die eine Klassifizierung der epidermalen Zellen in drei unterschiedliche Gruppen anhand ihrer charakteristischen ciliären Wiederholungsfrequenzen und -winkel ermöglicht.

Das ist gut. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Therapie des Hydrozephalus. Da eine gestörte Funktion der epidermalen CLIA zur Ansammlung von zerebrospinaler Flüssigkeit im Gehirn führt.

Ventrikel. Die Prozedur wird demonstriert von Frau Zaha Alam und Frau Hannah sat, sehr talentierten Studentinnen aus unserem Labor. Beginnen Sie damit, den Kopf einer erwachsenen Maus mit 70 % Ethanol zu reinigen. Anschließend, ausgehend von der Schädeldecke, verwenden Sie sterile Schere und Pinzette, um die Haut abzuziehen und den Schädel freizulegen.

Heilen Sie als Nächstes das Knochenstück Stück für Stück, beginnend von der hinteren Seite und in Richtung der vorderen Seite fortschreitend. Um den Schädel zu entfernen, isolieren Sie das gesamte Gehirn und legen es in eine 100 Millimeter große Petrischale mit Medium mit hohem Glucosespiegel bei 37 Grad Celsius. Schneiden Sie das Gehirn mit einer scharfen Klinge entlang der medianen sagittalen Ebene, um aus jeder Hälfte den ersten 100 bis 200 Mikrometer dicken Schnitt zu erhalten.

Anschließend spülen Sie die Schnitte mit PBS bei 37 Grad Celsius ab und legen das Gewebe unverzüglich in Augen-Glucose-Medium bei 37 Grad Celsius, um die Schnitte abzubilden. Geben Sie die Gehirnschnitte in 30-Millimeter-Kulturschalen mit Glasboden, die ein Milliliter Hochglukose-Medium enthalten, und stellen Sie die Umgebung der geschlossenen Mikroskopkammer mit einem 60x-Ölimmersionsobjektiv auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ein. Fokussieren Sie danach die Zellen mit regulärem DIC-Durchlicht.

Danach die Richtung der DMEM-Blasenbewegung als Leitfaden für den Ort der beweglichen Fortsätze (Cilien) verwenden. Mit dem DIC-Filter einen Bereich auswählen, der gesunde Zellen mit beweglichen Cilien im lateralen Ventrikel des Gehirns enthält. Nach Identifizierung der Fortsätze (Cilien) das Licht und den Fokus anpassen, um ein zufriedenstellendes Bild zu erhalten.

Als Nächstes legen Sie die Parameter für die Live-Bildgebung in der Bildgebungssoftware fest. Beispielsweise werden hier 24-Bit-Bilder mit einer Kamerabinning-Einstellung von ein zu eins in Kombination mit dem 60x-Objektiv und einer Belichtungszeit von fünf bis 10 Millisekunden aufgenommen. Öffnen Sie die Mikroskopblende auf das optimale Niveau für eine minimale Belichtungszeit und erfassen Sie die DIC-Bilder.

Beobachten Sie die Live-Bilder, die an die Kamera übertragen werden, um eine schnelle und unmittelbare Bildaufnahme ohne Verzögerung zu ermöglichen. Die Geschwindigkeit des silligen Schlagens kann dann basierend auf der Anforderung minimaler Belichtungszeiten zur Erzielung eines ausreichenden Bildkontrasts zur Aufzeichnung der Kalziumsignalisierung berechnet werden. Nach dem Schneiden des Gehirns spülen Sie das Gewebe kurz in PBS und inkubieren Sie die Schnitte unmittelbar in 20 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereiteter lu O2 in einer Platte mit Glasboden.

Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius die Kalziumoszillation mit einer Aufzeichnungsrate von fünf Millisekunden für mindestens eine Sekunde aufzeichnen. Zuerst bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern, dann bei einer Emissionswellenlänge von 515 Nanometern. Um die gewünschten Zellmarker mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, die Proben in 4 % Paraformaldehyd und 2 % Saccharose in PBS für 10 Minuten fixieren.

Das Gewebe dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Anschließend die Gehirnschnitte in 0,1 % Triton X für fünf Minuten inkubieren. Nach dem Abwaschen der Proben wie zuvor gezeigt, mit Maus-Anti-azetyliertem Alpha-Tubulin inkubieren.

Nach einer weiteren PBS-Waschung die Proben eine Stunde bei Raumtemperatur mit fluoresceinmarkiertem anti-US-IgG inkubieren. Abschließend die Schnitte fünf Minuten mit DPI kontrastfärben und die Zellen unmittelbar mit der minimal möglichen Belichtungszeit abbilden. Das Vorhandensein eines penilen CLIA wird mittels eines Zilienmarkers, acetyliertem alpha-Tubulin, in Kombination mit DPI-Gegenfärbung bestätigt. Zur Identifizierung der Kerne erfolgt die Analyse der Beweglichkeit eines penilen CLIA durch Zählung der Schlagfrequenz und des Winkelmusters der bewegten Zellen.

Die CLIA kann anschließend anhand dieser Daten in eine von drei Gruppen eingeteilt werden. Wichtig ist, dass die Exposition der CLIA gegenüber 0,25 % Ethanol die Schlagfrequenz der CLIA unabhängig von ihrem Typ signifikant hemmt. Eine weitere Verbiegung der CLIA löst eine Zilien-abhängige intrazelluläre Kalziumsignalgebung aus, die die Messung des intrazellulären Kalziumsignals innerhalb der Gehirnventrikel ermöglicht. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Gehirngewebe vorsichtig und effizient zu handhaben, um die Hirnventrikel nach ihrer Entwicklung nicht zu beschädigen. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Funktion von append CLIA und lebendem Mäusegehirngewebe zu untersuchen.