Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine ex vivo-Beobachtung des Schlagens von Motr append CLIA zu ermöglichen, das sich in den Hirnventrikeln der Maus befindet. Dies wird erreicht, indem zuerst das gesamte Gehirn entnommen und dann dünne Schnitte durch die Seitenventrikel entnommen werden. Als nächstes werden die Scheiben in einer maßgeschneiderten Glasbodenplatte inkubiert, die hohe Glukose enthält, die bei Körpertemperatur mittel ist, um das Gewebe während des Experiments am Leben zu erhalten.

Abschließend wird das Schlagen der Celia mit einem hochauflösenden differentiellen Interferenzkontrastmikroskop aufgezeichnet. Letztendlich kann die Struktur und Proteinlokalisation der Celia durch Immunfluoreszenzbildgebung sichtbar gemacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik unserer bestehenden Methode besteht darin, dass es die erste Technik ist, die eine Klassifizierung der Epidermiszellen und in drei verschiedene Gruppen auf der Grundlage ihrer einzigartigen ziliären Wiederholungsfrequenzen und -winkel ermöglicht.

Das ist gut. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie des Hydrozephalus. Da die epidermale CLIA-Funktion abnormal ist, führt dies zur Ansammlung von zerebraler Rückenmarksflüssigkeit im Gehirn.

Ventrikel Bei der Demonstration des Verfahrens sitzen Frau Zaha Alam und Frau Hannah, sehr talentierte Studenten aus unserem Labor. Beginnen Sie damit, den Kopf einer erwachsenen Maus mit 70% Ethanol zu reinigen. Beginnen Sie dann mit der Oberseite des Kopfes und ziehen Sie mit einer sterilen Schere und Pinzette die Haut ab und legen Sie den Schädel frei.

Als nächstes heilen Sie den Knochen Stück für Stück, beginnend von der hinteren Seite bis zur vorderen Seite. Um den Schädel zu entfernen, wählen Sie das gesamte Gehirn aus und legen Sie es in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 37 Grad Celsius und hohem Glukosemedium. Schneiden Sie das Gehirn mit einer scharfen Klinge in der medianen Sagittalebene auf, um den ersten 100- bis 200-Mikrometer-Schnitt aus jeder Hälfte zu erhalten.

Spülen Sie dann die Schnitte mit 37 Grad Celsius PBS ab und legen Sie das Taschentuch sofort in 37 Grad Celsius. Platzieren Sie die Gehirnschnitte in 30-Millimeter-Glasbodenkulturschalen mit einem Milliliter hohem Glukosegehalt und stellen Sie die Umgebung der geschlossenen Mikroskopkammer mit einer 60-fach-Objektiv-Ölimmersionslinse auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ein. Fokussieren Sie sich dann auf die Zellen mit regulärem DIC-Durchlicht.

Folgen Sie dann der Richtung der Bewegung der DMEM-Blase als Leitfaden für die Position des Motil-Anhangs. Verwenden Sie den DIC-Filter, um einen Bereich auszuwählen, der gesunde Zellen mit motil CLIA im lateralen Ventrikel des Gehirns enthält. Passen Sie nach der Identifizierung des Anhangs das Licht und den Fokus an, um ein zufriedenstellendes Bild zu erhalten.

Legen Sie als Nächstes die Live-Imaging-Parameter in der Imaging-Software fest. Hier werden beispielsweise 24-Bit-Bilder aufgenommen, bei denen die Kamerabiegung auf eins mal eins eingestellt ist, kombiniert mit dem 60-fach-Objektiv und einer Belichtungszeit von fünf bis 10 Millisekunden. Öffnen Sie die Mikroskopblende auf das optimale Niveau für eine minimale Belichtungszeit und nehmen Sie die DIC-Bilder auf.

Beobachten Sie die Live-Bilder, die an die Kamera gestreamt werden, um eine schnelle und sofortige Bildaufnahme ohne Verzögerung zu ermöglichen. Die Geschwindigkeit des dummen Schlagens kann dann auf der Grundlage der Anforderung der minimalen Belichtungszeiten berechnet werden, um einen ausreichenden Bildkontrast für die Aufzeichnung der Kalziumsignalübertragung zu erhalten. Nach dem Schneiden des Gehirns spülen Sie das Gewebe kurz in PBS aus und inkubieren die Schnitte sofort in 20 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetem lu O2 in einer Glasbodenplatte.

Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius zeichnen Sie die Kalziumoszillation mit einer Erfassungsrate von fünf Millisekunden für mindestens eine Sekunde auf. Zunächst bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern, dann bei einer Emissionswellenlänge von 515 Nanometern. Um die interessierenden Zellmarker durch Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, fixieren Sie die Proben 10 Minuten lang in 4%para-Formaldehyd und 2%Saccharose in PBS.

Waschen Sie das Taschentuch dreimal fünf Minuten lang in PBS. Inkubieren Sie dann die Gehirnschnitte fünf Minuten lang in 0,1 %Triton X. Nachdem Sie die Proben wie gerade gezeigt gespült haben, inkubieren Sie sie mit anti-acetyliertem Alpha-Tubulin der Maus.

Nach einer weiteren PBS-Wäsche werden die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Fluorescein anti-US-IgG inkubiert. Zum Schluss färben Sie die Schnitte fünf Minuten lang mit DPI gegengefärbt und bilden die Zellen sofort mit der geringstmöglichen Belichtungszeit ab. Das Vorhandensein einer penalen CLIA wird mit einem ziliären Marker, acetyliertem Alpha-Tubulin, mit DPI-Gegenfärbung bestätigt. Um die Zellkerne zu identifizieren, erfolgt die Analyse des Stroms einer penalen CLIA-Motilität durch Zählung der Schlagfrequenz und des Winkelmusters der sich bewegenden Zellen.

Basierend auf diesen Daten kann die CLIA dann in eine von drei Gruppen eingeteilt werden. Wichtig ist, dass die Exposition des CLIA gegenüber 0,25 % Ethanol die Häufigkeit der CLIA-Schläge unabhängig von ihrem Typ signifikant unterdrückt. Eine weitere Biegung des CLIA löst eine ziliumabhängige intrazelluläre Kalziumsignalgebung aus, die die Messung des intrazellulären Kalziumsignals in den Hirnventrikeln ermöglicht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Hirngewebe schonend und effizient zu behandeln, um die Hirnventrikel nach seiner Entwicklung nicht zu zerstören. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Funktion von Append-CLIA und lebendem Hirngewebe von Mäusen zu erforschen.