Name: Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie physiologische Ansätze zur Charakterisierung neuer viraler Proteine in Phagen mittels Multi-Phänotyp-Assay-Platten und Metabolomanalyse in E. coli. Diese Methode verknüpft Genotyp mit Phänotyp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas und Mitgliedern des Viral Dark Matter Consortium für ihre Hilfe und ihren konstruktiven Beitrag zu diesem Manuskript. Diese Forschung wird von der National Science Foundation (DEB-1046413) finanziert und ist Teil des Projekts Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter.

<ol><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoding+in+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Recoding%3A+Expansion+of+decoding+rules+enriches+gene+expression%22%5BJournal%5D)">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+sciences+%2F+The+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li>
<li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li>
<li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li>
<li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalendar%2C+R+%22The+bacteriophages%22">The bacteriophages</a>. , Oxford Univeresity Press. (2006).</li>
<li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li>
<li>Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li>
<li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oceanography%22%5BJournal%5D)">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li>
<li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+ecosystems%3A+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741(2003).</li>
<li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+S-PM2%2C+a+%E2%80%9Cphotosynthetic%E2%80%9D+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li>
<li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li>
<li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li>
<li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes%3A+signature+features+and+ecological+interpretations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144(2005).</li>
<li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li>
<li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40%3A+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li>
<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li>
<li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li>
<li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657(2012).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+for+Enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+P%28BAD%29+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf">http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf</a> (2014).</li>
<li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TagCleaner%3A+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341(2010).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288(2011).</li>
<li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002(2009).</li>
<li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+for+plant+metabolomics%3A+reporting+MSI-compliant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li>
<li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+viruses+exploit+their+host%E2%80%99s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li>
<li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li>
<li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li>
<li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+research%3A+an+international+journal+for+rapid+publication+of+reports+on+genes+and+genomes%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir Phenomic Ansätze für die funktionelle Charakterisierung von putativen Phagen-Gene. Techniken umfassen eine entwickelte Assay in der Lage Überwachung Host anabolen Stoffwechsel, die Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten), zusätzlich zu den etablierten Verfahren der Metabolomik, die Messung von Auswirkungen auf Energiestoffwechsel. Wir stellten zusätzliche Werkzeuge, um die großen Datenmengen von diesen Technologien resultierenden verwalten, so dass für hohe Durchsatzverarbeitung und Analyse 24. Schließlich durch den Vergleich eines kommentierten Phagen Kapsidprotein, Phagen Thioredoxin, zwei mutmaßliche metabolische Phagen-Genen, und die durchschnittliche experimentelle Reaktion schlagen wir verschiedene Strategien, um beide Datensätze und Gen-Klassen zu interpretieren, wobei der Schwerpunkt auf der Identifizierung von Trends und phänotypische Identifizierung von Ausreißern. Wie bereits erwähnt, beide Ansätze quantitativ zu messen nur die Hälfte der Wirtsstoffwechsels. Um die relative Funktion der einen der interpretierenneuartige Proteine ​​untersuchten Daten aus beiden Verfahren ist erforderlich, um Hinweise auf Funktion bereitzustellen. Zwar ist dies nicht ein Schwerpunkt unserer aktuellen Manuskript wird Datenausgänge von jedem Phenomic Verfahren durch kombinatorische Analysen, die auf Clustering-Techniken konzentrieren, wie Zufalls Wald und Hauptkomponentenanalyse setzen. Darüber hinaus müssen Hypothesen der kombinierten Analyse resultierenden anschließend von traditionellen genetischen Methoden validiert werden. Schließlich stellte die Verfahren sind stark von bakteriellen Physiologie beeinflusst und damit die gleichen Standards zu folgen. Bei der Durchführung jedem Verfahren müssen Überlegungen anzustellen, um unabhängige, klonalen Gruppen mit experimentiert zu gewährleisten; Kontamination verhindert wird; eine einzelne Variable getestet wird; und entsprechende Kontrollen werden gleichzeitig liefen. Die Nichtbeachtung dieser Punktekonto wird in unklare Ergebnisse, ähnlich wie bei jedem physiologischen Test führen. Multi-Phänotyp-Assay-Platten(MAPs) Die Entwicklung von MAPs bietet einen hohen Durchsatz und anpassungsfähige Test im Vergleich zu derzeit verfügbaren Technologien (5A und Tabellen 1,2). Der Test verwendet Versorgung, Ausrüstung und grundlegende Techniken in allen mikrobiologischen Labors. Der Einbau einer Rechenpipeline PMAnalyzer 24 zur nachfolgenden Datenverarbeitung und Analyse stellt eine schnelle Interpretation der Daten. Darüber hinaus können beide experimentellen und analytischen Aspekte der Ansatz leicht eingestellt oder für kundenspezifische Zwecke abgestimmt werden. Zum Beispiel, wenn ein Großteil der Daten nicht zur Filterung in Abschnitt 4 beschrieben weitergeben, kann man manuell über den Wachstumskurven zu sichten, um Probleme zu identifizieren. Wenn das Problem entsteht aufgrund der strengen Filterparameter können Anpassungen an das Skript werden. Alternativ kann, wenn Probleme mit dem experimentellen Prozess verbunden (dh verlängert Kondensation; unsachgemäße Übertragung von bakteriellen cells, etc.) werden zusätzliche Wiederholungen ohne weiteres wiederholt werden. Wie in Cuevas et al. 24 beschrieben, ist die PMAnalyzer eine einzige bash-Programm als ein Wrapper-Skript, das die Analyse und Analyse Skripte als zusammenhängende, automatisierten Pipeline führt geschrieben. Alle Skripte sind, indem der Mittelwert für jeden Zeitpunkt in dreifacher Ausfertigung Daten frei zugänglich von einem Git-Repository bei 25, und anschließend parametriert die logistische Kurve, um die Verzögerungszeit zu erhalten, maximale Wachstumsrate, Asymptote, und eine neue Sicht Wachstumsniveau. Der Median-Wert wurde über die mittlere in unserer Studie, um die Wirkung von großen Ausreißer reduzieren gewählt, jedoch kann das Skript leicht angepasst, um den Mittelwert Replikatdatenserver berechnen. Aufgrund der reduzierten Variation (SE) über Replikatdatenserver (2A) ersichtlich wir aufrechterhalten die Verwendung des Medianwertes PMAnalyzer zum Anbringen einer logistischen Kurve. Zusätzlich wird die für das Wachstum abgeschnitten in dieser Studie (GL ≥ 0,4) war die Detedurch den Vergleich, wie Daten über Wachstumsstufe und maximale Wachstumsrate getrennt rmined (1A, B). In Abhängigkeit von der Instrumente und Modellsystem verwendet diesen Begriff können variieren, Neudefinition dieses erfordern abgeschnitten Wert. Ein Hauptvorteil unserer Assay ist die Fähigkeit, Phänotypen mit einem einzigen Parameter, der Gesamtmikrobenwachstum, die wir als Wachstumsniveau (GL) zu vergleichen. GL ist eine harmonische Mittel und mindert daher die Auswirkungen der großen Abweichung in den Daten. Die Verwendung eines harmonischen Mittelwert mit verschoben logistic ausgestattete Werte zur Verfügung zu stellen eine Zusammenfassung des Wachstums wurde bei durch Versuch und Irrtum angekommen. Andere Methoden versucht, unterscheiden Wachstum enthalten: Zeit, die spezifischen Kurvenparameter (Halb μ max, μ max und Tragfähigkeit), die Bestimmungskoeffizienten (R 2), und Kombinationen der R 2, multipliziert mit bestimmten Kurvenparameter zu erreichen. Mit Hilfe eines harmonische Mittel mit verschobenlogistic-fit Werte für den GL vorgesehen die größte Reichweite bei der Bewertung Wachstum, so wurde es die Methode der Wahl. Eine Überlegung zu beachten ist, dass dynamische Wachstumskurve Muster haben das Potential, bei der Verwendung eines einzelnen Parameters oder eines angepassten Modells verloren. Zum Beispiel sind die einzelnen Kurvenparameter der logistischen Kurve und der GL unfähig darstellt biphasische Wachstum. In einer einzigen Kohlen Umwelt, diese Wirkung auf das Wachstum impliziert Vermittlung des viralen Proteins zu beiden Umsetzung des Substrats oder der Substratverwertung Verschiebung. Zusätzliche Effekte möglicherweise verloren, wenn nicht unter Berücksichtigung mehrerer Wachstumsparameter umfassen: verlängerte Verzögerungszeit, schlägt eine erhöhte Belastung der viralen Maschinen oder Produkte; schnell beschleunigt exponentiellen Phase, was auf virale Proteine ​​gekoppelt sind, um die Energieproduktion Wege auszurichten; oder höhere Biomassebildung, was impliziert, viralen Träger in Wirtsnährstoffaufnahme und Anabolismus (Daten nicht gezeigt). So Plotten im Entstehen begriffenen Wachstumskurven ( <strong&gt; 2A, B) enthält Informationen zu Trends im Zeitverlauf, während die GL berücksichtigt die wichtigsten Variablen der logistischen Modell und bietet eine einzige quantitative Zahl für den Gesamterfolg eines Klons dar. Bei der Betrachtung der unterschiedlichen Reaktionen von strukturellen und metabolischen Gene in den MAPs beigetragen, stellt man fest, dass die unterschiedlichen Substratklassen in Frage stellen den größten Beweis für die Proteinfunktion. Beispielsweise werden Proteine ​​häufig mit metabolischen Nahme der limitierende Nährstoff, die unspezifisch an Zentralstoff 16,32 Host assoziiert sind. Vorläufige MAP Experimente zeigen, dass Klone vermeintlichen Stoffwechsel Phagen-Gene eine erhöhte Lag-Phase, als am zentralen Stoffwechsel Kohlenstoffquellen (2A) gewachsen. Umgekehrt Klone, die mutmaßlichen Strukturgene, die große Anteile an Gastgeber Energie und dNTP-Pools erfordern, führen zu einer falsch positiven Reaktion auf das Wachstum für central und Aminosäurestoffwechsel Kohlenstoffsubstraten. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der Ansammlung von unlöslichen Proteinen, was zu Host Filamentierung und / oder Einschlusskörper als über Mikroskopie (2A und Daten nicht gezeigt) beobachtet. Während weitere Analyse erforderlich ist, um diese vorläufigen Ergebnisse bestätigen, sind die Karten in der Lage ist das Abrufen phänotypischen Antworten, die die Funktionen von spezifischen Phagen-Gen-Klassen Hypothese zu korrelieren. Neben der Aufklärung der unbekannten viralen Proteine ​​sind die MAPs eine neuartige Ressource, um die funktionelle und metabolische Diversität eines einzelnen Bakterium oder eine Gemeinschaft von Bakterien zu untersuchen. MAP-Komponenten sind für die einfache Veränderung, um das Wachstum einer Reihe von Bakterien unterstützen entworfen; einschließlich Meeres, auxotroph, und anaerobe Mikroben. Zur Erleichterung dieser Bemühungen die definierten Basis-und pre-Wachstumsmedien erfordern zusätzliche oder eingestellt chemischen Spezies, bevor eine andere Bakteriengattung in den MAPs unterstützt werden.Ein Hinweis auf diese Verwendung der Karten ist es, definierte Medien zu erhalten, das Verbot der Verwendung von Inhaltsstoffen wie Trypton, Hefeextrakt und Pepton. Metabolomics Der Bereich der Metabolomics ist abhängig von Stoffwechseldatenbanken, die durch Massenspektrometrie identifiziert isoliert Metaboliten enthalten. Die Core Facility hier gewählt hat eine der größten Metabolomics-Datenbanken. Interessanterweise waren mehr als die Hälfte der Stoffwechselprodukte aus unserer Experimente resultierenden identifizierbaren (~ 65%), während andere noch nie zuvor in unserer Gast aufgezeichnet wurde, Escherichia coli (Beispiele: Indol-3-Essigsäure 33, Salicylsäure 34 und Dihydroabietinsäure 35). Dies könnte entweder auf eine starke Tendenz der Datenbank zu Pflanzenstoffe, oder die spezifischen Proteine ​​in Untersuchung zurückzuführen. Unabhängig davon ist das Ergebnis einer begrenzten Anzahl von bekannten Metaboliten zur Datendarstellung und Analyse zur Verfügung. In der futur, mehrere Metabolomik Methoden mit verschiedenen Datenbanken würde für eine größere Stoffwechselabdeckung zulassen. Derzeit bekannte und unbekannte Metaboliten werden beim Vergleich und die Gegen unserer neuartigen virale Proteine. Mit diesem Ansatz stellen wir die Hypothese, dass Klone, funktionell ähnliche Proteine ​​eine erhöhte Ähnlichkeit in ihrer vollständigen metabolomic Profil teilen. Vorab metabolomics Analyse zeigte, dass während strukturelle und metabolische Gene nicht eindeutig voneinander trennen, diese Gene ähnliche Effekte auf die Wirts aufweist, wenn er nicht überexprimiert korreliert (Figur 6). Zum Beispiel können die kommentierten Capsid Gencluster eng mit den mutmaßlichen metabolischen Gene markiert in dieser Studie EDT2440 und EDT2441. Untersuchungen die einen öffentlich zugänglichen Transmembrantopologie und Signalpeptid-Vorhersageprogramm ergaben sich Hinweise, dass beide mutmaßlichen metabolischen Gene beherbergen eine einzelne Transmembrandomäne. Interessanter 5 von the 9-Klone in der ersten Cluster-Gruppe (die meisten linken Teil der Dendrogramm) sind Transmembrandomänen mit der gleichen Topologie Programm vorhergesagt. Weitere Untersuchungen erforderlich sind, ist es jedoch wahrscheinlich, daß die bei der Überexpression dieser Klone Metaboliten sind mit zellulären Stress-Antwort von Membran oder Strukturlasten zu verbunden. Dieser Beweis stützt, dass während der Daten metabolomics besitzt eine erhöhte Menge an Rauschen, der fähig ist hervorgehoben Signale allgemeinen Wirkungen von Genen, sowohl innerhalb eines Gens Klasse unterscheiden, ist das Verfahren. Um festzustellen, ob die Methode, die das Auslesen aus spezifischen Informationen der Genfunktion ist, wurden Metaboliten in die spezifische Stoffwechselwege gruppiert. Die Hypothese, der ist, wenn ein Klon wirkt spezifisch für eine einzelne Bahn Metaboliten, dann ist das überexprimiert Gen in diesem Weg aktiv. Vor der Einrichtung unserer Metabolomik Qualitätssicherung Pipeline, ergab vorläufige Daten, die über eined repräsentiert Metaboliten waren typischerweise &quot;unbekannt&quot; bleibt, dass sie nur wenig Informationen über die Wege der sie zugeordnet sind (Daten nicht gezeigt). Vorverarbeiteten metabolomics Daten offenbart jedoch, dass die Mehrzahl der Metabolit Profile ähnlich sind und nur eine ausgewählte Anzahl von unbekannten und bekannten Metaboliten Häufigkeiten variieren von Klonen, beispielsweise Putrescin und Uracil (Abbildung 6). Um eine höhere Auflösung der Proteinfunktion Bemühen stellen werden unternommen, um experimentell zu vergleichen, die die neuen Phagen-Gene gegen bekannte Phagen-Gene, die verwendet werden kann, um in die &quot;Löcher&quot; von Metaboliten auf Basis funktionelle Charakterisierung zu füllen. Unter Verwendung dieser Technik bietet die zugeordnete Funktion von bekannten viralen Genen eine Referenz für die Funktion der unbekannten Genen. Dennoch der limitierende Faktor der Metabolomics-Analyse ist die Größe und Bedeutung der Datenbank. Um dieser Einschränkungen metabolomic Datenbanken relatable dieser Forschung entwickelt werden müssen zu korrigieren; soals Datenbank von Metaboliten und deren Häufigkeiten der spezifisch auf die ASKA Sammlung von E. coli Klone, bei denen ein einzelner ORF überexprimiert 36. Der Nachweis für die Notwendigkeit einer solchen Datenbanken wurde im Jahr 2013 zur Verfügung gestellt, als Forscher an der Lawerence Berkeley National Laboratory kompiliert die erste umfassende Datenbank der spezifischen gesamten Mutantenbibliotheken von Modell Bakterien 37 Metaboliten. Diese Forschung werden neue Einblicke in Genen, die für Verwendung von bestimmten Metaboliten erforderlich ist, enthüllt die klaren Zusammenhang zwischen Phänotyp und Genotyp. Bei der Prüfung, Metabolomik als Werkzeug, ist es wichtig zu definieren, die Verarbeitung Regime folgte an der Core Facility. Ein Artefakt der meisten experimentellen Verfahren ist der Tag-zu-Tag Varianz mit den Instrumenten der Verwendung verbunden. Bis heute alle GC-MS-Analyse implementiert die Verwendung von internen Standards, die in jede Analysenserie enthalten sind; aber Zugabe von projektspezifischen internen Proben &lt;/ Em&gt; lief jeden Tag des Experimentierens entfernt zusätzliche Varianz. Diese Überlegungen müssen frühzeitig angegangen werden, um eine Normalisierung Probleme und Verzerrungen zu vermeiden. Eine andere Lösung ist es, alle Proben bei einer Kernanlage auf der gleichen Maschine und als eine einzige Partie, eine Option zu jeder Kernanlage zur Verfügung zu verarbeiten. Die verschiedenen Werkzeuge vorgestellt und sowohl in dieser Handschrift neu erforscht, neuartige Mittel zum Screening und Charakterisierung funktionell unbekannt Phagen-Gene. Die Einfachheit und Anpassungsfähigkeit der experimentellen Techniken mit dem stromlinienförmigen Einsatz von Rechenrohrleitungen gewährleistet, diese Methoden sind für ein breites Spektrum von Forschungsvorhaben und Felder. Unser Ziel ist, dass die hier vorgestellten Ansätze Phenomic wird weitere Untersuchungen neuartiger Phagenproteine ​​zusätzlich zu Systemen, die gleichermaßen funktionell undefined sind zu unterstützen.

Viren, die Bakterien (aka Bakteriophage oder Phage) befallen sind schätzungsweise bei mehr als 10 31 virusähnlichen Partikeln (VLPs) global in einer Umgebung vorhanden sind und 1,2 überwiegen alle anderen Organismen. Die erste metagenomic Studie zur Untersuchung der viralen Gemeinden mit Meeresumgebungen konzentrierte sich auf die Quantifizierung der Vielfalt innerhalb der Virusfraktion 3 zu sehen. Zusätzlich Breitbart und Kollegen festgestellt, dass mehr als 65% der viralen Sequenzen gemeinsam Gemeinschaft keine Homologie zu irgendwelchen Sequenzen in öffentlichen Datenbanken. Nachfolgende metagenomic Studien fanden ähnliche Beweise: Metagenomen aus marinen Sedimenten in San Diego, Kalifornien enthalten 75% unbekannt viralen Sequenzen 4; Metagenomen von hypersaliner Seen des Salton Sea enthalten 98% unbekannt viralen Sequenzen 5; und Korallen-assoziierten Metagenomen enthalten 95 bis 98% unbekannt viralen Sequenzen 6. Diese Anhäufung von unkommentierte Informationen führte zuPhagen genetischen Materials, &quot;der dunklen Materie des biologischen Universums&quot; 7. Genoms von Phagen beruht auf der Identifizierung Sequenzähnlichkeit durch Vergleich mit bestehenden Nukleinsäure und Protein-Datenbanken. Weil Phagen-kodierte genetische Information ist in erster Linie bekannt ist, sind Homologie-basierte Methoden unwirksam. Innerhalb ihres Genoms, Phagen kodieren typischerweise drei großen Gen-Typen: Transkription und Replikation Genen, Stoffwechsel-Genen und Strukturgene. Die Transkription und Replikation Gene (Klasse I / II-Gene 8) schließen Polymerasen, Primasen, endo / exo-Nukleasen und Kinasen. Diese Gene sind hoch wegen ihrer Bedeutung in Phageninfektion konserviert, Transkription und Replikation von Phagen genetischen Materials. Phagen-Polymerasen werden leicht unter Verwendung von herkömmlichen Methoden, Sequenzhomologie identifiziert durch ihre globale Erhaltung 9 und ist gezeigt worden, als wirksame phylogenetischen Markierungen 10 dienen.Demgegenüber Phagen metabolischen und Strukturgenen (Klasse II / III-Gene 8) zunehmend divergent und oft als hypothetische Gene gekennzeichnet. Phage metabolischen Gene beeinflussen die Stoffwechselkapazität der Host und sind für die virale Replikation nicht unbedingt erforderlich. Diese Gene, die häufig als Hilfs metabolischen Gene 11 (AMGs) bezeichnet wird, scheinen Wirtsstoffwechsel modulieren und ermöglichen einen optimalen Verlauf der Infektion und den Erfolg der Virion-Reifung. AMGs haben mit der Nutzung und Aufnahme von Nährstoffen oder die Begrenzung der Energieproduktion Wege in Verbindung gebracht. Einige Beispiele sind Photo Gene in den Genomen verschiedener cyanophage 12-16 gefunden, Gene verbunden ist und durch Phosphatstoffwechsel 17,18 und Ausnutzung des Pentosephosphatwegs Phagen dNTP Biosynthese 18,19 geregelt. Im Vergleich dazu sind Strukturgene unter den mittleren bis späten Gene während der Infektion hergestellt und unterscheiden sich in den verschiedenen Phagen-host Systeme. Die Herstellung von Strukturproteinen sind abhängig von der Verfügbarkeit der viralen dNTP, und Energie-Pools für die Transkription, Translation und Anordnung 8. Das Kapsid und Schwanzfaserstrukturproteine ​​werden als die divergier aller viralen Protein-codierenden Genen erachtet und werden für eine erfolgreiche -Virionproduktion erforderlich. Ihre Divergenz wird in der Regel auf die aktive Rolle, die sie bei der Gestaltung der Virus-Wirt-Koevolution 20 spielen zurückzuführen. Divergier Proteinen, unabhängig von der Gen-Klasse, werden ohne weiteres bei Verwendung der herkömmlichen Homologie und Sequenzausrichtungstechniken übersehen. Ein Versuch, für die Beschränkungen mit strengen Sequenzvergleiche gesehen zu korrigieren hat in der Bioinformatik in der Lage, unter Verwendung von Sequenz Eigenschaften Verein, wie künstliche neuronale Netze 21 bestimmen geführt. Künstliche Neuronale Netze (KNN) ermöglichen die Vorhersage der strukturellen und metabolischen Gene erfordern jedoch stromabwärts experimentelle Validierung direkt zu charakterisierenGenfunktion. Das Ziel dieses Manuskript einem phenomic Protokollen zur Überwachung sowohl katabolischen und anabolischen Metabolismus eines Wirtsbakteriums während der Expression eines neuen Phagen-Gen bereitzustellen, funktionell durch ANNs vorhergesagt. Das Feld der Phenomics, die Biologie mit zellulären Phänotypen verbunden sind, ist in der Systembiologie gegründet, um bei der Untersuchung von Proteinen mit unbekannten oder pleiotrope Funktion unterstützen. Phenomic-Tools verwendet werden, um phänotypische Informationen genotypische Informationen zu verknüpfen. Wir stellen die Hypothese für putative Phagen Genen, deren Funktion (en) kann durch Beobachtung Host physiologischen Wirkungen während Phagen Genexpression bestimmt werden. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden zwei quantitative Methoden gewählt. Multi-Phänotyp-Assayplatten (MAPs) wurden verwendet, um Wirtssubstratverwertung und die anschließende Bildung von Biomasse zu überwachen, während metabolomics gemessen Host Metabolit Vielfalt und relative Häufigkeit während des Wachstums in bestimmten environmentale Zustände. Mutmaßlichen strukturellen und metabolischen Proteine ​​wurden in Escherichia coli überexprimiert und repräsentative Ergebnisse aus beiden Experimenten verglichen. Zahlreiche visuelle Techniken und Hochdurchsatz-Verarbeitungspipelines werden präsentiert, um experimentelle Replikation zu erleichtern. Schließlich sind die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der vorgestellten Methoden im Rahmen der erwarteten physiologischen Effekte für eine kommentierte Kapsidprotein und Phagen metabolischen Protein Thioredoxin, plus zwei putative AMGs diskutiert.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Sterivex Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m Millex Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m SteriCap Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Omnipore Membranfilter</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatten</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>Standard F-Bottom 96 Well Microtiterplatten</td></tr><tr><td>2 ml 96-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Seal Plate</td><td>Film Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L Nalgene quadratische Flaschen</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Nalgene quadratische Flaschen</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 Zoll Kontermutter für Schalttafeleinbau, schwarzes Nylon</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Innengewinde für Schalttafelmontage auf Widerhaken der Serie 200, 1/16 Zoll</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Innengewinde für Schalttafelmontage auf Widerhaken der Serie 200, 1/8 Zoll</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>Integrierter Luer-Sicherungsring für Widerhaken der Serie 500, 1/16 Zoll Innenschlauch</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Außengewinde mit Sicherungsring x Luer-Kupplung Cole</td><td>Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Schottverschraubungen mit Widerhaken, 1/4 Zoll OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure Schlauch, 1/16 Zoll ID x 1/8 Zoll OD</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure Schlauch, 1/4 Zoll Außendurchmesser x 1/8 Zoll ID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>Minipumpe mit variablem Durchfluss (Schlauchpumpe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* Filterzange</td></tr><tr><td>Multiplatten-Spektralphotometer Plattenleser</td><td>Molecular Devices Analyst GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterverteiler</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software:</td></tr><tr><td>Python Version 2.7.5</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.python.org/" target="_blank">http://www.python.org/</a></td></tr><tr><td>PyLab module</td><td></td><td></td><td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab" target="_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td></tr><tr><td>R Version 3.0.1</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/" target="_blank">http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://had.co.nz/reshape" target="_blank">http://had.co.nz/reshape</a></td></tr><tr><td>ggplot2 Bibliothek</td><td></td><td></td><td><a href="http://ggplot2.org/" target="_blank">http://ggplot2.org/</a></td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI Tech</td><td></td> Portal<td><a href="http://www.genecomposer.net" target="_blank">http://www.genecomposer.net</a><</td></tr><tr>td colspan="4">Dienstleistungen:</td></tr><tr><td>West Coast Metabolomics Center</td><td>UC Davis</td><td></td><td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/" target="_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.dna20.com" target="_blank">https://www.dna20.com</a></td></tr></tbody></table>

phage phenomics: physiologische ansätze zur charakterisierung novel virale proteine

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Aktuelle Untersuchungen in den Phagen-Wirt-Interaktionen sind abhängig von Extrapolation Wissen aus (meta) Genome. Interessant ist, dass 60 bis 95% aller Phagensequenzen teilen keine Homologie zu aktuellen kommentierten Proteinen. Als Ergebnis sind ein großer Teil der Phagen-Gene als hypothetisch annotiert. Diese Realität stark wirkt sich auf die Annotation von beiden strukturellen und Hilfsstoffwechselgene. Hier präsentieren wir Phenomic Methoden entwickelt, um die physiologische Reaktion (n) einer ausgewählten Wirts während der Expression eines dieser unbekannten Phagen-Gene zu erfassen. Multi-Phänotyp-Assay-Platten (Karten) werden verwendet, um die Vielfalt der Host Substratverwertung und die anschließende Bildung von Biomasse zu überwachen, während Metabolomik bietet bi-Produktanalyse durch die Überwachung Metabolit Fülle und Vielfalt. Beide Werkzeuge werden gleichzeitig verwendet, um eine phänotypische Profil mit Expression eines einzelnen putative Phagen offenen Leserahmen (ORF) verbunden sind. Repräsentative Ergebnisse für beide Methoden verglichen werden, highlighting die phänotypischen Unterschiede Profil eines Hosts, die entweder mutmaßlichen strukturellen oder metabolischen Phagen-Gene. Darüber hinaus sind die Visualisierungstechniken mit hohem Durchsatz Rechen Pipelines, experimentelle Analyse vereinfacht dargestellt.

Hier präsentieren wir phänomische Ansätze zur funktionellen Charakterisierung von mutmaßlichen Phagengenen. Zu den Techniken gehören ein entwickelter Assay, der in der Lage ist, den anabolen Metabolismus des Wirts zu überwachen, die Multi-Phenotype Assay Plates (MAPs), zusätzlich zu der etablierten Methode der Metabolomik, die in der Lage ist, Auswirkungen auf den katabolen Metabolismus zu messen.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Phagengene mit unbekannten Funktionen zu identifizieren und zu charakterisieren. Zunächst werden putative Phagen. Virale offene Leseraster, sogenannte ORFs, in E. coli exprimiert.Klone des Phagen. Orff-exprimierende E. coli werden in Multi-Phänotyp-Assay-Platten (MAPs) inoculiert, die Wachstumsmedium und verschiedene Substrate enthalten. Das bakterielle Wachstum wird anschließend über einen Zeitraum mittels Spektrometrie überwacht. Als zweite Analysemethode werden phagengenetisch exprimierende E. coli entweder im Dauerkulturverfahren oder durch serielle Batch-Kultivierung gezüchtet.Die resultierenden Wachstumsmetaboliten werden anschließend gesammelt und zur metabolomischen Analyse mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie mit Flugzeitdetektor (TOF-MS) eingeschickt. Die erhaltenen Daten liefern ein phänotypisches Profil, das mit der Expression eines einzelnen putativen phagenoffenen Leserahmens assoziiert ist. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um die Funktion unbekannter viralen Proteine aufzuklären.Es kann auch bei Studien angewendet werden, die den Zusammenhang zwischen Genotypen und Phänotypen untersuchen, sowie bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen und Wirten über verschiedene Biome hinweg. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sterile 96-Loch-Mikrotiterplatten mit der E. coli-Klon-Identifikationsnummer und dem Kartenschematyp kennzeichnen, der die in dem Assay getesteten Substrate angibt. Übertragen Sie unter aseptischen Bedingungen steriles Wasser in ein Flüssigkeitsreservoir.Danach mithilfe einer Mehrkanalpipette 60 Mikroliter Wasser in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte übertragen. Anschließend unter aseptischen Bedingungen drei X Basalmedium in ein Flüssigkeitsreservoir überführen. Danach mithilfe einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte übertragen.Unter Verwendung derselben Technik pipettieren Sie jeweils 50 Mikroliter jedes in der Kartenübersicht verwendeten Basalmediums. Danach übertragen Sie jeweils 30 Mikroliter jedes Substrats in das entsprechende Loch. Anschließend übertragen Sie mithilfe eines Mehrkanalpipettiers 10 Mikroliter Bakterienzellen in jedes Loch.Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitzen wechseln, bevor Sie die Pipette erneut in den Kulturstock einführen. Decken Sie jede Platte mit einem klebenden Plattenfilm ab. Drücken Sie den Film fest auf die Vertiefungen der Platte und entlang der Ränder, um eine gleichmäßige und dichte Versiegelung zu erzielen.Entfernen Sie mit einem sterilen Rasiermesser jegliche überschüssige Folie von den Rändern der Mikrotiterplatte. Legen Sie die vorbereitete Mappe in die Einlesehülle eines Multiskan-Spektrophotometers. Öffnen Sie die Software des Plattenlesegeräts und erstellen Sie ein Protokoll, um alle 30 Minuten die Absorption über insgesamt 32 Stunden zu messen.Unter Schütteln für 60 Sekunden zwischen den Messungen stellen Sie die Temperatur im Gerät auf 37 Grad Celsius ein. Sobald die Karte die eingestellte Temperatur erreicht hat, beginnen Sie das Protokoll nach 32 Stunden und nehmen Sie die Karte aus der Ausgabehülse des Plattenlesegeräts. Kennzeichnen Sie jede Datendatei mit der E.-coli-Identifikationsnummer, dem Datum und dem Karten-Schema-Typ.Analysieren Sie die Daten wie in dem begleitenden Dokument beschrieben, um das Wachstum und biologisch relevantes Wachstum zu beurteilen. Parameter Aus der Metabolitanalyse können Zellen entweder durch kontinuierliche oder serielle Passagen in Batch-Kultur gezüchtet werden. Um einen stationären Zustand aufrechtzuerhalten.Hier demonstrieren wir eine kontinuierliche Kultur. Sterilisieren Sie die Komponenten eines 75-Milliliter-Kontinuierlichen-Kultur-Reaktors sowie einer zwei-Liter-Zulaufflasche, wie in der beigefügten Anleitung beschrieben. Nach der Sterilisation bringen Sie alle autoklavierten Materialien in einen biologischen Sicherheitswerkbank und schalten Sie das UV-Licht ein, während das Medium abkühlt. Sobald das Medium abgekühlt ist, geben Sie 0,1 % L-Arabinose und 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.Ampicillin zu 75 Millilitern 0,5-XLB-Brühe hinzufügen und in den Durchflussreaktor überführen. Die Kappe des Durchflusskulturreaktors abwickeln und auf den Reaktor schrauben. Berühren des Probenahmerohrs vermeiden, die Kappe der Zulaufflasche abwickeln und auf die Zulaufflasche schrauben.Vermeiden Sie es, das Probenahmerohr zu berühren, und halten Sie das 18 Zoll lange Schlauchstück, das am Port Epsilon befestigt ist, steril. Entfernen Sie die Verpackung des 18 Zoll langen Schlauchs und des Schlauchs für die peristaltische Pumpe. Stecken Sie ein Ende des 18 Zoll langen Schlauchs auf ein Ende des Verbindungsstücks für die peristaltische Pumpe; befestigen Sie das andere Ende des Verbindungsstücks für die peristaltische Pumpe am 18 Zoll langen Schlauch.Verbinden Sie den angeschlossenen Hafen Epsilon des Flaschendeckels mit 0,22-Mikrometer-Filtereinheiten an den Häfen Beta und Delta des kontinuierlichen Kulturreaktors. Bringen Sie eine 0,22-Mikrometer-Filtereinheit am Adapter des Hafens Alpha an. Und verbinden Sie hiermit den 18 Zoll langen Schlauch in der Biosicherheitswerkbank.Inokulieren Sie den Chemostatreaktor mit 100 µL einer Übernachtkultur von E. coli, die wie im beigefügten Dokument beschrieben hergestellt wurde. Verschließen Sie die Deckel des Reaktors und der Zulaufflasche und stellen Sie das System dann in einen 37 °C-Inkubator. Rüsten Sie den Inkubator mit einem Magnetrührer und einer Mini-Peristaltikpumpe aus, und setzen Sie den Schlauchadapter der Peristaltikpumpe in die Peristaltikpumpe ein.Der Schlauch aus der Zuführflasche führt in die Pumpe und von dort zum Reaktor. Stellen Sie die Pumpe auf schnell, um sie zu starten. Wechseln Sie auf Vorwärtslauf, um sicherzustellen, dass das Medium durch den Schlauch fließt.Stellen Sie den Reaktor auf das magnetische Rührgerät und beginnen Sie mit dem Mischen. Lassen Sie den kontinuierlichen Kulturreaktor 24 Stunden lang equilibrieren, bevor am nächsten Tag eine Probe entnommen wird. Um eine Probe aus der kontinuierlichen Kultur zu entnehmen, schrauben Sie eine 5-Milliliter-Luer-Lock-Spritze auf Port Gamma und ziehen 4,5 Milliliter Kultur ab.Verwenden Sie 500 Mikroliter der Kultur, um die optische Dichte bei 600 Nanometern zu messen. Verwenden Sie anschließend den Rest der Aliquote, um vier ein-Milliliter-Kulturen mit einem OD 600 von 0,35 herzustellen, und 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um die Proben für die Gaschromatographie mit Flugzeitmassenspektrometrie oder GC-TOF-MS vorzubereiten. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 16.900 × g für zwei Minuten, um sie zu pelletieren.Nach dem Zentrifugieren dekantieren Sie das Überstand und waschen mit 500 Mikrolitern PBS. Führen Sie diesen Waschschritt ein zweites Mal durch, dekantieren Sie das Überstand endgültig und tauchen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den pelletierten Zellen anschließend in flüssigen Stickstoff ein.Speichern Sie die Proben, bis die Blasenbildung aufhört, in einem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank. Wiederholen Sie die Probenahme alle 12 Stunden über vier Tage hinweg, nachdem alle Proben gesammelt wurden. Versenden Sie drei Proben pro Klon auf Trockeneis an eine Metabolomik-Zentraleinrichtung zur Probenaufarbeitung, Analyse und Normalisierung von GC gegenüber f ms, um virale offene Leseraster zu erhalten.Das Meerwasser wurde von der Starbuck-Insel und dem Caroline AOL der südlichen Line Islands unterhalb der Korallengrenzschicht gesammelt. Das bakterielle Wachstum unter 72 kohlenstoffspezifischen Bedingungen wurde für 47 Klone mithilfe von Karten bewertet. Die resultierenden Daten wurden anschließend verwendet, um die Klone in Wachstumserwartung, Gains of Function, Loss of Function und Phänotypen ohne Wachstum einzuteilen.Um die Hypothese zu überprüfen, dass Klone mit funktionell ähnlichen Proteinen Metabolomik-Profile aufweisen, wurden die medianen Metabolitenkonzentrationen für 84 in kontinuierlicher Kultur gezüchtete Klone mittels GC-TOF-MS bestimmt. Die resultierenden Daten wurden anschließend verwendet, um die Klone basierend auf ihren relativen Metabolitenkonzentrationen, die durch Farbe gekennzeichnet sind, hierarchisch zu gruppieren. Die am häufigsten vorkommenden Metaboliten sind rot dargestellt, während die am seltensten vorkommenden in dunkelblau dargestellt sind. Eine vorläufige Metabolom-Analyse ergab, dass, obwohl strukturelle und metabolische Gene nicht eindeutig voneinander getrennt werden können, jene Gene, die ähnliche Effekte auf den Wirt zeigen, miteinander korrelieren. Beispielsweise gruppiert sich das annotierte Kapsidgen eng mit den in dieser Studie hervorgehobenen putativen metabolischen Genen EDT 24 40 und EDT 24 41. Untersuchungen mithilfe eines öffentlich verfügbaren Programms zur Vorhersage der Transmembrantopologie und von Signalpeptiden lieferten Hinweise darauf, dass beide putativen metabolischen Gene eine einzelne Transmembrandomäne enthalten.Interessanterweise weisen fünf der neun Klone in der ersten Clustergruppe vorhergesagte Transmembrandomänen mit derselben Topologie auf. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass diese Methode in der Lage ist, Informationen über Metabolitprofile der Klone, potenzielle Klone mit verwandten Funktionen sowie Metabolitausreißer unter den Klonen bereitzustellen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die dargestellten Methoden stark von der Bakterienphysiologie beeinflusst werden.Es müssen Überlegungen angestellt werden, um sicherzustellen, dass klonal unabhängige Gruppen untersucht werden, eine Kontamination verhindert wird und mithilfe geeigneter Kontrollen nur eine einzige Variable getestet wird.

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Eine neue Generation von zellfreien Transkription-Übersetzung Plattformen wurde entwickelt, um die biochemischen Systemen in Vitro durch die Ausführung des Gens Schaltungen aufbauen. In diesem Artikel beschreiben wir, wie aus ihrem Genom mit einem alle E. Coli zellfreie TXTL System Bakteriophagen MS2, ΦΧ174 und T7, synthetisiert werden.

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen Aufbau, Charakterisierung und Auswahl (gegen das Ziel der Wahl) einer "Domainome"-Bibliothek, die aus jeder DNA-Quelle hergestellt. Dies wird erreicht durch eine Forschungs-Pipeline, die verschiedenen Technologien kombiniert: Phagen-Display, eine klappbare Reporter und Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Web-Tool für die Datenanalyse.

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Dieses Protokoll ermöglicht es, die Auswirkungen von Prophagen auf ihre Wirte aufzudecken. Die Bakterienkulturen werden unter Bedingungen synchronisiert, die den lysogenen Zustand am besten unterstützen und die spontane Induktion begrenzen. Die RT-qPCR unterscheidet eindeutig zwischen Prophagen-restriktiven Genen und solchen, die von der Phagenkontrolle abgekoppelt sind, von solchen, die während des lytischen Replikationszyklus exprimiert werden.

Den Einfluss von Bakteriophagen in gemäßigten Breiten auf ihre Lysogene durch Transkriptomik verstehen

Zur Quantifizierung des langfristigen Bakterienwachstums in Gegenwart von Bakteriophagen wird eine auf optischer Dichte basierende Mikrotiterplattenmethode beschrieben, die für Actinomyceten und andere langsam wachsende Bakterien geeignet ist. Diese Methode umfasst Modifikationen zur Reduzierung der Verdunstung und Deckelkondensation sowie R-Code zur Berechnung von Virusinfektionsmetriken, einschließlich der Fläche unter der Kurve, des Wachstumsmaximums und der relativen Virulenz.

Ein angepasster optischer Dichte-basierter Mikrotiterplatten-Assay zur Charakterisierung der Actinobacteriophagen-Infektion

Bakteriophagen (Phagen), Viren, die Bakterien infizieren, sind ein integraler Bestandteil des Darmmikrobioms. Obwohl diese symbiotischen Bewohner die bakterielle Fitness und Populationsdynamik vorantreiben, ist wenig darüber bekannt, wie sie sich auf die Darmhomöostase und -krankheit auswirken. Dieses Protokoll untersucht isolierte T4-Phagen in einem Mausmodell, die an andere Phagen-Bakterien-Paare angepasst werden können.

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Hier beschreiben wir einen neu entwickelten Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay, der ein durchflusszytometrisches System mit zwei Reportern verwendet, um gleichzeitig zwei einzigartige Spike-Protein-Epitope auf intakten Viruspartikeln des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu detektieren, die von Angiotensin-konvertierenden Enzym-2-gekoppelten magnetischen Mikrosphären eingefangen wurden.

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

Hier beschreiben wir Methoden der Probenahme aus den euphotischen Zonen von Meeres- und Süßwasserökosystemen zur Isolierung von Cyanophagen (und ihren Wirten) und Post-Sampling-Prozesse, die einzelne Genotypen anreichern und die Dynamik der Virus-Wirt-Interaktion charakterisieren.

Umweltproben von photosynthetischen Mikroben und ihren Viren: Vom Feld ins Labor

Die Virochip ist ein pan-virale Microarray entwickelt, um gleichzeitig zu erkennen alle bekannten Viren sowie neue Viren auf der Basis von konservierten Sequenzhomologie. Hier zeigen wir, wie man ein Virochip Testlauf zu klinischen Proben auf das Vorhandensein von sowohl bekannte als auch unbekannte Viren zu analysieren.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

Erfahren Sie physiologische Ansätze zur Charakterisierung neuer viraler Proteine in Phagen mittels Multi-Phänotyp-Assay-Platten und Metabolomanalyse in E. coli. Diese Methode verknüpft Genotyp mit Phänotyp.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Weitere Videos entdecken