Name: Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Co-Immunopräzipitation zur Untersuchung der Interaktion zwischen dem antiviralen MX1-Protein und dem Influenza-A-Virus-Nukleoprotein in menschlichen Zellen.

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Diese Arbeit wurde von FWO-Vlaanderen, der IOF Projekt IOF10 / StartT / 027 und der Universität Gent Sonderforschungsstipendium BOF12 / GOA / 014 unterstützt.

Hinweis: Die nach der Transfektion und Co-Immunopräzipitation Protokoll wird für einen 9 cm Petrischale Format etabliert. Andere Formate sind auch nach der Skalierung des Protokolls möglich. 1. Seeding die humane embryonale Nierenzellen (HEK) 293T-Zellen <ol><li> Samen der HEK293T Zellen einen Tag vor der Transfektion mit 1,2 x 10 6 Zellen pro 9 cm Petrischale in 12 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 0,4 mM Natriumpyruvat ergänzt, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin. </li><li> Wachsen die Zellen 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Sichtprüfung der Morphologie und der Lebensfähigkeit der Zellen mit einem umgekehrten Lichtmikroskop vor der Transfektion. Die Zellen müssen subkonfluenten für optimale Transfektionseffizienz sein. </li></ol> 2. Calciumphosphat-Transfektion von HEK293T Zellen Notiz: Verwenden 0,5-1 ug pCAXL-NP oder leer pCAXL Plasmid in Kombination mit 1-3 ug pCAXL-Mx1 pro 9 cm Schale. Verwenden eine gleiche Menge an Gesamt Plasmid DNA in allen Proben; einstellen mit leeren Plasmid, wenn nötig. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Transfektion Puffer: <ol><li> Bereiten Tris-EDTA (TE) mit Konzentrationen von 1,0 mM Tris-HCl pH 8,0 und 0,1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Bereiten BS / HEPES mit Konzentrationen von 25 mM HEPES (5,96 g / L, 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure), 274 mM NaCl (16 g / L), 10 mM KCl (0,74 g / L), 1,5 mM NaHPO 4 · 12H 2 O (0,5 g / l) und 11,1 mM Dextrose (2 g / L). PH-Wert auf 7,05. </li><li> Bereiten CaCl 2 / HEPES mit Konzentrationen von 1,25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183,8 g / l) und 125 mM HEPES (29,79 g / l). PH-Wert auf 7,05 mit NaOH. </li></ol></li><li> Warm die Transfektion Puffer bei 37 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie die Plasmid Proben hergestellt durch Verdünnen der Plasmid-DNA in 600 ul TE.Diese Mischungen sind in Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen. </li><li> Fügen Sie 150 ul CaCl 2 / HEPES in einer tropfenweise Art und Weise an die Plasmid-Proben und mischen durch Pipettieren 3 mal nach oben und unten. </li><li> Bereiten Sie die Transfektionslösung von tropfenweiser Zugabe der Plasmid-Lösung (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES, 750 ul) zu 750 ul der BS / HEPES-Puffer in einer frischen Platte mit 6 Vertiefungen vorgesehen sind. Verteilen Sie die Plasmid-Lösung gleichmäßig über die gesamte Vertiefung, die BS / HEPES-Puffer. </li><li> Schüttle die Transfektionslösung auf einem Plattenschüttler für 90 sec bei 1.000 UpM. </li><li> Inkubieren der Mischung für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie den Transfektionslösung (1,5 ml) tropfenweise zu den Zellen. Verwenden Sie einen P1000 Mikropipette, die Transfektionslösung auf die Zellen tropfen. Zerstreuen Sie die Mischung über den gesamten 9 cm Petrischale und schütteln Sie die Platte ganz sanft. </li><li> Die Zellen für 6 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Dann entfernen Sie das Medium durch Absaugen und wi sofort zu ersetzenth 12 ml frisch, vorgewärmte Medium. Die frisches Medium zu den Zellen hinzu sanft auf Zellablösung zu verhindern. Dazu halten Sie die Spitze der Pipette an der Seite des Brunnens und drücken Sie sie vorsichtig aus dem Medium. </li><li> Die Zellen für weitere 16 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Co-Immunpräzipitation Hinweis: Führen Sie die Co-Immunopräzipitation 24 Stunden nach der Transfektion. <ol><li> Vorbereitung des geringen Salz Lysepuffer und hohen Salzwaschpuffer. <ol><li> Wird eine Stammlösung von 2 M N-Ethylmaleimid (NEM) durch Wiegen der Menge an NEM und in absolutem Ethanol gelöst wird. Bereiten Sie die NEM-Stammlösung frisch vor Gebrauch. ACHTUNG: NEM ist sehr giftig, vorzubereiten und diese Stammlösung in einem Abzug. </li><li> Bereiten niedrigen Salz Lysepuffer in einer Konzentration von 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1% NP40 und eine Protease-Inhibitor-Cocktail (aufzulösen 1 Tabellet in 50 ml Lyse-Puffer). Hinzufügen NEM bis zu einer Endkonzentration von 25 mM (dh 1:80 verdünnt). Halten Sie auf dem Eis nach der Zugabe der Protease-Inhibitoren und NEM. Hinweis: Achten Sie stets darauf, die Protease-Inhibitoren und NEM vor Gebrauch frisch. </li><li> Vorbereiten einer Hochsalzwaschpuffer in Konzentrationen von 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA und 1% NP40. Beachten Sie, dass der hohe Salzwaschpuffer nicht NEM enthalten. </li></ol></li><li> Herstellung von Zelllysaten. <ol><li> Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit 2 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Sehr sanft fügen Sie den Waschpuffer, wie HEK293T-Zellen lösen leicht. </li><li> Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 600 ul eiskaltem salzarme Lysepuffer pro 9 cm Petrischale. </li><li> Die Inkubation erfolgt während 20 Minuten auf Eis. Stellen Sie sicher, daß die Platten horizontal gehalten, um eine vollständige Bedeckung der Plattenoberfläche mit Lysepuffer gewährleisten. Schütteln Sie die Platten alle 5 min. </li><li> Sammeln des Zelllysats in einem 1,5 ml MikrozentrifugenRohr und Zentrifuge für 3 Minuten bei 4 ° C und 16.000 × g, um die unlösliche Fraktion zu pelletieren. </li><li> Übertragen Sie die lösliche Fraktion, dh dem Zelllysat in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten. Unmittelbar mit dem Co-Immunpräzipitationsprotokoll fortzusetzen, um eine Dissoziation der interagierenden Proteine ​​zu verhindern. Führen alle folgenden Schritte so weit wie möglich auf Eis oder bei 4 ° C, um die proteolytische Aktivität in den Lysaten zu begrenzen. </li></ol></li><li> Erzeugung von Immunkomplexen. Anmerkung: In diesem Schritt wird das Protein von Interesse mit dem entsprechenden Antikörper gebunden ist. Um die NP-Mx1 Interaktion zu studieren, mit einem Maus-Anti-NP monoklonaler Antikörper. <ol><li> Für jede Probe mischen 135 ul Lysat mit 2 &amp; mgr; l Anti-NP-monoklonalen Antikörper und 113 ul niedrigen Salz Lysepuffer (Gesamtvolumen 250 ul). Den übrigen Lysat bei -20ºC für eine weitere Analyse, wie Western-Blotting, um die Expressionsniveaus des vermuteten intera dokumentierenRésol Partner in den transfizierten Zellen. Anmerkung: Alternativ, die Proteinkonzentration des Lysats (zB mit Bradford-Reagens) und mit einem Betrag von Gesamtprotein, beispielsweise 400 &amp; mgr; g für jeden Lysats. </li><li> Inkubieren des Antikörper-Lysat Mischung für 3 Stunden auf einem sich drehenden Rad bei 4 ° C. Dieser Schritt kann auf eine Inkubation über Nacht verlängert werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Protein G-Kügelchen. Anmerkung: Die Protein-G-Kügelchen werden versandt und in 20% Ethanol zur Konservierung gespeichert. Die Wulst-Slurry besteht normalerweise aus 50% Perlen und diese Perlen gewaschen werden müssen, bevor sie verwendet werden, um die Immunkomplexen immunpräzipitieren. <ol><li> Benutzen 50 ul Perlen, also 100 ul Kügelchen-Aufschlämmung, für jede Probe. Die Menge der Kügelchen für alle Proben in der Co-Immunpräzipitationstest in einem Rohr erforderlich waschen. Schneiden Sie die Spitze eines 1 ml Pipettenspitze zu Pipetten der Wulst-Slurry zu erleichtern. </li><li> Zentrifugieren Sie die Protein G Kügelchen-Aufschlämmung bei 8.000 xg und 4 ° C für 30 sec. Entfernen Sie die Ethanollösung und das gleiche Volumen des geringen Salz Lysepuffer. Zentrifugieren Sie die Protein G Kügelchen-Aufschlämmung bei 8.000 xg und 4 ° C für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal. Hinweis: Die salzarme Lysepuffer verwendet, um die Perlen zu waschen muss nicht Protease-Inhibitoren oder NEM enthalten. </li><li> Schätzen Sie das Volumen von Protein G-Kügelchen, und fügen Sie ein gleiches Volumen geringer Salz Lysepuffer, eine neue 50% Perlen Schlamm in geringen Salz Lysepuffer zu machen. </li><li> Für jede Probe wurden dann 100 ul der Wulst-Slurry in einem frischen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch. Sei vorsichtig, um die Wulst-Aufschlämmung vor dem Teilen zu resuspendieren, da diese Perlen schneller sedimentieren am Boden des Rohrs. </li></ol></li><li> Immunpräzipitation der Immunkomplexen durch Protein G-Kügelchen und ihre Elution. <ol><li> Vor der Verwendung der Protein G-Kügelchen für die Immunpräzipitation, Zentrifugieren Sie alle Röhrchen 30 s bei 8.000 xg und 4 ° C undDurch visuelle Überprüfung, dass es eine gleiche Menge an Perlen in allen Proben vorhanden. Falls erforderlich die Menge an Perlen in einigen der Proben und Zentrifuge wieder. Die Überstände verwerfen. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören. </li><li> Kurz zentrifugieren Immunkomplexen (dh., Lysaten mit Antikörper, 250 ul) für 30 sec bei 8.000 x g und 4 ° C, um die gesamte Probe zu dem Boden des Röhrchens zu sammeln. Übertragen Sie die Immunkomplexen auf die Protein G-Kügelchen (50 ul). </li><li> Inkubiere 60 min auf einem sich drehenden Rad bei 4 ° C. Inkubieren Sie nicht diese Immunkomplexe länger als 75 min mit den Perlen, um unspezifische Bindung von Proteinen an die Protein-G-Perlen zu verringern. </li><li> Zentrifugieren Protein G-Kügelchen (mit gebundenen Immunkomplexe) für 30 sec bei 8.000 x g und 4 ° C und Entfernen der Überstände. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören. Optional: Speichern dieses Überstände bei 4 ° C oder -20 ° C für eine spätere Analyse,beispielsweise um die Menge an ungebundenen Proteins abzuschätzen. </li><li> Für etwa 5 min mit 900 ul Hochsalz Lysepuffer waschen die Protein G-Kügelchen. Stellen Sie sicher, dass die Beads vollständig im Waschpuffer für optimale Wasch suspendiert. Zentrifugieren Sie die Protein G-Kügelchen für 30 Sekunden bei 8.000 xg und 4 ° C und entsorgen Sie die Überstände. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 4 mal. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören, um den Verlust von immunpräzipitierten Material vermeiden. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer zu den Kügelchen und erhitzt die Suspension 10 min bei 95 ° C, um die (Co) immunpräzipitierten Proteine ​​zu eluieren. <ol><li> Herstellung von 10 ml 6x Laemmli-Puffer mit 1 g Natriumdodecylsulfat, 3,5 ml Glycerin, 3,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8 und 420 &amp; mgr; l β-Mercaptoethanol. Einzustellen, um ein Gesamtvolumen von 10 ml durch Zugabe von destilliertem Wasser. Verdünnen Sie 3-mal in destilliertem Wasser auf 2x Laemmli-Puffer zu erhalten. ACHTUNG: &amp;# 946; -Mercaptoethanol giftig ist, herzustellen und zu verwenden Laemmli-Puffer in einem Abzug. </li></ol></li><li> Nach dem Erhitzen Zentrifuge die Protein G-Kügelchen für 30 Sekunden bei 8.000 xg und die Proben bei 4 ° C (kurzfristig) oder -20 ° C (langfristig) zu speichern. </li></ol></li></ol> 4. Analysieren Sie den (Mit-) immunpräzipitierten Proteine <ol><li> Visualisierung der in dem Zelllysat und Eluat der Co-Immunopräzipitation von SDS-PAGE und Western-Blotting 20 21,22 vorhandenen Proteine. In der Regel laden Hälfte des Laemmli Eluat auf Gel. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören, wenn die Entnahme von Proben für die Gelbeladung. Mx1 und NP-Expression wurden mit einem anti-Mx1 und Anti-NP-Antikörper bzw. 14 offenbart. Die Banden wurden mit HRP-basierten Chemilumineszenz und einer Röntgenfilmentwickler detektiert. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen der antiviralen Proteine ​​und ihre virale Ziele ist sehr wichtig, um die Details des antiviralen Mechanismus dieser Proteine ​​zu verstehen. Dies kann neue Erkenntnisse darüber, wie Viren und ihren Wirten co-entwickelt geben und die Grundlage für die Entwicklung neuer antiviraler Strategien. Die hier beschriebene optimierte Coimmunpräzipitation Protokoll ermöglicht, die Interaktion zwischen der Maus Mx1-Protein und seine virales Ziel, das Influenza-NP-Protein zu untersuchen. Der...

Myxovirus Widerstand (Mx) Proteine ​​sind ein wichtiger Teil der angeborenen Immunabwehr gegen virale Pathogene. Diese Proteine ​​sind groß dynamin artigen GTPasen, die durch Typ I und Typ III Interferone induziert werden. Die entsprechenden Mx Gene in fast allen Wirbeltieren vorhanden sind in einer oder mehreren Kopien und deren Genprodukte hemmen ein breites Spektrum von Viren, einschließlich Orthomyxoviridae (z. B. Influenza-Virus), Rhabdoviridae (z. B. vesikuläres Stomatitis-Virus), Bunyaviridae (z. , La Crosse Virus) und Retroviridae (zB Human Immunodeficiency Virus-1) 1-4. Es ist unklar, wie diese Proteine ​​erkennen, wie ein breites Spektrum von Viren, ohne ersichtlichen gemeinsamen primären Sequenzmotive in dieser Viren. Analyse der Interaktion von Mx-Proteine ​​mit den viralen Ziele, die möglicherweise mit höherer Ordnung Komplexe mit anderen Wirtszellfaktoren, wird dazu beitragen, die molekularen Mechanismen zu verstehen that in der Rüstungswettlauf zwischen Viren und ihren Wirten entwickelt. Das Zusammenspiel von Säugetier Mx Proteine ​​und virale Ziele wurde sehr ausgiebig für den menschlichen M · A untersucht. Menschliche MxA können die Replikation vieler Viren, einschließlich der Orthomyxoviren Influenza A und Thogoto Virus zu hemmen. M · A bindet die Thogoto Virus Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs) und damit ihre Kern Eintrag, der in Block 5 der Infektion führt zu verhindern. Diese Wechselwirkung zwischen MxA und Thogoto Virus vRNPs wurde mit Co-Sedimentation und Co-Immunopräzipitation 6-9 gezeigt. Wie Mx-Proteine ​​hemmen Influenza-A-Viren ist weniger klar. Ein Hauptproblem ist, dass es nicht einfach ist, eine Wechselwirkung zwischen einem Mx-Protein und einem Influenza-Genprodukt zu demonstrieren. Ein Bericht zeigte eine Interaktion zwischen Mensch M · A und der NP-Protein in Influenza A-Virus infizierten Zellen 10. Diese Wechselwirkung kann nur durch Zusammen immunopr gezeigtecipitation wenn die Zellen mit dem Vernetzungsmittel Dithiobis (succinimidylpropionat) vor der Lyse behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung transiente und / oder schwach. Neuere Studien haben gezeigt, daß der Differenz Mx Empfindlichkeit verschiedener Influenza-A-Stämme wird durch die Entstehung des NP-Proteins 11,12 bestimmt. Im Einklang mit dieser, können Influenza-A-Viren zum Teil aus Mx Kontrolle entziehen durch Mutation spezifische Reste in der NP-Protein 13. Dies deutet darauf hin, dass das Hauptziel des Influenza-A-Viren, die für Wirts Mx das NP-Protein, in vRNP Komplexe wahrscheinlich NP montiert. Jedoch keines dieser neuere Studien zeigten eine Interaktion zwischen Influenza NP oder vRNPs und entweder menschlichen oder Maus MxA Mx1. Kürzlich haben wir gezeigt, zum ersten Mal, eine Wechselwirkung zwischen dem Influenza NP und der Maus Mx1-Protein mit einer optimierten Zusammen Immunpräzipitationsprotokoll 14, die hier im Detail beschrieben wird. Im allgemeinen co-immunoprecipitation ist einer der am häufigsten verwendeten biochemischen Ansätzen zur Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Diese Technik wird oft als Alternative Techniken, beispielsweise Hefe-Zwei-Hybrid bevorzugt, da sie es ermöglicht, Protein-Protein-Wechselwirkungen in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Co-Immunfällung kann endogen exprimierten Proteine ​​durchgeführt werden, wenn Antikörper gegen die Proteine ​​von Interesse zur Verfügung. Alternativ können die Proteine ​​von Interesse in die Zelle durch Transfektion oder Infektion exprimiert werden, und ein Affinitäts-Tag verwendet werden. Zusätzlich zu den oben genannten Vorteilen hat die beschriebene Coimmunpräzipitation Protokoll ermöglicht die Detektion von schwachen und / oder transienten Protein-Interaktionen. Der Hauptbestandteil in dieser optimierten Protokolls ist die Zugabe von N-Ethylmaleimid (NEM) in der Zell-Lyse-Puffer. NEM ist ein Alkylierungsmittel, das mit freien Thiolgruppen wie gegenwärtig Cysteine ​​reagiert, bei einem pH von 6,5-7,5, um eine stabile Thio-Ester zu bilden(Abbildung 1). Bei höheren pH kann NEM auch mit Aminogruppen reagieren oder Hydrolyse 15 zu unterziehen. NEM wird typischerweise verwendet, um freie Thiolgruppen zu blockieren, um die Bildung einer Disulfidbindung zu verhindern oder zu hemmen, die enzymatische Aktivität. Zum Beispiel wird häufig verwendet, um NEM desumoylating Enzyme, die Cystein-Proteasen sind blockieren. In der beschriebenen Co-Immunpräzipitationsprotokoll wurde NEM anfänglich in dem Lysepuffer enthalten, da es war berichtet worden, dass die Sumoylierung von Influenzaproteine ​​können die Wechselwirkungen zwischen viralen Proteinen 16 beeinflussen. Unerwarteterweise ist der Zusatz von NEM erwiesen Taste, um die Wechselwirkung zwischen Influenza NP und Maus Mx1 durch Co-Immunpräzipitation dokumentiert sein. Es ist unklar, warum die Zugabe von NEM ist von entscheidender Bedeutung, um die NP-Mx1 Interaktion zu erkennen. Möglicherweise ist die Interaktion zu vorübergehenden und / oder schwach. NEM könnte die Interaktion, beispielsweise zu stabilisieren, unter Wahrung einer bestimmten Konformation Mx1, ein virales Protein oder sogar eine unbekannte dritte Komponente. Eine derartige stabilisierende Wirkung von NEM ist zuvor beobachtet worden, beispielsweise für das Zusammenwirken zwischen der Ribonukleotidreduktase M1 und sein Inhibitor Gemcitabin (F2dC) 17. Mx1 und NP beide enthalten mehrere Cystein-Reste, die durch NEM modifiziert werden könnte. Zum Beispiel wird eine aktuelle Studie von Rennie et al., Dass ein stielfrei M · A-Variante enthält drei Lösungsmittel ausgesetzt Cysteinreste, die von Iodacetamid geändert werden können. Mutagenierten Reste Serine beeinflusste nicht die enzymatische Aktivität des MxA, aber verhindert disulfidvermittelte Aggregation 18. Da diese Cysteine ​​in Mx1 erhalten, bedeutet dies, dass die analogen Cysteine ​​in Mx1 durch NEM und als solche beeinflussen dessen Konformation oder Löslichkeit modifiziert werden. Außerdem könnte NEM beeinflussen auch die GTPase-Aktivität von Mx1, die für die Anti-Influenza-Aktivität Mx1 ist, und dadurch die Wechselwirkung zwischen Mx1 und NP stabilisieren. Allerdings ist eine direkte Wirkung von NEM auf der GTPase activität der Mx1 ist unwahrscheinlich, da NEM ist auch erforderlich, um die Interaktion zwischen Influenza NP und GTPase inaktive Mutanten des Mx1 Protein 14 zu erkennen. Es ist klar, ist mehr Forschung notwendig, um die Wirkung von NEM auf der NP-Mx1 Interaktion zu entwirren. Zusammenfassend ermöglicht die beschriebene Coimmunpräzipitation Protokoll, um die Wechselwirkung zwischen der antiviralen Mx1-Protein und seine virales Ziel, das Influenza-NP-Protein zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um andere schwache bzw. transiente Interaktionen, die auf die Stabilisierung der spezifischen Proteinzustände hängen untersuchen. Protein-Protein-Wechselwirkung, die auf spezifische Konformationen abhängig sind zuvor beschrieben worden, beispielsweise Calcium-bindende Proteine ​​wie Calmodulin 19. Schließlich könnte die vorteilhafte Rolle der NEM auch andere Methoden, die Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Ko-Sedimentation Assays verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt</td><td>Gibco</td><td>52100-047</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimid</td><td>Sigma</td><td>E-3876</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I-30212</td><td>auch bekannt als NP40</td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-NP-Antikörper</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-4282</td><td>Aszites-Mischung aus den Klonen A1 und A3</td></tr><tr><td>polyklonales Anti-RNP-Serum</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-3133</td><td>gerichtet gegen A/Scotland/840/74 (H3N2)</td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4FF</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9068-36</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrat</td><td>Pierce</td><td>Artikel-Nr.: 32106</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunopräzipitation der maus mx1 protein mit dem influenza a virus nucleoprotein

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Proteinen ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer Funktion(en). Eine sehr leistungsfähige Methode, die häufig verwendet wird, um Wechselwirkungen von Proteinen mit anderen Makromolekülen in einer komplexen Probe zu untersuchen, ist die sogenannte Co-Immunpräzipitation. Das beschriebene Co-Immunpräzipitationsprotokoll ermöglicht es, die Interaktion zwischen dem antiviralen Myxovirus-Resistenzprotein 1 (Mx1) und einem seiner viralen Ziele, dem Influenza-A-Virus-Nukleoprotein (NP), zu demonstrieren und weiter zu untersuchen. Das Protokoll beginnt mit transfizierten Säugetierzellen, aber es ist auch möglich, mit Influenza-A-Viren infizierte Zellen als Ausgangsmaterial zu verwenden. Nach der Zelllyse wird das virale NP-Protein mit einem spezifischen Antikörper heruntergezogen und die resultierenden Immunkomplexe werden mit Protein-G-Kügelchen ausgefällt. Der erfolgreiche Pull-down von NP und die Co-Immunpräzipitation des antiviralen Mx1-Proteins werden anschließend durch Western Blot nachgewiesen. Voraussetzung für eine erfolgreiche Co-Immunpräzipitation von Mx1 mit NP ist das Vorhandensein von N-Ethylmaleimid (NEM) im Zelllysepuffer. NEM-Alkylate befreien Thiolgruppen. Vermutlich stabilisiert diese Reaktion die schwache und/oder transiente NP-Mx1-Interaktion, indem eine spezifische Konformation von Mx1, sein virales Ziel oder eine unbekannte dritte Komponente erhalten bleibt. Eine wichtige Einschränkung von Co-Immunpräzipitationsexperimenten ist das versehentliche Abziehen kontaminierender Proteine, das durch unspezifische Bindung von Proteinen an die Protein-G-Kügelchen oder Antikörper verursacht wird. Daher ist es sehr wichtig, Kontrolleinstellungen einzuschließen, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen. Das beschriebene Co-Immunpräzipitationsprotokoll kann verwendet werden, um die Interaktion von Mx-Proteinen verschiedener Wirbeltierarten mit viralen Proteinen, einem beliebigen Proteinpaar oder eines Proteins mit anderen Makromolekülen zu untersuchen. Die vorteilhafte Rolle von NEM bei der Stabilisierung schwacher und/oder transienter Wechselwirkungen muss für jedes Wechselwirkungspaar individuell getestet werden.

N-Ethylmaleimid ist eine organische Verbindung, die verwendet werden können, um irreversibel ändern freien Thiolgruppen, beispielsweise zur Cysteinproteasen (Figur 1) zu hemmen. Die antivirale Mx1-Protein hemmt die Influenza-A-Virus-Replikation durch die Interaktion mit dem viralen Nukleoprotein. Die hier beschriebene optimierte Co-Immunopräzipitation-Protokoll ermöglicht, diese NP-Mx1 Interaktion zu studieren. HEK293T-Zellen wurden mit Expressionsvektoren für die a...

Dieses Co-Immunpräzipitationsprotokoll ermöglicht es, die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein des Influenza-A-Virus und dem antiviralen Mx1-Protein in menschlichen Zellen zu untersuchen. Das Protokoll unterstreicht die Bedeutung von N-Ethylmaleimid für die erfolgreiche Co-Immunpräzipitation von Mx1 und Influenza-A-Virus-Nukleoproteinen.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wechselwirkung zwischen dem antiviralen MX1-Protein und seinem viralen Ziel, dem Influenza-Nukleoprotein, mittels Co-Immunpräzipitation nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst transfizierte Zellen, die beide Proteine enthalten, in Gegenwart von IDE lysiert werden. Im zweiten Schritt wird ein gegen das Influenza-Nukleoprotein gerichtetes spezifisches Antikörper hinzugefügt, um an das Influenza-Nukleoprotein und das wechselwirkende MX1-Protein zu binden.Anschließend werden die resultierenden Immunkomplexe mit Protein-G-Kügelchen präzipitiert und die kontaminierenden Proteine durch mehrfaches Waschen entfernt. Im letzten Schritt werden das nukleäre Influenza-Protein und das mitpräzipitierte antivirale MX1-Protein von den Protein-G-Kügelchen eluiert. Abschließend wird mittels Western Blot die Interaktion zwischen dem nukleären Influenza-Protein und dem antiviralen MX1-Protein nachgewiesen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie diesen beiden Hybridmethoden besteht darin, dass die wechselwirkenden Proteine in ihrem natürlichen Umfeld – der menschlichen Zelle – untersucht werden. Diese Methode kann Einblicke in die Interaktion zwischen dem nukleären Protein des Influenzavirus und dem antiviralen AMX1-Protein liefern, kann aber auch angepasst werden, um andere schwache oder vorübergehende Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Technik wird in der Abbildung von einem Kollegen aus meinem Labor demonstriert. Bereiten Sie alle Transfektionspuffer gemäß dem begleitenden textlichen Protokoll vor.Verdünnen Sie die PlasmadNA in 600 µL Tris-EDTA. Fügen Sie dann 150 µL hepesgepuffertes Calciumchlorid tropfenweise zu den Plasmidproben hinzu und mischen Sie durch dreimaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie das Ergebnis tropfenweise in 750 µL Plasmidlösung zu 750 µL hepesgepuffertem Salz, das in einer neuen 6-Loch-Platte platziert wurde.Stellen Sie sicher, dass die Plasmidlösung gleichmäßig über den gesamten Wells verteilt wird. Anschließend wird die Transfektionslösung 90 Sekunden lang bei 1000 U/min auf einem Plattenrührer geschüttelt und dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Verwenden Sie eine neun Zentimeter große, mit Gewebekultur beschichtete Petrischale mit HEC 2 9 3 T-Zellen, die am Tag der Transfektion subkonfluent sind.Unter Verwendung einer P-1000-Mikropipette die Transfektionslösung tropfenweise zu den Zellen geben und dabei sicherstellen, dass die Mischung gleichmäßig über die gesamte Platte verteilt wird. Sobald die gesamten 1,5 Milliliter der Transfektionslösung zugegeben wurden, die Platte vorsichtig schütteln, die Zellen für sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Anschließend das Medium absaugen und umgehend mit 12 Milliliter frischem, vorgewärmtem Medium vorsichtig ersetzen.Um eine Zellablösung zu verhindern. Bereiten Sie alle Stammlysepuffer gemäß der beigefügten Textanleitung vor. Nach der Zubereitung waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter eiskalter PBS. Führen Sie die Wäsche vorsichtig durch, da HEC 2 9 3 T-Zellen leicht abgelöst werden.Als Nächstes das PBS entfernen und 600 Mikroliter eiskaltes, niedrigsalziges Lysepuffer zu jeder Platte hinzufügen. Die Platten 20 Minuten lang alle fünf Minuten auf Eis stellen, dabei jede Platte vorsichtig schütteln und sicherstellen, dass die Platten waagerecht gehalten werden. Das Zelllysat in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und drei Minuten bei 4 Grad Celsius und 16.000 × g zentrifugieren, um die unlösliche Fraktion als Pellet abzutrennen. Die lösliche Fraktion in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und auf Eis stellen.Führen Sie die übrigen Schritte so weit wie möglich auf Eis oder bei vier Grad durch, um die proteolytische Aktivität in den Lysaten einzuschränken. Zum Herstellen der Immunkomplexe mischen Sie 135 Mikroliter Lysat mit zwei Mikrolitern anti-NP monoklonalem Antikörper und 113 Mikrolitern Low-Salt-Lysispuffer. Lagern Sie den verbleibenden Lysat bei einem Gesamtvolumen von 250 Mikrolitern bei minus 20 Grad Celsius.Führen Sie für weitere Analysen wie beispielsweise die Western-Blot-Analyse die Antikörper-Lysat-Mischung drei Stunden bis über Nacht auf einer rotierenden Vorrichtung bei vier Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie anschließend die Protein-G-Kügelchen vor, indem Sie für jede Probe 100 Mikroliter Kügelchenschlurry in ein einzelnes Reagenzglas geben. Zentrifugieren Sie den Schlurry bei 8.000 ×g und vier Grad Celsius für 30 Sekunden und entfernen Sie die Ethanol-Lösung, in der sie gelagert werden.Geben Sie ein gleiches Volumen eiskaltes, salzarmes Lysepuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig. Zentrifugieren Sie die Protein G-Perlen-Suspension erneut bei 8.000 × g und 4 °C für 30 Sekunden. Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Überstand. Schätzen Sie das verbleibende Volumen der Protein G-Perlen ab und geben Sie ein gleiches Volumen eiskalten, salzarmen Lysepuffer hinzu, um eine neue 50 %ige Perlen-Suspension in salzarmem Lysepuffer herzustellen.Suspendieren Sie die Suspension und überführen Sie 100 Mikroliter in ein frisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Bewahren Sie das Röhrchen auf Eis auf, bis es benötigt wird, bevor Sie die Protein-G-Beads für die Immunpräzipitation verwenden. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen 30 Sekunden bei 8.000 × g und 4 °C. Überprüfen Sie danach visuell, ob in allen Proben gleiche Mengen an Beads vorhanden sind.Passen Sie gegebenenfalls die Menge der Kügelchen in einigen Proben an und zentrifugieren Sie erneut. Sobald alle Proben etwa 50 Mikroliter betragen, entfernen Sie die Überstände vorsichtig, ohne die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören. Zentrifugieren Sie anschließend die Immunkomplexe kurz für 30 Sekunden bei 8.000 × g und 4 °C, um die Probe am Röhrchenboden zu sammeln.Überführen Sie anschließend die gesamten Immun-Komplexe auf die Protein-G-Kügelchen. Inkubieren Sie 60 Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius. Inkubieren Sie die Kügelchen mit den Immun-Komplexen nicht länger als 75 Minuten. Eine längere Inkubationsdauer erhöht die unspezifische Bindung von Proteinen an die Protein-G-Kügelchen.Zentrifugieren Sie anschließend die Protein-G-Kügelchen mit den nun gebundenen Immunkomplexen. Entfernen Sie die Überstände, achten Sie jedoch darauf, die pelletierten Protein-G-Kügelchen nicht aufzuwirbeln. Waschen Sie danach die Protein-G-Kügelchen etwa fünf Minuten lang mit 900 Mikrolitern Lysepuffer mit hohem Salzgehalt.Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen vollständig in dem Waschpuffer resuspendiert sind. Zentrifugieren Sie die Protein-G-Kügelchen für optimales Waschen 30 Sekunden bei 8.000 × g und vier Grad Celsius und entfernen Sie die Überstände. Achten Sie darauf, das pelletierte Protein G nicht aufzuwirbeln, um einen Verlust des immunpräzipitierten Materials zu vermeiden.Nach dem letzten Waschschritt 50 µL 2×-Lämmli-Probepuffer zu den Pellets geben und die Suspension 10 Minuten bei 95 °C erhitzen, um die co-exprimierten Proteine zu eluieren. Nach dem Erhitzen die Protein-G-Kügelchen 30 Sekunden bei 8.000 ×g zentrifugieren.Danach die Proben bei vier Grad Celsius lagern, falls sie umgehend verwendet werden, oder bei minus 20 Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Gezeigt ist hier eine Westernblot-Analyse eines Co-Immunpräzipitations-Experiments mit zwei Proben: eine enthält sowohl das antivirale MX1-Protein als auch die nukleären Proteine des Influenza-A-Virus, die andere ist eine Kontrolle, die nur das MX1-Protein enthält. Der Blot zeigt, dass das MX1-Protein nur dann mitpräzipitiert wird, wenn das nukleäre Protein des Influenza-A-Virus gleichzeitig exprimiert ist.Hier erkennt man die Bedeutung des Alkylierungsmittels N ide. Bei der Herstellung der Zelllysate in Gegenwart von N ylm kann die Wechselwirkung zwischen NP MX one und MX one nachgewiesen werden, während diese ohne dessen Zugabe nicht detektierbar ist. Diese Methode ist sehr vielseitig und kann zur Untersuchung der Ko-Immunpräzipitation von MX one mit Influenza, einem Virus, und nukleärem Protein aus Lysaten verwendet werden, die aus transfizierten Zellen, infizierten Zellen oder aus Varians stammen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Co-Immunpräzipitationsexperiment durchführt. Außerdem ermöglicht die Zugabe eines Mediums zur Zelllyse die Untersuchung schwacher oder vorübergehender Protein-Protein-Interaktionen, wie beispielsweise der Interaktion zwischen dem nuklearen Protein des Influenza-A-Virus und dem antiviralen AMEX1-Protein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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