Name: Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Lernen Sie die Reprogrammierung von PBMNCs zu iPSCs aus gefrorenen Buffy Coats mit nicht-integrativen episomalen Plasmiden. Diese virenfreie Methode ermöglicht kostengünstige patientenspezifische Stammzellforschung.

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Die Studie wurde unterstützt vom Gesundheitsministerium und der Abteilung für Bildungsförderung, Universität und Forschung der Autonomen Provinz Bozen und der Südtiroler Sparkassenstiftung.

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) wurden aus menschlichen peripheren Blut-Proben nach der unterzeichneten Einverständniserklärung und Zustimmung der Ethikkommission der Provinz Bozen gesunden Spendern isoliert. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den in der Deklaration von Helsinki verankerten Grundsätze durchgeführt. Alle Daten wurden gesammelt und anonym ausgewertet. 1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC) <ol><li> PBMNCs aus Buffy Coats nach Vollblut Zentrifugation erhalten, ohne Dichtegradiententrennung. <ol><li> Sammeln Sie 8 ml venösen peripheren Blut in eine Natriumcitrat gepuffert Kunststoffrohr, und lagern bei RT (25 ° C). Verfahren Blut innerhalb von 12 Stunden nach der Sammlung. </li><li> Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 xg für 15 min bei 4 ° C in einem Schwingbehälter-Rotor, Ausschalten der Zentrifuge Bremsen. </li><li> Sammeln Sie die bewölkten Buffy-Coat (die Schicht zwischen der oberen Plasmaphase und der unterenPhase, die die meisten Erythrozyten), die das angereicherte PBMNC Fraktion (500 &amp; mgr; l) in ein Kryoröhrchen Röhre. </li><li> Resuspendieren 500 ul Leukozytenmanschette mit 500 ul 2x Gefriermedium, enthaltend 90% FBS und 20% DMSO, um ein Gesamtvolumen von 1 ml mit 10% DMSO-Konzentration zu erhalten. </li><li> Frieren Sie das Fläschchen in einer kontrollierten Rate Gefrierbehälters bei -80 ° C. Speicher-Zellen in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume. </li></ol></li><li> PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten <ol><li> Sammeln Sie 12 ml venöses peripheren Blut in eine Natriumcitrat gepuffert Kunststoffrohr, und lagern bei RT. Verfahren Blut innerhalb von 12 Stunden nach der Sammlung. </li><li> Verdünne das Blut mit steriler PBS auf ein Endvolumen von 35 ml. </li><li> Vorsichtig und langsam, Schicht 35 ml verdünntes Blut auf 15 ml Polysaccharose Lösung (für Dichtegradiententrennung verwendet) (p = 1,077) in einem 50 ml konischen Röhrchen (Verhältnis 3: 1). </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 800 g für 30 min bei RT ineinem Schwingbecher-Rotor, Ausschalten der Zentrifuge Bremsen. </li><li> Saugen Sie das obere, gelbe Phase, die Plasma- und entsorgen Sie sie. Vorsichtig, übertragen Sie die Deckweiß Zwischenphasenschicht enthält PBMNCs auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Bringen Gesamtvolumen auf 30 ml mit steriler PBS verdünnt und bei 300 g zentrifugiert für 10 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren mit 30 ml PBS. Zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen, basierend auf Trypanblau-Ausschluß 25. </li><li> Centrifuge PBMNCs bei 300 × g für 10 min bei RT, den Überstand aspirieren und entsorgen. </li><li> Zellpellet in einer geeigneten Menge an Gefriermedium, enthaltend 90% FBS und 10% DMSO, um eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten. </li><li> Aliquot 1 ml pro Fläschchen (ca. 5 x 10 6 Zellen / ml) und frieren das Fläschchen in einer kontrollierten Rate Gefrierbehälter bei - 80 ° C. Speicher-Zellen in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Auftauen und Oberflächen von PBMNC (Tag 0) <ol><li> PBMNCs aus Buffy Coats nach Vollblut Zentrifugation erhalten, ohne Dichtegradiententrennung. <ol><li> Das Protokoll mit PBMNC aus gefrorenen Leukozytenfilmen starten, auftauen 1 Ampulle von Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C und verdünnt das buffy coat mit steriler PBS auf ein Endvolumen von 2 ml. </li><li> Übertragen Sie die verdünnte Buffy-Coat in eine 50 ml konischen Röhrchen, 10 ml rot Zelllysepuffer und Inkubation für 10 min bei RT. </li><li> Die Bereitstellung 500 ml Erythrozyten Lysepuffer, mit 0,5 g Kaliumbicarbonat, 4,145 g Ammoniumchlorid, 100 &amp; mgr; l von 0,5 M EDTA-Lösung zu 500 ml ultrareinem Wasser, pH 7,2-7,4. </li><li> Bringen Gesamtvolumen auf 50 ml mit sterilem PBS und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 50 ml sterilem PBS Zentrifugation der Buffy-Coat bei 300 × g für 10 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der Zellen in1 ml PBMNC Medium, wie zuvor beschrieben, 22, aus: IMDM und Hams F-12 (Verhältnis 1: 1), 1% der Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITS-X), 1% der chemisch definierten Lipid-Konzentrat (CDL), 1% Penicillin / Streptomycin, 0,005% L-Ascorbinsäure, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 1-Thioglycerin (Endkonzentration 200 uM), Stammzellfaktor SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), Erythropoietin EPO (2 E / ml), Insulin-like Growth Factor-IGF-1 (40 ng / ml), Dexamethason (1 uM) und Holo-Transferrin (100 ug / ml ). </li><li> Überführen diese in eine Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen mit Standardgewebekultur-behandelten Oberfläche ohne Beschichtung, in einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden, bis die Änderungsmedium Schritt (siehe Abschnitt 3). </li></ol></li><li> PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten <ol><li> Um das Protokoll zu starten mit gefrorenen PBMNCs nachDichtegradiententrennung, Tau-1 Fläschchen von Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C, übertragen Sie die Zellen in 5 ml Medium PBMNC. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml Medium PBMNC und sie in eine Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden, bis die Änderungsmedium Schritt (siehe Abschnitt 3). </li></ol></li></ol> 3. Kultur und Ausbau der PBMNCs (DAY 2-13) <ol><li> Sammeln PBMNC in Suspensionskultur mit einer Pipette mit einer 1 ml-Spitze in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 10 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml frischem Medium PBMNC. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in 1 auch von 12-Well-Platte mit Standardgewebekultur behandelte Oberfläche, ohne Beschichtung, und inkubieren sie bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li&gt; Wiederholen Sie diese Schritte alle zwei Tage, und teilen Sie die Zellen in einem Verhältnis 1: 2, wenn sie die entsprechende Zusammenfluss erreichen (rund 80%). </li></ol> 4. Transfektion von PBMNC mit episomalen Plasmiden (Tag 14) Hinweis: Führen Sie die Isolierung von den vier Handels intergation freien episomalen Plasmiden, die Durchführung der Pluripotenz Gene unter Verwendung eines kommerziellen Kits für Plasmidreinigung und Bewertung der Qualität der gereinigten Plasmide unter Verwendung einer Agarose-Gel-Analyse, nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Sammeln PBMNC in 15 ml konischen Röhrchen und die Anzahl der lebensfähigen Zellen (auf der Basis von Trypanblau-Ausschluss) 25. </li><li> Zentrifuge 2 x 10 6 Zellen bei 300 g für 10 min bei RT. </li><li> Resuspendieren 2 x 10 6 Zellen in Transfektionsgemisch, das 100 ul Resuspensionspuffer T und 1 ug jedes Plasmid DNA (ein Plasmid, OCT3 / 4 und shRNA gegen p53, einem Plasmid, SOX2 und KLF4 manPlasmid, das L-MYC und Lin28 und ein Plasmid, EGFP, um die Transfektionseffizienz zu überprüfen). </li><li> Saugen Sie das Transfektionsgemisch mit den Zellen in eine 100 ul Spitze und legen Sie die Pipette mit der Probe senkrecht in das Rohr, mit 3 ml Elektrolyt-Puffer E2, in der Pipettenstation der Elektroporation Maschine platziert gefüllt ist, nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Effizient elektroporieren Zellen mit dem folgenden Programm: 1650 V, 10 ms, 3 Impulse. </li><li> Resuspendieren der elektroporierten Zellen (2 × 10 6 Zellen) in 2 ml des vorgewärmten PBMNC Medium unter Zugabe von 0,25 mM Natriumbutyrat (NaB) und die Anzahl der lebensfähigen Zellen nach der Elektroporation Protokoll (auf der Basis von Trypanblau-Ausschluss) 25. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte ohne Beschichtung, schaukeln die Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Am Tag nach der Elektroporation count die Zahl der GFP-positiven Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie 8-10 Zufallsfeldern, um die Transfektionseffizienz zu beurteilen. </li><li> Pflegen Sie die transfizierten Zellen ohne Splitting für 3 Tage, bis sie auf Plattierung MEFs (siehe Abschnitt 6). </li><li> Ersetzen Sie 2 ml frisches Medium PBMNCs, plus 0,25 mM NaB alle zwei Tage. </li></ol> 5. Bereiten Sie Gerichte mit Feeder-Zellen für die Co-Kultur (TAG 16) <ol><li> Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 1 ml Basalmembranmatrix für 15 min bei 37 ° C und die Platte embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / Well mit 2 ml 10% FBS enthielt DMEM (MEF Medium) einen Tag vor der Passage der Elektroporation PBMNCs auf MEF Feeder-Zellen. </li></ol> 6. Plating Transfizierte PBMNCs auf MEFs (DAY 17-19) <ol><li> Sammeln PBMNCs in Suspensionskultur, mit einer Pipette mit 1 ml Spitze, in 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren transfiziert PBMNCs bei 300 × g für 10 minbei RT. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 2 ml frisches Medium PBMNC, plus 0,25 mM NaB. </li><li> Platte der Zellen auf MEF beschichtet 6 Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Nach zwei Tagen, saugen Sie den mittleren und ersetzen Sie es mit 2 ml iPSC Medium aus DMEM knockout (KO-DMEM), 20% KO-Serum Replacement (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 mM L- Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 10 ng / ml FGF (Basic bFGF) und 0,25 mM NaB. </li><li> Ersetzen Sie 2 ml frisches Medium iPSC jeden Tag und überprüfen Sie die Zellen täglich. Hinweis: Bei etwa 22-25 Tage, sollten die ersten Kolonien iPSCs sichtbar sein. </li></ol> 7. Picking und Ausbau der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) Clones (DAY 30-35) Hinweis: Bei etwa 30-35 Tage nach der Transfektion sollten iPSC Kolonien bereit für die Kommissionierung und replating sein. Die Umprogrammierung Effizienz sollte esti seingepaart als der Prozentsatz der Anzahl von iPSC Kolonien / Gesamtzahl der elektroporierten Zellen, wie zuvor berichtet 26. <ol><li> Am Tag vor der Passage iPSC Kolonien, bereiten Sie die MEF Feeder in einer 12-Well-Platte (1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung). </li><li> Saugen Sie die MEF Medium und ändern mit 1 ml iPSC Medium mit 10 ng / ml bFGF und 10 &amp; mgr; M Y-27632. Manuell sezieren mit einer Nadel eine Kolonie zu jeder Zeit unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube, um ein Raster zu erhalten, sammeln kleineren Klumpen durch Pipettieren und übernehmen diese einzeln jeweils in eine Vertiefung 12-Well-Platte mit MEFs beschichtet. </li><li> Passage und erweitern Sie jede 12-Well-Platte zu einer 6-Well-Platte in einem Verhältnis 1: 2, dann jede 6-Well-Platte in einem Verhältnis 1: 4 für die weitere Vermehrung. Sezieren und zu erweitern iPSCs manuell für die ersten 2-3 Durchgängen (wie in Schritt 7.2 gründlich beschrieben), dann verwenden Sie ein Enzym Dissoziation Verfahren (ab Schritt 7.4). </li><li> Für ein Enzym Dissoziation Protokoll, sauber iPSC colonies durch Absaugen differenzierte Teile unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube. </li><li> IPSCs mit 1 ml Collagenase IV (1 mg / ml) für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Saugen Sie das Enzymlösung, spülen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM-KO und sammeln die Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 2 min bei RT. </li><li> Den Überstand aspirieren, zu suspendieren, die Kolonien in 2 ml iPSC Medium mit 10 ng / ml bFGF und 10 &amp; mgr; M Y-27632 und die Platte sie auf MEF beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen (Verhältnis 1: 4). </li></ol> 8. Charakterisierung iPSCs (zwischen 5-15 Passages) <ol><li> Alkalische Phosphatase-Färbung <ol><li> Kultur IPSC Kolonien für 3-5 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF. </li><li> Zum Starten eines alkalischen Phosphatase-Färbung Protokoll gründlich iPSCs einmal mit PBS und dann befestigen Sie sie mit 1 ml 4% PFA für 20 min bei RT. </li><li> Mit PBS waschen die Zellen dreimal, um restliche PFA entfernen. </li><li> Stain fixierten Zellen miteinen handelsüblichen alkalischen Phosphatase-Färbung Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenz <ol><li> Kultur IPSC Kolonien für 3-5 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF. </li><li> Um eine Immunfluoreszenztest beginnen, waschen iPSCs einmal mit PBS und dann befestigen Sie sie mit 1 ml 4% PFA für 20 min bei RT. </li><li> Mit PBS waschen die Zellen dreimal, um restliche PFA entfernen. </li><li> Behandlung von festen iPSCs mit 1 ml Permeabilisierung / Blockierlösung, die 4% Ziegenserum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 und 0,05% Natriumazid (NaN 3) für 1 h bei RT. </li><li> Saugen Sie das Blockierungslösung und Inkubation der fixierten Zellen mit primären Antikörpern in 3% BSA und 0,05% NaN 3 -Lösung O / N bei 4 ° C (überprüfen Sie die Materialtabelle für primäre Antikörper Liste und schlug vor, Antikörperverdünnungsfaktor). </li><li> Am nächsten Tag, waschen iPSCs dreimal mit PBS, dann inkubieren Sie die Zellen mit Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus und Alexa Fluor 555 Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt 1: 1000 in 3% BSA und 0,05% NaN 3 -Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Färben die Kerne mit DAPI (1 ug / ml) für 10 min bei RT im Dunkeln, gefolgt von drei Mal mit PBS gewaschen. </li></ol></li><li> Differenzierung von iPS-Zellen in Embryoid Bodies (EBS) <ol><li> Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF. </li><li> Entfernen differenzierte Teile von iPSC Kolonien durch Absaugen unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube. </li><li> IPSCs mit 1 ml Collagenase IV (1 mg / ml) für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Saugen Sie das Enzymlösung, spülen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM-KO und sammeln die Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 2 min bei RT. </li><li> Absaugen des Überstandes und Resuspendieren der Kolonien in 2 ml EB Medium KO-DMEM, 20 definiert% fötalem Rinderserum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 mM L-Glutamin, 0,1 mM46; -Mercaptoethanol. </li><li> Teller iPSC Kolonien in Suspension für 6 Tage auf ultra-niedrige Befestigung 6-Well-Platten, um die Bildung von Kugel dreidimensionale Embryoidkörpern (EBS) zu ermöglichen. Ändern Sie 2 ml frischem EB Medium alle zwei Tage. </li><li> Am Tag 7, sammeln EBs und platten sie auf 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Platten in 2 ml Medium, EB und beizubehalten EBs Differenzierung für 20 Tage. </li><li> Ändern Sie 2 ml frischem EB Medium alle zwei Tage. </li></ol></li><li> qRT-PCR für die Genexpressionsanalyse <ol><li> Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF. </li><li> Auszug Gesamt-RNA aus PBMNC, iPSCs oder EVG mit 1 ml der kommerziellen Reagenz gemäß Herstellerangaben. </li><li> Werten Sie RNA-Konzentration und Reinheit durch geeignete Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung eines Spektrophotometers (hochwertige RNA A 260 / A 280 und A 260 / A 230-Verhältnisse&gt; 1,8) 27. </li><li> ScheckRNA-Integrität mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll (hochwertige RNA RQI&gt; 9.5) 28. </li><li> Durchführen einer reversen Transkriptionsreaktion von 1 ug Gesamt-RNA unter Verwendung eines kommerziellen reverse Transkriptase-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten Sie die qPCR Mischungen, die 5 ng des cDNA-Matrize, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 &amp; mgr; l von 5 &amp; mgr; M Primer (vorwärts: 1 &amp; mgr; l und rückwärts: 1 &amp; mgr; l) und 6 &amp; mgr; l RNase / DNase-freies Wasser für jede Reaktion 29. </li><li> Führen der qRT-PCR unter Verwendung des folgenden Programms: eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 Sekunden und Annealing und Verlängerungsschritt in einen Denaturierungsschritt unterteilt bei 60ºC für 45 sec 29. </li><li> Normalisieren die Expression anderer Gene mit GAPDH als Housekeeping-Gen 28 (siehe die in Tabelle 1 aufgeführten Primer). </li></ol></li><li> qPCRfür Transgene Ausschluss <ol><li> Extrahieren von DNA aus PBMNC oder iPSCs mit 1 ml Lysepuffer, der 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 20 ug / ml Proteinase K. </li><li> In das gleiche Volumen (1 ml) von 100% Isopropanol, mischen durch Umdrehen dreimal, um DNA-Niederschlag und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 min bei RT ermöglichen. </li><li> Überstand verwerfen, waschen Sie die DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 min bei RT. Absaugen und den Überstand verwerfen und resuspendieren sie in RNase / DNase-freiem Wasser. </li><li> Werten Sie die DNA-Konzentration und Reinheit durch geeignete Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung eines Spektrophotometers (hochwertige RNA A 260 / A 280 und A 260 / A 230-Verhältnisse&gt; 1,8) 27. </li><li> Bereiten Sie die qPCR Mischungen, die 5 ng der DNA-Matrize, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 &amp; mgr; l von 5 &amp; mgr; M Primer (vorwärts: 1 &amp; mgr; l und rückwärts: 1 &amp; mgr; l) und 6 &amp;# 181; l RNase / DNase-freies Wasser für jede Reaktion 29. </li><li> Normalisieren die Expression spezifischer episomale Plasmid-EBNA-1-Gens mit FBX-15 als Housekeeping-Gen 29 (siehe die in Tabelle 1 aufgeführten Primer). </li></ol></li><li> Karyotypanalyse <ol><li> Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage auf Feeder-freien Basalmembranmatrix beschichtete Platte mit einer kommerziellen definiert, Feeder freien Erhaltungsmedium für iPSCs nach Herstellerangaben. </li><li> Um die Karyotyp-Analyse-Protokoll zu starten, trennen iPSC Kolonien mit 1 ml Zellablösung Lösung für 5 min bei 37 ° C, bis zum Erhalt Single-Cell-Dissoziation. </li><li> Sammeln Zellen und Zentrifugieren bei 400 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Resuspendieren iPSCs in 2 ml eines Mediums, insbesondere zur Kultivierung von Zellen zur pränatalen Diagnosetechniken entwickelt. Platte Einzelzell iPSCs auf Basalmembranmatrix beschichtete Glasschalen und inkubieren sie in einem 37 ° C, 5% CO 2 &lt;/ Sub&gt; Inkubator. </li><li> Nach 2-4 Tagen, mit 10 ul / ml Colchicin direkt zu den Kulturen und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Absaugen Medium und Inkubation iPSCs in 1 ml eines hypotonischen Lösung (0,6% Natriumcitrat und 0,13% Kaliumchlorid) für 10 min bei RT. </li><li> Spülen Zellen mit 1 ml 5% iger Essigsäurelösung und fixieren iPSCs mit Methanol / Essigsäure-Lösung (Verhältnis 3: 1) in einer Maschine mit kontrollierter Temperatur und Feuchtigkeit (28 ° C, 42% relative Luftfeuchtigkeit). </li><li> Tauchen und schmutz fixierten Zellen mit Quinacrine Lösung für 15-20 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit 30 (Q-Banding zu erhalten). </li><li> Erwerben Zelle Metaphasen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrßerung 29. </li></ol></li></ol>

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<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus%3A+mechanistic+insights+into+efficient%2C+licensed%2C+extrachromosomal+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In der Vergangenheit war die einzige Möglichkeit, menschlichen pluripotenten Stammzellen, die einen bestimmten genetischen Mutation zu erhalten war, die Eltern unterziehen vor der Implantation genetische Diagnose zu rekrutieren und zu erzeugen embryonale Stammzellen aus ihrem verworfen Blastozysten 31,32. Unter Verwendung einer Neuprogrammierung Ansatz können die Forscher nun iPS von Patienten trägt nahezu jeder Genotyp zu erzeugen. Die Möglichkeit, von einem patientenspezifischen Zelllinie beginnen und eine ...

In 2006 hat die Gruppe von Shinya Yamanaka 1 gezeigt, zum ersten Mal, dass Körperzellen aus adulten Mäusen und Menschen können durch ektopische Expression von vier Reprogrammierungsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und in einem pluripotenten Zustand umgewandelt werden c-Myc), die Erzeugung der sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) 2. Patientenspezifische iPSCs ähneln menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) in Bezug auf die Morphologie, Proliferation und die Fähigkeit, in die drei Keimzelltypen (Mesoderm, Endoderm und Ektoderm) differenzieren, während ohne die ethische Bedenken auf die Verwendung von HES-Zellen und Bypass zugeordnet mögliche Immunabstoßung 3. Somit iPSCs erscheinen als eine der wichtigsten Quellen von patientenspezifischen Zellen für die Grundlagenforschung, Drug Screening, Krankheitsmodelle, Bewertung der Toxizität und der regenerativen Medizin Qualität 4. Es wurden mehrere Ansätze für iPSC Generation verwendet: viralen Integrationsvektoren(Retrovirus 5, Lentivirus 6), virale nicht-Integrationsvektoren (Adenovirus 7), Sendai-Virus-8, BAC Transposons 9, episomale Vektoren 10, 11 Proteine ​​oder RNA-Lieferung 12. Obwohl die Verwendung von Virus-vermittelte Methoden können eine hohe Effizienz Neuprogrammierung führen, in das Genom der Wirtszellen und daher potentielle Zufalls Insertionsmutagenese integrieren virale Vektoren können permanente Veränderung der Genexpression und Reaktivierung von Schweigen Transgenen während der Differenzierung nicht ausgeschlossen werden 13. Um iPSCs sicherer für die regenerative Medizin zu machen, wurden Anstrengungen unternommen, um iPSCs ohne die Integration von exogener DNA in zelluläre Genome abzuleiten. Obwohl verbrauch viralen Vektoren und Transposons entwickelt wurden, ist es noch unklar, ob die kurze Vektorsequenzen, die zwangsläufig verbleiben in den transduzierten Zellen nach der Exzision und Transposaseexpression könnte Veränderung Zelle induzierendere funktionieren 13. Trotz seiner hohen Effizienz Neuprogrammierung, Sendai-Virus stellt eine teure Vorgehensweise und zu erreichen, durch Lizenz Anliegen mit dem Unternehmen, die dieses System entwickelt, haben das Potenzial, ihre Anwendung in der translationalen Studien zu begrenzen. Darüber hinaus die Notwendigkeit für eine direkte Einführung von Proteinen und RNA erfordert mehrere Lieferung der Neuprogrammierung Moleküle mit den innewohnenden technischen Beschränkungen dieser führt, und die allgemeine Anpassung Effizienz ist sehr gering 14. Zu beachten ist, kosteneffektiv virale frei und nicht-integrierenden Methoden basierend auf der Verwendung von episomalen Plasmiden wurden erfolgreich für die Umprogrammierung der Hautfibroblasten 15 gemeldet. Insbesondere wird in der vorliegenden Arbeit haben wir beschlossen, im Handel erhältlichen Integration freien episomalen Plasmiden verwenden, wie bereits berichtet 10,15. Bisher Haut-Fibroblasten stellen die beliebtesten Spenderzelle Typ 5. Aber auch andere Zellquellen wurden successfully in iPSCs einschließlich Keratinozyten 16, Knochenmark mesenchymale Stammzellen 17. Fettgewebe Stromazellen 18 umprogrammiert, Haarfollikel 19 und Zahnmark-Zellen 20. Die Isolierung dieser Zellen erfordert chirurgischen Verfahren und mehreren Wochen werden für in vitro-Zellexpansion, um eine primäre Zellkultur zu etablieren benötigt. In diesem Licht ist die Auswahl der Ausgangszelltyp kritisch und es ist ebenso wichtig, iPSCs von leicht zugänglichen und weniger invasiv Geweben wie Blut erzeugen. Beide Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMNCs) 21,22 und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) 14,22-24 repräsentieren geeignete Quellen von Zellen für die Ableitung iPSCs. Obwohl die Effizienz der erwachsenen PBMNC Umprogrammieren 20-50 mal niedriger als die von CBMNCs 22, bleiben sie die bequemste Zelltyp für die Beprobung. InTatsächlich hat PBMNC Probenahme den Vorteil, dass minimal-invasive, und außerdem sind diese Zellen nicht umfangreiche Expansion in vitro vor der Reprogrammierung Experimente erfordern. Bislang wurden unterschiedliche Protokolle berichtet, dass PBMNCs nach Dichtegradienten-Trennung nach dem Gefrieren eingefroren und aufgetaut Tage bis mehrere Monate und für einige Tage expandiert, bevor für die Umprogrammierung in iPSCs 22,23. Dennoch, soweit wir wissen, keine Berichte Umprogrammierung PBMNCs aus gefrorenen Buffy Coats beschrieben. Wichtig ist, dass gefrorene Buffy Coats ohne Dichtegradiententrennung gesammelt stellen die in großem Umfang von Biobanken Bevölkerungsstudien gespeichert und stellt somit eine leicht zugängliche Pool von Material für iPSC Produktion, die weitere Probennahme vermeidet häufigsten Blutproben. Berichten wir hier zum ersten Mal die Erzeugung von Virusfrei iPSCs aus menschlichen gefrorenen buffy coats, basierend auf einem zuvor beschriebenen Protokoll 22. InAußerdem wurden aus gefrorenen iPSCs PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten erzeugt als Steuerprotokoll für die nicht-Dichtegradienten gereinigt PBMNC Ergebnisse.

<table><tbody><tr><td>Natriumcitrat gepuffert Venosafe Kunststoffrohr</td><td>Terumo</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr><tr><td>Ammodiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumpulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0,5 M Lösung</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>Polysaccharoselösung für die Dichtegradientenzentrifugation</td></tr><tr><td>Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Ohne Phenolrot</td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITS-X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&nbsp;</td><td>1X (Lagerbestand: 100X)</td></tr><tr><td>Chemisch definiertes Lipidkonzentrat</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td>1X (Lagerbestand: 100X)</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure 2-phosphat Sesquimagnesiumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Endkonzentration bei 200 &μ; M</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner Stammzellfaktor (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml (Bestand:100 &micro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Interleukin-3 (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml (Bestand: 10 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-1)</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng/ml (Lagerbestand: 40 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Erythropoietin (EPO)</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml (Lagerbestand: 50 U/ml)</td></tr><tr><td>Dexamethason&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &mu; M (Bestand: 1 mM)</td></tr><tr><td>Humanes Holo-Transferrin</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &mu; g/ml (Bestand: 20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco</td><td>11269016</td><td>Medium für die zytogenetische Analyse</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Medium für iPSC-Feeder-freie Kultur</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Ersatz</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0,1 mM (Lagerbestand: 50 mM)</td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0,25 mM (Lagerbestand: 0,5 mM)</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes FGF basic, 145 Stück</td><td>Forschung & Forschung D Systems&nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml (Lagerbestand: 10 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503&nbsp;</td><td>10 & Mikro; M (Bestand: 10 mM)</td></tr><tr><td>Fötales definiertes Rinderserum-Hyklon</td><td></td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1 % Gelatinelösung</td><td>Merck-Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembranmatrix Wachstumsfaktor reduziert</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg/ml (Bestand: 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>Lösung zur Zellablösung</td></tr><tr><td>Embryonaler Fibroblast der Maus (CF1)</td><td>Globaler Stamm</td><td>GSC-6201G</td><td>1*106 Zellen/6-Well-Platte</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>27077</td><td>1 & Mikro; g (Bestand: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-hSK</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>27078</td><td>1 &Mikro; g (Bestand: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-hUL</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>27080</td><td>1 &Mikro; g (Bestand: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Plasmid pCXLE-EGFP</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>27082</td><td>1 &Mikro; g (Bestand: 1 &micro; g/&micro; l)</td></tr><tr><td>Färbekit für alkalische Phosphatase</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antikörper</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antikörper</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antikörper</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4381</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-Oct-3/4</td> <td>AntikörperSanta Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Troponin I Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Actinin (Sarkomerika) Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Neuronale Klasse III &szlig;-Tubulin (TUJ1) Antikörper</td><td>Covance Research Products Inc&nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH) Antikörper</td><td>Calbiochem</td><td>657012</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Ziegen-Anti-Kaninchen-Molekularsonden</td><td></td><td>A-21429</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Zellkultur 6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagenz</td><td>Ambion</td><td>15596-018&nbsp;</td><td>Reagenz für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA-Synthese-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11754050</td><td>Reverse-Transkriptase-Kit</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5124</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time-PCR-Nachweissystem</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5195</td><td></td></tr><tr><td>Experion Automatisiertes Elektrophorese-System</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7000</td><td>Instrument zur Überprüfung der RNA-Integrität</td></tr><tr><td>Experion RNA Highsense Analysekit</td><td>Bio-Rad</td><td>7007105</td><td>Reagenzienkit zur Überprüfung der RNA-Integrität</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop (SteREO Discovery V12</td>) <td>Zeiss</td><td>495007</td><td></td></tr><tr><td>NeonTransfection System 100 &micro; l Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>Reagenzienkit für die Elektroporation</td></tr><tr><td>Neon-Transfektionssystem</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Instrument für die Elektroporation</td></tr><tr><td>NanoDrop UV/Vis-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Instrument für die DNA/RNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Plasmid-Aufreinigungskit</td></tr></tbody></table>

erzeugung von induzierten pluripotenten stammzellen aus gefrorene buffy coats mit non-integration episomalen plasmiden

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatischen Zellen kann durch die Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und c-Myc) zwingt in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) umprogrammiert werden, typischerweise durch menschliche embryonale Stammzellen exprimiert (hES) . Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit HES-Zellen, haben iPSCs ein wichtiges Instrument für potenzielle Patienten-spezifischen regenerativen Medizin zu werden, die Vermeidung ethischer Fragen mit HES-Zellen verbunden. Um geeignete Zellen für die klinische Anwendung zu erhalten, müssen Transgen freien iPSCs erzeugt werden, um transgene Reaktivierung veränderte Genexpression und fehlgeleiteten Differenzierung zu vermeiden. Außerdem ist eine hocheffiziente und kostengünstige Anpassung Verfahren notwendig, eine ausreichende iPSCs für therapeutische Zwecke abzuleiten. Angesichts dieser Notwendigkeit, ist eine effiziente Integration von nicht-episomale Plasmid-Ansatz die bevorzugte Wahl für iPSC Ableitung. Derzeit die häufigste Zelltyp für eine Neuprogrammierung Zwecke sind Fibroblasten, die Isolierung von denen erfordert Gewebebiopsie, eine invasive chirurgischen Prozedur für den Patienten. Daher menschlichem peripheren Blut stellt den am besten zugänglichen und am wenigsten invasive Gewebe für iPSC Generation. In dieser Studie wird ein kostengünstiges und virale freies Protokoll unter Verwendung nicht-integrierenden episomalen Plasmiden zur Erzeugung iPSCs aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC), nachdem Gesamtblut zentrifugiert und ohne Dichtegradiententrennung aus gefrorenen Leukozytenfilmen berichtet wird.

In dieser Studie wurde ein einfaches und wirksames Protokoll für die Erzeugung von Virusfrei iPSCs durch Umprogrammierung PBMNC aus gefrorenen buffy coats, nachdem Gesamtblut zentrifugiert und Vergleich mit Umprogrammierung PBMNCs nach Dichtegradiententrennung wird berichtet, erhalten wurde, isoliert. 1A zeigt eine schematische Darstellung das detaillierte Protokoll. Nach dem Auftauen werden die isolierten PBMNC, welches einen typischen abgerundete Form werden in spezifischen Blutkulturmedium für 14 Tag...

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen zu erzeugen, die aus gefrorenen Buffy-Coats gewonnen wurden, und zwar mithilfe eines kostengünstigen und virenfreien Protokolls. Zunächst erfolgt die Isolierung von PB-MNCs aus Buffy-Coats nach Zentrifugation von Vollblut ohne Dichtegradient, gefolgt von der Expansion in einem spezifischen Blutkulturmedium. Der zweite Schritt besteht darin, die aus Buffy-Coats gewonnenen PB-MNCs mittels Elektroporation mit episomalen Plasmiden zu transfizieren.Die transfizierten PB-MNCs werden anschließend auf frische, mit murinen embryonalen Fibroblasten als Fütterungszellen beschichtete Kulturgefäße ausplattiert. Der letzte Schritt besteht darin, induzierte pluripotente Stammzellen manuell aus der Kultur auszuwählen und auf neue Platten mit Fütterungszellen zur Expansion zu übertragen. Letztendlich kann die effiziente Umprogrammierung von PB-MNCs in induzierte pluripotente Stammzellen mit typischer menschlicher Morphologie mittels Immunfluoreszenz und durch die Messung der Genexpression nachgewiesen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Degeneration virusfreier IPCs aus gefrorenen OTs die Kosten, Arbeitszeit und manuellen Arbeitsschritte für die Bediener während der Probenvorbereitung reduziert. Ein weiterer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung von gefrorenen OTs ermöglicht, die im großen Maßstab aus einer populationsbasierten Studie in einer Biobank gesammelt und gelagert wurden, als Ausgangsmaterial für die Herstellung von IPS. Beginnen Sie damit, acht Milliliter venöses peripheres Blut in ein Kunststoffröhrchen mit Natriumcitrat-Puffer zu sammeln.Lagern Sie das Blut bei 25 Grad Celsius und verarbeiten Sie es innerhalb von 12 Stunden. Der erste Verarbeitungsschritt besteht darin, das Blut bei vier Grad Celsius 15 Minuten lang mit 2000 G zu zentrifugieren. Verwenden Sie einen Schwenkköbelrotor und schalten Sie die Zentrifugalbremsen während der Trennung nicht ein.Sammeln Sie die trübe Büffelschicht. Dies ist die Schicht zwischen der oberen Plasma-Phase und der unteren Phase. Die Büffelschicht ist der angereicherte P-B-M-N-C-Anteil; übertragen Sie etwa 500 Mikroliter von jeder Acht-Milliliter-Probe in ein Kryoröhrchen.Suspendieren Sie nun den Buffy Coat durch Zugabe eines gleichen Volumens an 2x Gefriermittel und frieren Sie die Probe in einem Gefriermittel mit kontrollierter Abkühlrate bei minus 80 Grad Celsius bis zu einer Woche lang ein. Für eine längere Lagerung können die Zellen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden. Zum Auftauen wird eine gefrorene Ein-Milliliter-Suspension von PBMCs, die aus gefrorenen Buffy Coats gewonnen wurden, in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad aufgetaut. Anschließend verdünnen Sie die Zellen mit PBS auf zwei Milliliter.Als Nächstes überführen Sie die Verdünnung in ein 50-Milliliter-Gefäß und geben 10 Milliliter Puffer zur Lyse roter Zellen hinzu. Lassen Sie dieses Gemisch etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 10 Minuten erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit steriler PBS auf 50 Milliliter.Anschießend die Zellen bei 300 Gs für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und den Pellet mit 50 Milliliter PBS waschen. Danach die Zellen erneut zentrifugieren und in einem Milliliter PBM und C-Medium resuspendieren.Entnehmen Sie eine Aliquotprobe der resuspendierten Zellen und bestimmen Sie die Zelldichte mithilfe einer Zählkammer. Stellen Sie diese anschließend auf 2 Millionen Zellen pro Milliliter ein. Legen Sie nun eine Suspensionskultur an.Die Zellen in eine Vertiefung einer standardmäßigen 12-Loch-Platte geben und 48 Stunden inkubieren. Das Medium jeden zweiten Tag wechseln, die Zellen mit einer Pipette aspirieren und in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen. Das beladene Gefäß 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 300 ×g zentrifugieren.Danach die Überstände verwerfen und die Zellen in einem Milliliter frischem P-B-M-N-C-Medium resuspendieren. Eine Kontamination mit roten Blutkörperchen ist während der ersten Tage der PB-MNC-Kultur üblich. Bevor die Zellen in eine neue, frische Mulde überführt werden, sollten sie unter einem invertierten Mikroskop überprüft werden, wenn sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben; dann die Kultur beim Umpflanzvorgang teilen.Zwei Wochen nach Beginn der PB-MNC-Kultur sollten die Zellen bereit zur Transfektion sein. Bereiten Sie vier Plasmide vor: eines mit T drei vier und S-H-R-N-A gegen P 53, eines mit SOX zwei und KLF vier, eines mit lmic und lin 28 sowie ein Plasmid mit EGFP. Sammeln Sie zunächst die PB-MNCs in einem 15-Milliliter-Konikalrohr und bestimmen Sie die Anzahl der vitalen Zellen mithilfe von Triam-Blau.Danach 2 Millionen lebensfähige Zellen vorbereiten, zentrifugieren und die Zellen in einer Transfektionslösung resuspendieren, die 100 µL Resuspensionspuffer T und ein Mikrogramm von jeweils vier Plasmiden enthält. Nun den Transfektionsbehälter mit drei Milliliter elektrolytischem Puffer auffüllen. E2: Die Transfektionslösung mit einer 100-µL-Spitze aufziehen und die Probe vertikal in die vorbereitete Elektroporationsküvette abgeben.Danach die Zellen mit drei Impulsen elektroporieren. Nach der Elektroporation die Zellen in zwei Milliliter vorgewärmtes PBM- und C-Medium mit 0,25 Millimolar Natriumbutyrat resuspendieren. Anschließend die Anzahl der vitalen Zellen wie zuvor bestimmen und die Zellsuspension in eine Vertiefung einer nicht beschichteten sechswelligen Platte überführen. Die Platte zur Inkubation bei sanfter Schüttelung für 24 Stunden stellen.Die transfizierten Zellen ab dem Tag der Transfektion an aufeinanderfolgenden Tagen drei Tage lang ohne Aufspaltung kultivieren. Ein Tag vor der Einrichtung der Ko-Kultur das Medium durch zwei Milliliter frisch zubereitetes P-B-M-N-C-Medium mit 0,25 Millimolar Natriumbutyrat ersetzen, bereiten Sie zuerst die MES-Grundbeschichtung vor, geben Sie je ein Milliliter Basalmembranmatrix in die Vertiefungen einer 6-Loch-Platte und lassen Sie die Platten 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Basalmembranmatrix absaugen und am nächsten Tag jeweils 200.000 MEFs in jedes Loch mit zwei Milliliter DMEM, das 10 % FBS enthält, ausplattieren. Sammeln Sie die PB MNCs in einer ein-Milliliter-Spit. Überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie sie. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter frischem Medium. Anschließend impfen Sie die Zellen in die mit Meth beschichteten Vertiefungen aus und inkubieren die Platte nach zwei Tagen.Ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter IPSC-Medium mit 0,25 Millimolar Natriumbutyrat und fahren Sie fort, das IPSC-Medium jeden zweiten Tag zu erneuern. Nach etwa 22 bis 25 Tagen sollten die ersten Kolonien von iPSCs sichtbar sein, spätestens nach 30 bis 35 Tagen. Die Kolonien sollten am Tag vor dem Verpacken der iPSC-Kolonienplatte auf Meth-Feeder-Zellen in eine 12er-Platte einsatzbereit zum Picken und Umpflanzen sein.Platte in einer Dichte von 125.000 Zellen pro Vertiefung und inkubieren Sie sie über Nacht. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium auf den Meth-Zellen durch ein Milliliter ergänztes IPSC-Medium. Anschließend entnehmen Sie unter einem Stereomikroskop mit einer Nadel jeweils eine Kolonie, und zwar einzeln bei größeren Kolonien, die kleine Zellhaufen bilden.Überführen Sie sie einzeln mittels Pipette, indem Sie eine Kolonie in jedes Loch der meth-beschichteten Platte übertragen, und inkubieren Sie die Platte zur Passage. Die iPSC-Kolonien verwenden anfangs dieselbe Picking-Technik, doch nach zwei bis drei Passagen wird die enzymbasierte Prozedur verwendet. PB-MNCs, die eine typische runde Form zeigten, wurden in einem spezifischen Blutkulturmedium 14 Tage lang expandiert und anschließend 10 bis 15 Tage nach der Transfektion mit episomalen Plasmiden transfiziert. Kleine, runde, helle Kolonien mit scharf abgegrenzten Rändern und einer embryonalen Stammzell-ähnlichen Morphologie erschienen etwa 20 bis 30 Tage nach der Transfektion.Sehr kompakte IPSC-Kolonien mit scharfen Rändern entstanden und nahmen an Größe zu, bis sie groß genug waren, um in den ersten Verpackungsschritten ausgewählt zu werden. Die IPSC-Kolonien behielten ihren undifferenzierten Zustand bei und wiesen eine typische Morphologie menschlicher embryonaler Stammzellen auf. Bei höherer Vergrößerung sind einzelne Zellen innerhalb der Kolonien sowie das hohe Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis erkennbar.Ausgewählte IPSE-Klone wurden etwa 10 bis 15 Mal weitergegeben. Etwa 20 Metaphasen aus mehreren unabhängigen Kulturen wurden auf genetische Stabilität analysiert. Alle Proben zeigten nach fünf bis zehn in-vitro-Expansionen eine normale Chromosomenanzahl.Diese Klone wurden hinsichtlich ihrer Stammzellnatur und Pluripotenz charakterisiert. Die Klone zeigten eine positive Färbung auf alkalische Phosphatase. Die quantitative RT-PCR bestätigte, dass die Klone pluripotente Gene in viel höherem Maße als die ursprünglichen PB-MNCs exprimierten.Während die Spiegel endogener cmic- und KLA-vier mehr oder weniger gleich blieben, konnte die Expression des exogenen episomalen Transgens in den IPCs nicht nachgewiesen werden, was auf die erfolgreiche Aktivierung endogener pluripotenter Gene hindeutet. Abschließend zeigte die Immunfluoreszenzanalyse, dass die IPCs Pluripotenzmarker wie OC-three-four, SSEA-four, TRA-180-1, SOX-two und TRA-one-60 exprimierten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man IPCs kostengünstig aus aus menschlichem peripherem Blut isolierten ko generiert, und dabei nicht-integrierende episomale Plasmide verwendet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Das aktuelle Protokoll beschreibt Schritte zur Fehlersuche der Derivation induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) von Patientenproben, die sich nach den Anweisungen des Herstellers schwer umprogrammieren ließen. Dieses Protokoll ist spezifisch für gefrorene Buffy-Coat-Proben, kann aber auch auf die Umprogrammierung gereinigter PBMCs angewendet werden.

Neuprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzelllinien aus eingefrorenen Buffy-Coat-Proben

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die menschliche Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten stammenden Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten, ein lentiviraler System ohne Feeder-Zellen.

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Lernen Sie die Reprogrammierung von PBMNCs zu iPSCs aus gefrorenen Buffy Coats mit nicht-integrativen episomalen Plasmiden. Diese virenfreie Methode ermöglicht kostengünstige patientenspezifische Stammzellforschung.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

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