Name: Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity-Adenovirusvektoren auf Basis des humanen Adenovirus Typ 5. Diese Methode ermöglicht die Lieferung großer Transgene bis zu 35 kb für Gentherapie-Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die DFG-Förderung EH 192/5-1 (A.E.), das EU-Projekt (E-rare-2) Transposmart (A.E.), die UWH Forschungsförderung (E.S. und W.Z) und das PhD-Programm der Universität Witten/Herdecke (P.B.). J.L. wurde durch ein Stipendium des Chinesischen Stipendienrats und T.B. und M.G durch die Else Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS) unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt die Reinigung von HCAdV Vektoren auf Basis menschlichen Adenovirus Typ 5 basierend auf zuvor beschriebene Verfahren 4,12. Die HCAdV Genom innerhalb der pAdFTC Plasmid ist frei von allen Adenovirusgene und nur trägt die 5&#39;- und 3&#39;-ITR und das Verpackungssignal. In dieser Strategie die HV AdNG163R-2 4 stellt alle notwendigen Gene, die für eine effiziente Virusproduktion in trans. Dies bietet eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb, was einde...

Für gentherapeutische Anwendungen ist es von großer Bedeutung ist es, zytotoxische und immunogene Nebenwirkungen durch die Expression von viralen Proteinen, das Transgen selbst oder von ankommenden viralen Proteine ​​zu vermeiden. Adenovirus-Vektoren (AdV) werden häufig verwendet, um Fremd-DNA in eine Vielzahl von Zellen einzuführen, um die Auswirkungen der Expression des Transgens 1,2 zu untersuchen. Das am weitesten fortgeschrittene Version von AdV wird durch Hochleistungs-Adenovirus-Vektoren (HCAdV) fehlen alle viralen kodierenden Sequenzen 3,4 und damit eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb bei geringer Immunogenität und geringe Toxizität 5-8 bietet vertreten. Aufgrund ihrer hohen Verpackungsleistung sie ermöglichen Lieferung von großen oder mehreren Transgenen unter Verwendung eines einzelnen Vektordosis. Daher stellen sie ein wertvolles Instrument für die Forschungsgemeinschaft. Im Gegensatz zu der ersten oder zweiten Generation AdV fehlen die frühen Gene E1 und / oder E3, die leicht mit kommerziellen Kits hergestellt werden können, vector Genom Bau und die Virusproduktion von HCAdV ist komplexer. Das System für die Konstruktion von HCAdV Genomen auf dem Plasmid pAdFTC Tragen eines HCAdV Genom frei von alen viralen kodierenden Sequenzen und dem Shuttle-Plasmid PHM5 9-12 basieren. Jedes Gen von Interesse von bis zu 14 Kilobasen (kb) in den Shuttle-Vektor PHM5 in dem die Mehrfach-Klonierungsstelle von Erkennungs flankiert kloniert / Spaltstellen der Homing-Endonukleasen PI- Sce I und I-Ceu I. Daher kann ein geklontes Gen von Interesse durch aufeinanderfolgende PI- Sce I und I-Ceu I freigesetzt werden verdaut für eine nachfolgende gerichtete Insertion in die gleichen Restriktionsstellen in dem Genom HCAdV im Plasmid enthaltenen pAdFTC vorhanden. In pAdFTC das Transgen Insertionsstelle zwischen dem PI- Sce I und I- Ceu I-Stellen-Spaltung entfernt wird von Füll-DNA und nicht-kodierenden Sequenzen zur adenoviralen Genoms eine Verpackung, wie beispielsweise die 5&#39;- und 3&#39;-Inverted Terminal Repeats (ITRs) flankiertan beiden Enden und dem Verpackungssignal stromabwärts des 5&#39;ITR. Die zusätzliche Füll-DNA bietet eine optimale Größe der endgültigen HCAdV Genoms reicht von 27 bis 36 kb, um eine effiziente Verpackung während der Virusproduktion zu gewährleisten. Seit pAdFTC ist ein großes Plasmid mit bis zu 45 KB (abhängig von der Größe der eingefügten Transgen) und die Verwendung des Homing-Endonukleasen mit vergleichsweise langen DNA-Erkennungsstellen zeigt eine starke DNA-Bindung, mehrere Bereinigungsschritte sind notwendig, während der Übertragung des Transgens aus PHM5 um pAdFTC. Sorgfältiger Umgang Vermeidung von Scherkräften wird empfohlen. Die ITRs des Genoms HCAdV durch Not I-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen unmittelbar vor der 5&#39;ITR und stromabwärts des 3&#39;ITR 12 flankiert. Daher kann HCAdV durch Not I zur anschließenden Transfektion des viralen Genoms in das HCAdV Erzeugerzelllinie zu verdauen freigegeben. Man beachte, dass die Verwendung der Restriktionsenzym NotI für relLeichtigkeit des viralen Genoms aus dem Plasmid pAdFTC impliziert, dass das eingefügte Transgen frei von Not I DNA-Erkennungsstellen. Die HEK293-Zelle basierend Produzentenzellen (116 Zellen) stabil Cre-Rekombinase auszudrücken. Für Virusamplifikation 116 Zellen mit einem Helfervirus (HV), allen AdV-Gene für die Replikation und Verpackung in trans 3,4 benötigt koinfiziert. Die HV ist eine der ersten Generation AdV mit einem floxed Verpackungssignal, das während der Virus Verstärkung durch Cre-Rekombinase in 116-Zellen exprimiert 4 entfernt wird. Dies stellt sicher, dass überwiegend HCAdV Genome, die eine intakte Verpackungssignal eingekapselt werden. Vorverstärkung des HCAdV durch serielle Passagierung leitenden Schritte in 116-Zellen auf Oberflächen in Gewebekulturschalen gezüchtet geführt. Nach jedem Durchgang viraler Partikel aus infizierten Zellen durch drei aufeinander folgende Durchführung Gefrier-Auftau-Stufen freigegeben. Mit jedem Durchgang immer mehr Zellen mit infiziert1/3 Zelllysat aus dem vorhergehenden Durchgang. Schließlich Lysat aus dem letzten Pre-Verstärkungsschritt wird verwendet, um Produzentenzellen in Suspension in einer Spinnerflasche für große Verstärkung gewachsen zu infizieren. Virionen werden aus den Zellen in Suspension durch Ausführen Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten 4,12 gereinigt. Mit dieser Vorgehensweise leere Teilchen und komplett montiert Partikel werden in zwei verschiedene Bänder getrennt. Weiter zu konzentrieren die HCAdV Partikel eine zweite nicht-schrittweise Ultrazentrifugation durchgeführt wird. Anschließend wird die resultierende Bande, die das HCAdV wird gesammelt und gegen einen physiologischen Puffer dialysiert. Endvektor Präparate bezüglich der Zahlen der absoluten Viruspartikel, infektiösen Partikeln und HV Kontamination aus. Absolutviruspartikel durch Lyse Viruspartikel und Messen der Absorption bei 260 nm oder durch Durchführen quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) 12 bestimmt werden. Infektiosität des purified Viruspartikel können durch qPCR Mess HCAdV in infizierten Zellen 3 h nach der Infektion vorhanden Genomen bestimmt werden.

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>Restriktionsaufschluss</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>Restriktionsaufschluss</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Ligatur</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>Restriktionsverdau</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>Restriktionsverdau</td></tr><tr><td>Kalb Darm alkalische Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>Dephosphorylierung von verdauten Plasmiden</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>Selektion von CRE exprimierenden 116 Zellen</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Hek293T Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 Zellkulturmedium &nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatpuffer Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>Waschen von Zellen, Resuspension von Zellen</td></tr><tr><td>250-ml-Vorratsflasche</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>Infektion von 116 in Suspension gezüchteten Zellen</td></tr><tr><td>500 ml PP CentrifugeTubes</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>Sedimentation von Zellen aus Suspensionskultur</td></tr><tr><td>Spinnerkolben</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>Wachstum von 116 Zellen in Aufhängung</td></tr><tr><td>Ultra Clear Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>Dichtegradientenzentrifugation</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>Dichtegradientenzentrifugation</td></tr><tr><td>SW-41 Rotor</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>Dichtegradientenzentrifugation</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>Dialyseschläuche</td></tr><tr><td>gebrauchsfertige Dialysekassetten&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>One-Shot-Dialyse-DH10B</td></tr><tr><td>elektrokompetentes E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>Transformation von Ligationsreaktionen</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Gewebe-DNA-Mini-Kit&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>Isolierung von genomischer DNA</td></tr><tr><td>SuperFect Transfection Reagenz</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>Transfektion von 116 Zellen</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Transfektion von 116 Zellen</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 Berührung</td><td>Biorad</td><td></td><td>qPCR-Gerät</td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>Aufreinigung von DNA</td></tr><tr><td>Cäsiumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>Dichtegradientenzentrifugation</td></tr><tr><td>Natriumacetat 99%</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>DNA-Fällung</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>bakterielles Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp; 99,8% rein</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5&nbsp;</td><td>DNA-Fällung und Waschen</td></tr><tr><td>SDS 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>Lyse&nbsp; Puffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>Lyse&nbsp; Puffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>Dialysepuffer/ Lyse&nbsp; Puffer</td></tr><tr><td>Glycerin 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>Dialysepuffer</td></tr><tr><td>MgCl2 98,5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>Dialysepuffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>optional Dialysepuffer</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>optional Dialysepuffer</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>optional Dialysepuffer</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>fakultativ Dialysepuffer</td></tr><tr><td>1,5-ml-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.730.005</td><td>Lagerung von Viruspräparaten bei -80 &°; C</td></tr></tbody></table>

klonierung und großtechnische produktion von high-capacity adenovirusvektoren auf der grundlage des humanen adenovirus typ 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Adenovirale Vektoren (HCAdV) mit hoher Kapazität, die keine viralen kodierenden Sequenzen enthalten, stellen aufgrund ihrer hohen Verpackungskapazität (bis zu 35 kb), ihrer geringen Immunogenität und geringen Toxizität einen der fortschrittlichsten Gentransfervektoren dar. Für viele Laboratorien wird der Einsatz von HCAdV jedoch durch das komplizierte Verfahren zur Konstruktion des Vektorgenoms und zur Virusproduktion erschwert. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur effizienten Klonierung und Herstellung von HCAdV auf Basis des Plasmids pAdFTC beschrieben, das das HCAdV-Genom enthält. Die Konstruktion von HCAdV-Genomen basiert auf einem Klonierungsvektorsystem unter Verwendung von Homing-Endonukleasen (I-CeuI und PI-SceI). Jedes interessierende Gen von bis zu 14 kb kann in den Shuttle-Vektor pHM5 subkloniert werden, der eine multiple Klonierungsstelle enthält, die von I-CeuI und PI-SceI flankiert wird. Nach I-CeuI und PI-SceI-vermittelter Freisetzung des Transgens aus dem Shuttle-Vektor kann das Transgen in den HCAdV-Klonierungsvektor pAdFTC eingefügt werden. Aufgrund der Größe des pAdFTC-Plasmids und der langen Erkennungsstellen der verwendeten Enzyme, die mit einer starken DNA-Bindung verbunden sind, ist ein sorgfältiger Umgang mit den Klonierungsfragmenten erforderlich. Für die Virusproduktion wird das HCAdV-Genom durch denNot-I-Verdau freigesetzt und in eine HEK293-basierte Produzentenzelllinie transfiziert, die stabil Cre-Rekombinase exprimiert. Um alle adenoviralen Gene für die Adenovirus-Amplifikation bereitzustellen, ist eine Koinfektion mit einem Helfervirus erforderlich, das ein Packungssignal enthält, das von loxP-Stellen flankiert wird. Die Voramplifikation des Vektors wird in Produzentenzellen durchgeführt, die auf Oberflächen gezüchtet werden, und die großflächige Amplifikation des Vektors wird in Spinnerkolben mit Produzentenzellen durchgeführt, die in Suspension gezüchtet werden. Für die Virusaufreinigung werden zwei Ultrazentrifugationsschritte auf Basis von Cäsiumchlorid-Gradienten durchgeführt, gefolgt von einer Dialyse. Hier werden Tipps, Tricks und Abkürzungen vorgestellt, die in den letzten Jahren für die Arbeit mit diesem HCAdV-Vektorsystem entwickelt wurden.

Hier repräsentative Beispiele für die Klonierung, Amplifikation und Reinigung von HCAdV Zubereitungen gezeigt. Ein Überblick über die Klonierungsstrategie (Abbildung 1) und repräsentative Beispiele für das Klonen und die Freisetzung des HCAdV Genom durch Restriktionsenzymverdau vorgesehen sind (Figur 2). Eine typische Restriktionsmuster nach dem Lösen der GOI-Expressionskassette aus PHM5 von PI- Sce I und I Ceu ich verdauen und anschlie...

Es wird ein Protokoll zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren mit hoher Kapazität vorgestellt, bei denen alle viralen kodierenden Sequenzen fehlen. Die Klonierung von Transgenen, die im Vektorgenom enthalten sind, basiert auf Homing-Endonukleasen. Die Virusamplifikation in Produzentenzellen, die als adhärente Zellen und in Suspension gezüchtet werden, beruht auf einem Helfervirus, das virale Gene in trans bereitstellt.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen genveränderten, hochkapazitiven Adenovirusvektor zur Übertragung und Expression therapeutischer Transgene in lebenden Zellen oder Organismen herzustellen. Diese Methode kann dem Bereich der Gentherapie helfen, große Transgene zu übertragen, die in andere virale Vektoren nicht hineinpassen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass hochkapazitive Adenoviren frei von viralen Genen sind.Mit diesen Vektoren können bis zu 35 kb fremde DNA übertragen werden. Der Einsatz dieses Verfahrens erstreckt sich auf unsere Therapie vererbter Erkrankungen, da es die Übertragung therapeutischer Ansätze zur Genkorrektur oder Genaddition ermöglicht. Diese Methode stellt ein fortschrittliches Werkzeug für die biologische Übertragung therapeutischer Transgene dar und kann sowohl in Zellkulturen als auch in lebenden Organismen angewendet werden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Vektorvermehrung und die Vektorreinigung etwas Erfahrung erfordern. Bei der Vektorreinigung ist ein geschickter Umgang notwendig. Überprüfen Sie eine Aliquotprobe eines zehnfach verdünnten, linearisierten Hochkapazitäts-Adenovirus-Genom-Expressionsplasmids mittels Gelelektrophorese. Ein neun Kilobasen langes Fragment für das pAd-FTC-Plasmid-Backbone und ein zweites, 28 bis 36 Kilobasen langes DNA-Fragment für das Hochkapazitäts-Adenovirusgenom sowie das Gen von Interesse sollten nachweisbar sein. Transfizieren Sie anschließend eine 60 Millimeter große Petrischale mit einem Sechstel der Zellen bei 50 bis 80 % Konfluenz mit fünf Mikrogramm des linearisierten Hochkapazitäts-Adenovirusgenoms gemäß Standardverfahren. 16 bis 18 Stunden nach der Transfektion entfernen Sie vorsichtig das Medium und geben drei Milliliter frisches Medium hinzu.Infizieren Sie die Zellen anschließend mit dem Helfervirus AdNG 163R2, wobei fünf transduzierende Einheiten pro Zelle verwendet werden. Inkubieren Sie im Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Schütteln Sie die Platte während der ersten Inkubationsstunde alle 20 Minuten, um das Helfervirus gleichmäßig auf alle Zellen zu verteilen.48 Stunden nach der Infektion sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie mit dem Kulturmedium aus der Kulturschale ausspülen. Heben Sie ein 0,5-Milliliter-Aliquot der Passage-null-Zellen zur Isolierung von genomischer DNA auf. Anschließend frieren Sie ein 2,5-Milliliter-Aliquot der Passage-null-Zellen wiederholt ein und tauen es wieder auf, indem Sie es in flüssigem Stickstoff eintauchen.Oder die Zellen in den negativen 80 Grad Celsius tiefen Gefrierschrank stellen und dann 3 bis 4 Mal in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad überführen. Mischen Sie 2,5 Milliliter Lysat mit einem Milliliter frischem Medium und geben Sie Hilfsvirus mit zwei infektiösen Einheiten pro Zelle hinzu. Entfernen Sie das Medium von einer 60 Millimeter Petrischale mit einem Sechstel der Zellen bei 90 bis 95 % Konfluenz und geben Sie die Virusmischung zu den Zellen hinzu.Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang wie zuvor. Anschließend gewinnen Sie die Zellen und wiederholen die Einfrieren/Tau- und Infektionsverfahren zweimal, um Lysate der Passage eins und der Passage zwei zu erhalten. Nachdem das Lysat der Passage zwei gewonnen wurde, mischen Sie 2,5 Milliliter Lysat mit 17,5 Millilitern frischem Medium und geben zwei transformierende Einheiten pro Zelle Hilfsvirus hinzu.Entfernen Sie das Medium von einer 80 bis 100 % konfluenten 150-Millimeter-Schale mit einer Einssechzehntelzelle und infizieren Sie die Zellen mit der viralen Mischung. 48 Stunden nach der Infektion gewinnen Sie das Lysat der Passage drei mithilfe des zuvor gezeigten Verfahrens. Um diesen Schritt zu beginnen, geben Sie 900 Milliliter vorgewärmtes Medium in einen Dreiliter-Spinnerkulturkolben.Entfernen Sie das Medium von mindestens 10 einzelnen 150-Millimeter-Dishs mit jeweils eineinhalb Millionen Zellen bei 90 bis 100 % Konfluenz und spülen Sie die Zellen mit 10 Milliliter frischem, vorgewärmtem Medium ab. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.Überführen Sie die Zellen anschließend direkt in den Spinnerkolben. Inkubieren Sie den Spinnerkolben 24 Stunden lang auf einem magnetischen Rührer in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂. Stellen Sie den magnetischen Rührer auf 70 U/min ein, um eine Anheftung der Zellen an die Glasoberflächen zu vermeiden.24 Stunden nach dem Ansatz der Spinner-Kulturflasche 500 Milliliter frisches Medium hinzufügen. Diesen Schritt nach weiteren 24 Stunden erneut wiederholen. 72 Stunden nach dem Ansatz der Kultur ein Liter frisches Medium zur Flasche hinzufügen, sodass sich ein Gesamtvolumen von drei Litern Zellsuspension ergibt.24 Stunden später die Suspensionzellen der Linie One One Six durch Zentrifugation 10 Minuten bei 500 ×g bei Raumtemperatur gewinnen. Den Überstand verwerfen und das Pellet durch etwa acht bis zehnmaliges Auf- und Abpipettieren in 150 Milliliter Medium resuspendieren. Die Zellen in eine 250-Milliliter-Lagerflasche überführen, die mit einem sterilen magnetischen Rührstab ausgestattet ist.Anschließend die Zellen mit dem Lysat der dritten Passage und zwei transformierenden Einheiten Helfervirus pro Zelle gleichzeitig infizieren. Die Gesamtzahl der Zellen beträgt hier etwa neunmal zehn hoch acht Zellen, daher werden einskommaacht mal zehn hoch neun transformierende Einheiten zugegeben. Die Zell-Virus-Mischung zwei Stunden lang in einem Gewebekultur-Inkubator mit einem magnetischen Rührer bei 60 U/min umrühren.Stellen Sie sicher, dass die Vorratsflasche nicht vollständig verschlossen ist, um eine Luftzirkulation zu ermöglichen. Zwei Stunden nach der Infektion das gesamte Volumen der Zell-Virus-Mischung in den dreiliterigen Spinner-Kulturkolben zurücküberführen. 1850 Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium zugeben und 48 Stunden bei 70 U/min im Zellkultur-Inkubator inkubieren. Nach 48 Stunden überführen Sie die Zellvirus-Suspension in 500-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 890 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellpellets in einem Gesamtvolumen von 28 Milliliter DPBS.Lagern Sie die Zellvirus-Suspension bei minus 80 Grad Celsius, bis die Virusreinigung durchgeführt wird. Zum Vorbereiten des viralen Lysats für die Reinigung über eine Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Freeze/Thaw-Zyklen der Zellvirus-Suspension viermal durchführen. Anschließend wird der virale Lysat bei Raumtemperatur 8 Minuten lang mit 500 × g zentrifugiert.Danach sammeln Sie den Überstand, der das Adenovirus mit hoher Kapazität enthält. Pipettieren Sie vorsichtig und langsam Cäsiumchloridlösungen in die Röhrchen in der folgenden Reihenfolge: 0,5 Milliliter einer Lösung mit 1,5 Gramm pro Kubikzentimeter, drei Milliliter einer Lösung mit 1,35 Gramm pro Kubikzentimeter und 3,5 Milliliter einer Lösung mit 1,25 Gramm pro Kubikzentimeter. Geben Sie anschließend etwa 4,5 Milliliter des geklärten Vektor-Überstands vorsichtig auf die 1,25 Gramm pro Kubikzentimeter-Schicht.Zentrifugieren Sie die Gradienten in einem Ultrazentrifugen mit einem Ausgleichsrotor bei 12 Grad Celsius mindestens zwei Stunden lang bei 226.000 × g, um virale Partikel, die das hochkapazitive Adenovirusgenom enthalten, von leeren Partikeln und Zelltrümmern zu trennen. Nach der Zentrifugation bildet sich eine diffuse Bande aus Zelltrümmern an der Oberseite der Röhrchen. Darunter sind zwei weiße Bänder sichtbar.Das obere Band enthält leere Partikel, während das untere Band das Adenovirus mit hoher Kapazität darstellt. Entfernen Sie vorsichtig die Schichten aus Zelltrümmern und leeren Partikeln. Sammeln Sie anschließend ein Milliliter des unteren Bands aus jedem Röhrchen.Überführen Sie das Virus in ein steriles 50-Milliliter-Gefäß. Geben Sie bis zu 24 Milliliter einer Cäsiumchloridlösung mit 1,35 Gramm pro Kubikzentimeter zu den gesammelten Viruspartikeln hinzu und mischen Sie vorsichtig. Füllen Sie die Zentrifugenröhrchen bis zum Rand mit der Cäsiumchlorid-Viruslösung mit einer Dichte von 1,35 Gramm pro Kubikzentimeter auf.Anschließend über Nacht bei 226.000 × g und 12 °C in einem Ultrazentrifugenrotor mit Ausgleichssystem bei langsamer Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren. Die oberen Schichten mit einer Pipette von oben abnehmen. Danach das im auffälligen unteren Band enthaltene Adenovirus mit hoher Kapazität unter Verwendung einer frischen Pipettenspitze sammeln.Schließlich dialysieren Sie die gesammelten Viruspartikel zur Pufferaustauschung. Anschließend bestimmen Sie die Titer der endgültigen Präparation gemäß den detaillierten Anweisungen im schriftlichen Protokoll. Dieses Histogramm zeigt die absoluten Partikelzahlen für eine einzelne Vektorpräparation, ermittelt mit drei verschiedenen Methoden: OD-Titer, gemessen durch optische Dichte, Infektionstiter und Kontamination mit Helfervirus, gemessen durch qPCR.Das Verhältnis zwischen den gesamten infektiösen, hochkapazitiven Adenoviruspartikeln und den durch qPCR gemessenen Kontaminationsgraden mit Helfervirus wird hier gezeigt. Falls ein fluoreszierendes Markergen in Ihrem Vektor vorhanden ist, kann eine Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um die Vervielfältigung des Vektors zu überwachen und die Infektiosität der endgültigen Vektorpräparation zu charakterisieren. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man genlösende, hochkapazitive Adenoviren herstellt.Vor allem, wie man das Transgen einfügt und wie man die Vektoren amplifiziert und reinigt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

In den letzten 15 Jahren haben vom caninen Adenovirus Typ 2 (CAV2) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit bei der Übertragung von Zellen in vitro und in vivo bewiesen und werden häufig für Impfungen und Gentherapien eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von CAV2-Vektoren, wodurch virale Suspensionen mit hohem Titer entstehen.

Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Hier stellen wir ein Protokoll für die Adenovirus-Produktion mit dem pAdEasy-System vor. Die Technologie umfasst die Rekombination der Plasmide pAdTrack und pAdEasy-1, die Adenovirus-Verpackung und -Verstärkung, die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium, die virale Titration und die funktionelle Prüfung des Adenovirus.

Eine effiziente Methode für die Adenovirus-Produktion

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent &gt;1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen

Da sich das Gebiet der Gentherapie ständig weiterentwickelt, besteht ein wachsender Bedarf an innovativen Methoden, die diese Herausforderungen bewältigen können. Hier wird eine einzigartige Methode vorgestellt, die den Prozess der Generierung von hochreinen und hochreinen AAV-Vektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform rationalisiert und die Qualitätsstandards für In-vivo-Studien erfüllt.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Trotz der hervorragenden mechanischen und biochemischen Eigenschaften von Spinnenseide, kann dieses Material nicht in großen Mengen mit konventionellen Mitteln gewonnen werden. Hier beschreiben wir eine wirksame Strategie, um künstliche Spinnenseide, die ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Herstellung und ihre Verwendung als Next-Generation-Biomaterialien ist zu spinnen.

Synthetische Spinnenseide Produktion im Labormaßstab

All-Solid-State-Ionen-selektiven Elektroden (Assises) aus einem leitfähigen Polymer (CP) Wandler konstruiert ist mehrere Monate von funktionellen Lebensdauer in flüssigen Medien. Hier beschreiben wir die Herstellung und Kalibrierung von Assises in einem Lab-on-a-Chip-Format. Die ASSISE nachgewiesen wird beibehalten eine nahezu Nernst Höhenprofil nach längerer Lagerung in komplexen biologischen Medien.

Multi-Analyt-Biochip (MAB) auf All-Solid-State-Ionen-selektiven Elektroden (ASSISE) für physiologische Forschung Grundlage

Erfahren Sie die Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity-Adenovirusvektoren auf Basis des humanen Adenovirus Typ 5. Diese Methode ermöglicht die Lieferung großer Transgene bis zu 35 kb für Gentherapie-Anwendungen.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

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