Generation skalierbar, Metallic Hochseitenverhältnis Nanokomposite in einer biologischen Flüssigmedium

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lineare, hochaspektige mikro- und nanoskalige Komposite unter Verwendung kupferhaltiger Ausgangsmaterialien und Cystein herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst sonifizierte Kupfernano-Partikel oder Kupfersulfat mit Cystin und Wasser in einer sterilen, belüfteten Kulturschale kombiniert werden. Der zweite Schritt der Synthese besteht darin, die vereinigten Komponenten in der Schale sechs Stunden oder länger in einem Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C zu lagern.

Anschließend wird der Kolben visuell und mittels Hellfeldmikroskopie überprüft, um das Ausmaß der Bildung linearer Strukturen zu bestimmen. Der letzte Schritt besteht darin, die Synthese abzubrechen, indem der Reaktionskolben in einen auf vier Grad Celsius gehaltenen Kühlschrank gestellt wird. Abschließend erfolgt die Charakterisierung der synthetisierten Strukturen mittels digitaler Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektrodenpositionierung liegt darin, dass die beschriebene Synthese problemlos in flüssiger Form skaliert werden kann und der Prozess unter physiologischen Bedingungen abläuft.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie oder Diagnose von Krankheiten wie Krebs, da synthetisierte Strukturen von Zellen abgebaut werden können, was möglicherweise eine Möglichkeit bietet, Wirkstoffe gezielt abzugeben. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, als wir Experimente durchführten, um die potenzielle Toxizität verschiedener Nanomaterialien zu untersuchen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die letzten Syntheseschritte schwer zu erlernen sein können.

Fehlerhafte Verfahren können zu aggregierten Strukturen oder gar zu keiner Struktur führen. Um die Selbstassemblierungssynthese unter Verwendung von Kupfernano-Partikeln oder CMPs durchzuführen, stellen Sie eine Lösung aus Kupfernano-Partikeln her, indem Sie mindestens zwei Milligramm CMPs abwiegen. Tragen Sie während dieses Schritts Einweghandschuhe, um einen möglichen Kontakt der CMPs mit der Haut zu vermeiden.

Stellen Sie die Nanopartikel in ein leeres, steriles 16-Milliliter-Glasfläschchen zu dem Fläschchen mit CMPs. Geben Sie sterile, entionisierte Wasser in dem geeigneten Volumen hinzu, um eine Lösung mit zwei Milligramm pro Milliliter herzustellen, und wirbeln Sie die Lösung 20 Sekunden lang im Vortex, um eine Dispersion der Nanopartikel vor Beginn der Synthese zu gewährleisten. Füllen Sie das Fläschchen nicht mehr als zur Hälfte mit Wasser, da dies hemmen würde.

Vermischen durch Vortexen führt dazu, dass sich CMPs schnell am Boden des Gefäßes absetzen und die Farbe dunkel erscheint. Sonizieren Sie die CNP-Lösung 17 Minuten bei Raumtemperatur, um eine maximale Dispersion der CMPs vor Beginn der Synthese zu gewährleisten. Überprüfen Sie regelmäßig, ob sich die CMPs aufgrund der Sonikation vermischen; nach einer erfolgreichen Sonikation verbleiben die CMPs mindestens 30 Minuten lang in Suspension, und die Lösung hat eine dunkle Farbe.

Wiegen Sie 7,29 Milligramm Cystin für die Synthese ab. Da Cystin nicht direkt in Wasser löslich ist, geben Sie das abgewogene Cystin in ein antistatisches Wiegegefäß und anschließend in das Gefäß, das Cystein enthält. Geben Sie eine ausreichende Menge steriler einmolarer Natronlauge hinzu, bis das Cystin vollständig gelöst ist, um eine Lösung mit einer Konzentration von 72,9 Milligramm pro Milliliter herzustellen.

Lösen Sie die Cystein vollständig in 100 Mikroliter einer einmolaren Natriumhydroxidlösung auf. Geben Sie anschließend sieben Mikroliter der gelösten Cysteinlösung zu 6.643 Mikrolitern steriler Wasser in einem sterilen Synthesekolben. Stellen Sie den Kolben mit der kombinierten Lösung 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in den Inkubator, wobei die Kolbenkappe zur Belüftung geöffnet bleibt, um eine wirksame Durchmischung zu gewährleisten.

Dies wird die Cystein-Arbeitslösung sein. Resuspendieren Sie die zweimilligramm pro milliliter CNP-Lösung durch Vortexen für 30 Sekunden, da sich die CMPs nach dem Beschallungsschritt bei einem Gesamtsynthesevolumen von sieben Milliliter abgesetzt haben werden. Überführen Sie die Cystein-Arbeitslösung in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben und geben Sie 350 Mikroliter der resuspendierten CMPs hinzu.

Setzen Sie die Kappe auf das Kolben und ziehen Sie sie fest, sodass sie sicher sitzt. Nachdem alle Komponenten für die Synthese vereinigt wurden, mischen Sie vorsichtig im Kolben, indem Sie diesen vier- bis fünfmal schwenken. Stellen Sie das Kolben in den Kohlendioxid-Inkubator und entlüften Sie es, indem Sie die Kappe etwas lösen, damit ein Gasaustausch in und aus dem Kolben stattfinden kann.

Während der Synthese sollte die Reaktion etwa 24 Stunden im Inkubator laufen gelassen werden. Während dieses Vorgangs kann man mittels Mikroskopie und mit bloßem Auge die Bildung stark linearer Komposite beobachten. Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass einige Strukturen entstehen, und um zu verhindern, dass der Selbstorganisationsprozess zu lange andauert.

Beenden Sie die Synthese der Biokomposite, sobald lineare Strukturen im Kolben beobachtet werden, indem Sie den Synthesekolben fest verschließen. Beschriften Sie den Kolben mit den Synthesebedingungen, einschließlich des verwendeten Datums der Synthese und Inkubation sowie der Dauer der Synthese vor der Beendigung. Bewahren Sie das Gefäß anschließend im Kühlschrank auf, da die erzeugten Strukturen in dieser Form mindestens ein Jahr stabil bleiben. Alternativ, um die Selbstassemblierungs-Synthese unter Verwendung von Kupfersulfat durchzuführen, ersetzen Sie die CMPs unter sterilen Bedingungen durch Kupfersulfat-Salz, und lösen Sie mindestens zwei Milligramm Kupfersulfat in einem ausreichenden Volumen sterilen, deionisierten Wassers, um eine Lösung mit einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter herzustellen.

Die Kupfersulfatkristalle lösen sich bei dieser Konzentration leicht auf, aber wirbeln Sie das Gefäß gegebenenfalls und prüfen Sie visuell, ob alle Kristalle nach der Herstellung des Kupfersulfats vollständig gelöst sind. Führen Sie die Synthese wie gerade gezeigt durch, ersetzen Sie jedoch die CMPs durch Kupfersulfat. Charakterisieren Sie aus CMPs und aus Kupfersulfat abgeleitete Biokomposite mittels Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie zur Charakterisierung und Inspektion der Biokomposite.

Die Parasynthese mittels Hellfeldmikroskopie erfolgt unter einem inversierten Mikroskop. Die Komposite setzen sich innerhalb weniger Minuten auf die Bodenfläche des Kolbens ab, sobald dieser flach abgelegt wird, und können dann scharfgestellt werden. Verwenden Sie die Hellfeld-Einstellung am Mikroskop, um den Kontrast zwischen Biokompositen und dem flüssigen Medium zu maximieren. Komposite, die aus CMPs und Kupfersulfat hergestellt wurden, erscheinen beide farblos bis opak, während nicht umgesetzte CNP-Aggregate sehr dunkel erscheinen.

Verwenden Sie die invertierte Hellfeldmikroskopie, um die Wirksamkeit der Synthese für ein bestimmtes Experiment zu beurteilen. Dokumentieren Sie beispielsweise das Vorhandensein oder Fehlen von inaktiven CMPs in der Synthese. Kolben, die für die Herstellung von aus CNPs abgeleiteten Biokompositen verwendet wurden, stammten aus Kolben mit unterschiedlichen Parametern wie Inkubationszeit oder Dauer der Beschallung.

Einzelne CMPs sind zu klein, um sie mit einem Lichtmikroskop zu beobachten, aber inaktive CNP-Aggregate erscheinen als runde, dunkle Objekte. Dies steht im Gegensatz zu erfolgreich synthetisierten CNP-Verbundstoffen, die ein hohes Aspektverhältnis, eine lineare Form und eine Vielzahl unterschiedlicher Längen aufweisen. Vermeiden Sie es, die Synthese zu lange vor der Beendigung fortzuführen, da dies zu stark verzweigten urchinartigen Strukturen führt, die nach ihrer Bildung nur schwer in einzelne Strukturen dispergiert werden können.

Verwenden Sie außerdem die invertierte Hellfeldmikroskopie, um die Wirksamkeit der Synthese für ein bestimmtes Experiment unter Verwendung von Kupfersulfat zu beurteilen. Da Kupfersulfat vollständig in Lösung geht, erscheint die Lösung bei Anwendung dieses Protokolls heller als die Lösung aus der Synthese mithilfe von CMPs.

Dokumentieren Sie die Größe und Ausdehnung der Kupfersulfat-Composite, indem Sie Kolben mit unterschiedlichen Synthesebedingungen, wie der Synthesedauer vor der Beendigung, vergleichen. Um Biocomposite vor der Parasynthese anzureichern, geben Sie sechs Milliliter entweder CNP-abgeleiteter Strukturen oder kupfersulfatabgeleiteter Strukturen in ein 15-Milliliter-Zentrifalenröhrchen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 500 × g und Raumtemperatur, um ein Pellet bei geringeren Volumina zu bilden.

Geben Sie 500 Mikroliter der Strukturen in Lösung zu 0,6 Milliliter großen Röhrchen hinzu, zentrifugieren Sie bei 2000 × g und Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten, um ein Pellet zu bilden. Legen Sie die Strukturen in sterile, entionisierte Wasser und beschallen Sie mindestens 10 Minuten lang, um sie erneut in Suspension zu bringen. Im Verlauf dieses Prozesses zerfallen die Strukturen und werden in der durchschnittlichen Länge kleiner.

Dokumentieren Sie Veränderungen der Verbundgrößen bei unterschiedlichen Beschallungszeiten mithilfe eines invertierten Hellfeldmikroskops und einer Digitalkamera. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass anfänglich gleichmäßige Dispersionen von CMPs im Zellkulturmedium innerhalb von 82 Stunden zu Mikrostrukturen aggregieren. Im Laufe der Zeit werden Partikel abgebaut und es bilden sich größere Aggregate. Schließlich entstehen größere Aggregate mit linearen Strukturen, die urchenartige Strukturen bilden.

Die Umwandlung von CMPs in lineare Bio-Verbundwerkstoffe wird gezeigt. CMPs wurden mit Cystein und Wasser aus anfänglich gleichmäßigen Dispersionen von CMPs kombiniert. Nach drei Stunden bilden sich Aggregate zu Mikrostrukturen, nach sechs Stunden entstehen Zwischenstrukturen.

Strukturen mit hohem Aspektverhältnis im Elektronenmikroskop. Die Charakterisierung der synthetisierten Biokomposite mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigt die CNP-Ausgangsmaterialien sowie die entstehenden linearen Komposite; die Ausgangs-CMPs sind rund, wie durch Rasterelektronenmikroskopie oder REM dargestellt. Nano- und Mikrostrukturen der aus CMPs und Cystein gebildeten Komposite werden mittels REM gezeigt.

Merkmalen von Verbundstoffen aus Kupfersulfat und Cystein werden ebenfalls mittels energiedispersiver Rasterelektronenmikroskopie dargestellt. Die elementaranalytische Röntgenspektroskopie der Ausgangsmaterialien und der synthetisierten linearen Komponenten wird gezeigt. Die Ausgangs-CMPs weisen ein ausgeprägtes Kupfersignal auf, jedoch kein Schwefelsignal.

Bio-Verbundstoffe aus CMPs und Cystin zeigen aufgrund von Cystin, das Kupfersulfat enthält, das Auftreten von Schwefel- und Kohlenstoff-Peaks. Das Material zeigt Peaks für Kupfer und Schwefel. Bio-Verbundstoffe aus Kupfersulfat und Cystin zeigen das Auftreten von Peaks für Kohlenstoff aufgrund von Cystin. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in 12 bis 24 Stunden durchgeführt werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, den Syntheseverlauf sowohl visuell als auch mithilfe des Mikroskops zu überwachen, um zu verhindern, dass die synthetisierten Strukturen zu stark aggregieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Fluoreszenzmarkierung der Strukturen angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise ob die synthetisierten Strukturen an Zellen binden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Reagenzien für die Synthese vorbereitet, korrekt kombiniert, der Fortschritt der Synthese überwacht sowie die Strukturen nach der Synthese konzentriert und modifiziert werden.