Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer In Vivo Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Ein Protokoll zur Bewertung von Veränderungen des DNA-Schadensniveaus und der DNA-Reparaturkapazität, die durch chronische in vivo Niedrigdosis-Bestrahlung in Milz-Lymphozyten von Mäusen induziert werden können, durch Messung von phosphoryliertem Histon H2AX, einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, mittels Durchflusszytometrie wird vorgestellt.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die DNA-Schäden und -Reparaturen zu messen, die in Milzzellen von Mäusen durch chronische in vivo-Exposition gegenüber niedrigen Dosen von Beta- oder Gammastrahlung induziert werden. Dies wird erreicht, indem die Mäuse zunächst interner Beta- oder externer Gammabestrahlung ausgesetzt werden, um mögliche Veränderungen bei DNA-Schäden und -Reparaturen auszulösen. In einem zweiten Schritt werden die PLE-Zyten isoliert und mit einer hohen Dosis Gammastrahlung bestrahlt, die nachweisbare DNA-Schäden induziert, um eine Überwachung der DNA-Reparatur zu ermöglichen.

Im Laufe der Zeit werden die Milzzellen dann fluoreszierend gegen gamma H zwei A x immunmarkiert, um eine Quantifizierung der DNA-Schäden zu ermöglichen. Letztendlich kann der DNA-Schaden, der durch Dosen akuter Gammastrahlung von nur 10 Grad Celsius verursacht wird, mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Strahlenschutzes zu beantworten, z. B. ob niedrige Strahlendosen, die typischerweise in einem beruflichen, medizinischen oder öffentlichen Umfeld auftreten, die Wahrscheinlichkeit von schädlichen Auswirkungen auf die Gesundheit wie Krebs erhöhen.

Die Hauptvorteile unserer Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Zählung von gamma H zwei A X Brennpunkten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, bestehen darin, dass unsere Technik erheblich weniger Zeit für die Analyse benötigt, wodurch sie für groß angelegte Tierversuche geeignet ist, und dass sie die operatorbedingte Verzerrung bei der Quantifizierung von gamma H zwei A X reduziert. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Personalisierung der Medizin und die Strahlentherapie von Krebs und darauf, dass die Strahlenempfindlichkeit des einzelnen Patienten unter Verwendung von peripheren Blutlymphozyten bestimmt werden kann, um das Dosisschema des Patienten für die Strahlentherapie anzupassen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Toxizität von Strahlung gibt, kann sie auch auf andere Studien angewendet werden, z. B. auf die Untersuchung der Toxizität chemischer Umweltschadstoffe oder die grundlegenden Mechanismen der Bildung und Reparatur von DNA-Schäden bei Mäusen in vivo.

Bei interner Betabestrahlung behandeln Sie die Tiere einen Monat lang mit AD libitum Zugang zu Tritiumwasser für die externe Gammabestrahlung. Der gesamte Käfig der Mäuse ist in dem richtigen Abstand zu einer Gammastrahlungsquelle zu platzieren, um der Dosisleistung der Tritiumexposition zu entsprechen. Initiieren Sie die Exposition und halten Sie sie einen Monat lang aufrecht.

Verwenden Sie Thermolumineszenzdosimeter, um die Gesamtabsorberdosen am Ende der Belichtung zu messen. Geben Sie am Tag der Milzentnahme ein Zellsieb in eine kleine leere Petrischalen pro Tier und geben Sie fünf Milliliter RPMI-Medium in jede Schale. Setzen Sie als nächstes eine euthanasierte Maus in Rückenlage und besprühen Sie das Haar mit 70%igem Ethanol, wenn das Tier vollständig durchnässt ist.

Fassen Sie mit einer Pinzette die Haut vor der Harnröhrenöffnung und machen Sie von diesem Schnitt aus einen kleinen Schnitt im Dammbereich. Schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie bis zur Brusthöhle und achten Sie darauf, nur die Haut und nicht die darunter liegende Muskelwand zu schneiden. Präparieren Sie die Haut von der Mittellinie weg.

Dann fassen Sie die Bauchdecke mit einer Zange. Schneiden Sie entlang des medianen Zugangs des Muskels, um die Bauchhöhle zu öffnen. Lokalisieren Sie die Milz und greifen Sie sie leicht mit einer sterilen Pinzette.

Ziehen Sie dann sanft am Gewebe und verfluchen Sie gleichzeitig das Bindegewebe. Entnehmen Sie etwa ein Zehntel der Milz für nachgelagerte Analysen. Übertragen Sie dann den Rest des Gewebes für bis zu zwei Stunden in einen der Zellsiebe, nachdem die gesamte Milz entnommen wurde.

Verwenden Sie eine sterile, gebogene Pinzette, um jedes Gewebe in seinen einzelnen Zellsieben zu zerkleinern. Wenn die Milz ausreichend homogenisiert ist, werden die Siebe entfernt und die filtrierte Zellsuspension in 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Spülen Sie jedes der Siebe mit weiteren fünf Millilitern Medium, ziehen Sie die Waschgänge mit dem Rest der Zellsuspensionen und zentrifugieren Sie die Zellen zweimal mit Resus, wobei Sie die Pellets nach dem ersten Schleudern in jeweils 10 Millilitern frischem RPMI suspendieren.

Nach der zweiten Drehung. Suspendieren Sie die Pellets erneut in fünf Millilitern RPMI und überführen Sie vier Milliliter der resultierenden Zellsuspensionen in 25-Milliliter-Gewebekulturflaschen zur Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und 80 % Luftfeuchtigkeit. Den Rest der Zellsuspensionen in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und Zellen mit einer Temperatur von vier Grad Celsius zentrifugieren.

Mit einer Vakuumpumpe werden die Überstände vorsichtig abgesaugt und die Pellets in einem Milliliter TBS-Puffer vorsichtig resuspendiert und die Zellen nach dem erneuten Vakuumieren des Supinats wieder heruntergeschleudert. Reese suspendiert die Pellets in jeweils 300 Mikrolitern TBS. Dann, während des Vortexens bei niedriger Geschwindigkeit, bei 700 Mikrolitern bei minus 20 Grad Celsius, 100% Ethanol in jedes Rohr

Drehen Sie die Röhren einige Male um, um weiter zu mischen. Anschließend lagern Sie die Proben bis zu 12 Monate bei minus 20 Grad Celsius. Zur Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen zur Herausforderung der Reparaturmaschinerie.

Bestrahlungskultur mit zwei Grautönen Gammastrahlung bei einer Dosisleistung von mindestens 200 Minigras pro Minute. Bringen Sie die Kultur unmittelbar nach der Challenge in den CO2-Inkubator zurück. Eine Stunde später überführen Sie die bestrahlte Kultur in eine biologische Sicherheitswerkbank und verwenden eine Pipette, um die Zellen sanft wieder zu suspendieren.

Übertragen Sie einen Milliliter der resultierenden Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis und schleudern Sie dann die Zellen herunter. Verwenden Sie die Vakuumpumpe, um das Supinat vorsichtig abzusaugen und dann die Pellets in einem Milliliter TBS vorsichtig wiederzubeleben. Nach einer zweiten TBS-Wäsche fixieren Sie die Zellen in Ethanol, wie gerade gezeigt, für eine Lagerung bei minus 20 Grad Celsius für die Immunfluoreszenzanalyse der Zellen.

Geben Sie zunächst 0,5 Milliliter eiskaltes TBS in die entsprechenden Probenröhrchen. Nächster Vortex aliquot Eloqua, ein fester minus 20 Grad Celsius gelagerter SPL-Zyten für fünf Sekunden. Dann werden 0,5 Milliliter der Zellen in die entsprechenden Röhrchen umgefüllt und vorsichtig nach unten geschleudert, die Pellets in einem Milliliter eiskaltem TBS mit 1%FBS und Zentrifugalzellen wieder suspendiert.

Inkubieren Sie die Proben erneut 20 Minuten lang in einem Milliliter TST-Puffer pro Röhrchen auf Eis. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie die Pellets erneut in 200 Mikrolitern primärem Anti-Gamma-H-Zweiax-Antikörper. Positionieren Sie dann das Röhrchen am Ende der Inkubation 1,5 Stunden lang in einem Winkel von 45 bis 60 Grad bei 300 mal G und Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler.

Waschen Sie die Proben zweimal in einem Milliliter eiskaltem TBS mit 2%FBS. Anschließend werden die Pellets in 200 Mikrolitern frisch zubereitetem Sekundärantikörper auf der Schüttelplattform wieder suspendiert. Nach einer Stunde waschen Sie die Zellen in einem Milliliter Eis namens TBS, das 1% FBS enthält, gefolgt von einer Wäsche in einem Milliliter Eis, das TBS allein genannt wird.

Zum Schluss resuspendieren Sie die Pellets in 0,5 Millilitern TBS, die PROPIDIUM iodid enthalten. In diesen Diagrammen sind repräsentative durchflusszytometrische Ergebnisse dargestellt: Die Zellen wurden zunächst auf der Grundlage ihrer elektronischen Volumenseite gegated. Die Streufärbung von Propidiumjod bestätigte, dass sowohl die Kontroll- als auch die Strahlungsprovokationsproben eine normale Zellzyklusverteilung aufwiesen. Während die Messung des Gamma-H-Zwei-Axt-Signals eine mehr als zweifache Zunahme des DNA-Doppelstrangbruchs innerhalb der beiden grau bestrahlten Zellen im Vergleich zu den hier unbehandelten Kontrollen zeigte, werden die relativen Gamma-H-Zwei-AX-Spiegel in Mauszyten eine Stunde nach der ex vivo-Exposition gegenüber niedrigen oder hohen Dosen von Gammastrahlung wie erwartet gezeigt.

Eine starke dreifache Induktion von Doppelstrangbrüchen wurde nach der Zwei-Grau-Provokation festgestellt. Ein leichter, aber statistisch signifikanter Anstieg wurde nach Exposition bei 0,1 Grau beobachtet, was auf eine ausreichende Sensitivität der Methode hinweist. Das durch die Mikroskopie beobachtete, markierte, fokiartige Fluoreszenzmuster deutet darauf hin, dass das Signal von den einzelnen DNA-Doppelstrangbrüchen im CH-Chromatin stammt, was die Spezifität der Färbung bestätigt.

Hier wird das Ausmaß der DNA-Doppelstrangbrüche gezeigt, die von PLE-Zyten entnommen wurden, die einen Monat lang tritiiertem Wasser ausgesetzt waren. Obwohl die Behandlung zu einem Anstieg des basalen Gamma-H-Spiegels um zwei A X führte, war die Veränderung statistisch nicht signifikant. Weiterhin gibt es keine Unterschiede in der gemessenen Bildung und dem Verlust von gamma H zwei Achsen.

Nach der Challenge, die die Kinetik der DNA darstellt, wurde eine Doppelstrang-Bremsreparatur zwischen den Zellen der tritiierten, wasserbehandelten Mäuse und der Kontrolle beobachtet. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, sich an die Regeln und Vorschriften Ihres örtlichen Strahlenschutzverbandes zu halten und ein zertifiziertes Labor oder eine zertifizierte Einrichtung zu nutzen, in der groß angelegte Mausprojekte sowohl mit internen als auch mit externen Strahlungsquellen durchgeführt werden können. Einmal gemeistert, benötigen diese Techniken nur etwa eineinhalb Tage pro 10 Mäuse, um sie abzuschließen, wenn sie richtig ausgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die durchflusszytometrische Analyse der Gamma H two A X-Expression zur Messung von DNA-Dublettenstrangbrüchen und -reparaturen verwenden, die in vivo durch Exposition gegenüber niedrigen Dosen von Tritium- oder Gammastrahlung induziert werden. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden wie M FISH in Blutlymphozyten, der Knochenmark-MICRONUCLEUS-Assay und R-T-Q-P-C-R zur Messung der Expression von Stressreaktionsgenen durchgeführt werden, um die Gesundheitsrisiken zu bewerten, die mit der Exposition gegenüber niedrig dosierter Strahlung verbunden sind.