Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Interkollation und Ausdehnung von Chondrozyten mittels zebra bow-klonaler Zellanalyse sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem eine SOX10 ERT2 Cre zebra bow M-Linie erzeugt wird, um eine gewebespezifische Rekombination im kraniofazialen Knorpel von Embryonen für die klonale Analyse zu ermöglichen. Anschließend werden die Embryonen für drei Stunden mit Tamoxifen zum 10-Somite-Stadium gepulst, um den Rekombinationsprozess auszulösen.

Anschließend werden Embryonen anhand der Expression der CRE-Aktivität und einer starken roten Fluoreszenz oder RFP-Expression ausgewählt, und die Embryonen werden zur Abbildung des kraniofazialen Knorpels präpariert. Die Ergebnisse zeigen eine multiskalen Zellanalyse der kraniofazialen Chondrozyten basierend auf konfokaler Bildgebung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie S-in-Blau-Färbung oder transgenen Linien wie so und GFP beziehungsweise SOX und kde besteht darin, dass Zebra bow es uns ermöglicht, klonale Zellpopulationen, die an der Organbildung beteiligt sind, gezielt zu beobachten und zu verfolgen.

Um die Sammlung der Embryonen am ersten Tag vorzubereiten, stellen Sie mehrere männliche und weibliche Paare von sox, 10 ERT zwei Cree zebra bow M transgenen Zebrafischen, in geteilte Paarungstanks zwischen 17:00 und 18:00 Uhr am folgenden Tag auf, nachdem Sie unter einem Lichtmikroskop überprüft haben, dass die Embryonen unter einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem RFP-Filter das 10-Zellulite-Stadium erreicht haben. Isolieren Sie die hellroten Embryonen und überführen Sie sie in eine neue Petrischale mit frischem E3-Medium, um die Cree-Rekombination auszulösen. Geben Sie eine 10-Mikromolar-Hydroxytamoxifen-Lösung zur Petrischale hinzu und inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius für drei Stunden.

Danach die Tamoxifen-Lösung in einen Behälter für biologische Abfälle dekanteren und E3 verwenden, um die Embryonen mehrmals zu waschen, nachdem sie über Nacht bis zum 28- bis 29-Stadien, dem Milbenstadium, inkubiert wurden; anschließend die Embryonen in E3-PTU-Lösung überführen und in den Inkubator zurückstellen. Um die vollständig entwickelten kraniofazialen Strukturen sichtbar zu machen, Embryonen am vierten Tag nach der Befruchtung (4 DPF) mit intensiv rotem Signal und gelber Cre-Expression in der Netzhaut auswählen. Nachdem ein Embryo gemäß dem Textprotokoll in Trica betäubt wurde, diesen in eine Petrischale mit einem Tropfen Methylcellulose auf einem sauberen Konfokalschlitten überführen.

Geben Sie einen Tropfen frisches Methylcellulose auf und montieren Sie das Embryo mithilfe einer Mikropipettenspitze in dorsaler Lage, wobei darauf zu achten ist, es nicht direkt mit einem 25 × 25-Deckglas anzufassen. Decken Sie das Embryo ab und nutzen Sie das Deckglas gegebenenfalls zur Manipulation des Embryos. Verwenden Sie ein 20×-Trockenobjektiv, um das Embryo abzubilden.

Um auf das Objekt zu fokussieren, drücken Sie die L 100-Taste am Mikroskop und wählen Sie anschließend die Schaltfläche für die konfokale Einstellung. Klicken Sie auf Auto und wählen Sie CFP für Kanal eins, GFP für Kanal zwei und RFP oder M cherry für Kanal drei. Schließen Sie danach das Fenster.

Schalten Sie die Kanäle zwei und drei ein, bevor Sie auf die Schaltfläche „Interlock entfernen“ klicken. Klicken Sie dann auf „Wiedergabe“, um mit dem Scannen zu beginnen. Passen Sie nach der Einstellung die gewünschten Bilder auf und speichern Sie sie sowohl im Format der Konfokal-Software als auch im TIF-Format für die Bildverarbeitung nach Kanälen.

Um die CFP-Bildgebung durchzuführen, schalten Sie die Kanäle zwei und drei aus und aktivieren Sie Kanal eins, ohne den Fokusbereich zu verändern. Stellen Sie die Scan-Einstellungen vor der Aufnahme der Bilder erneut ein, speichern Sie die Bilder wie eben beschrieben und führen Sie die Bildverarbeitung gemäß Pan und Kollegen wie hier gezeigt durch. Die traditionelle Knorpelvisualisierung mittels Ganzpräparat-Färbung mit Alcianblau hat sich bei der Beobachtung des sich entwickelnden Meckel-Knorpels als äußerst wertvoll erwiesen und wird häufig verwendet, um die endgültige zelluläre Organisation zu visualisieren, um so die Entwicklung der Chondrozyten im Zeitverlauf mittels Linienstamm-Analyse weiter zu untersuchen.

Die Verwendung von SOX 10-kDa-transgenen Linien wurde genutzt, um die Zellmigration sowie Konvergenz und Verlängerung in lebenden Embryonen mittels Live-Bildgebung der Zebrafisch-Transgenlinie zu untersuchen. Um die Organisation der Chondrozyten im kraniofazialen Skelett weiter zu erforschen, offenbart dies den Prozess der Chondrozyteninterkalation und -verlängerung, der die Ausdehnung und das Wachstum des Meckel-Knorpels vermittelt. Diese Abbildung zeigt den Unterkiefer von Sox10-ERT2-Cre-eGFP-transgenen Zebrafisch-Embryonen zwischen 3 und 5 Tagen nach der Befruchtung.

Der Unterkiefer wird am besten ventral dargestellt, um klare Ansichten der Zellorganisation im Meckel-Knorpel zu ermöglichen, wie hier gezeigt. Die stabil übermittelten und vererbten Farben erlauben eine einfache Herkunftsspurung und die Kartierung des Zellschicksals kranialer neuraler Crest-Zellen. Die einzelne blaue Zelle scheint zu migrieren und sich zwischen benachbarte Zellen einzufügen, dehnt sich dann entlang der anteroposterioren Achse aus und bildet eine gleichmäßig geformte Chondrastelle, wodurch die globale Form des Meckel-Knorpels erhalten bleibt, während dieser sich nach anterior erstreckt.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Katzenerforschung den Weg, um Chondro in der Skelettbildung von Zebrabärblingen zu untersuchen.