Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Interkollation und Verlängerung von Chondrozyten mittels klonaler Zebrabogenzellanalyse zu visualisieren. Dies wird durch die Generierung einer SOX 10 ERT mit zwei Cree-Zebrabogen-M-Linien erreicht, um eine gewebespezifische Rekombination im kranialen Gesichtsknorpel und in den Embryonen für die klonale Analyse zu erreichen. Als nächstes werden die Embryonen im 10. Lebensstadium mit Tamoxifen gepulst, also drei Stunden lang im Milbenstadium, um den Rekombinationsprozess einzuleiten.

Dann werden die Embryonen für die Expression der CRE-Aktivität und der starken roten Fluoreszenz- oder RFP-Expression selektiert, und die Embryonen werden für die Bildgebung des kraniofazialen C-Knorpels montiert. Die Ergebnisse zeigen eine multispektrale Zellanalyse der kraniofazialen Chondrozyten auf der Grundlage konfokaler Bildgebung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie S in der Blaufärbung oder transgenen Linien wie SO und GFP oder SOX und kde besteht darin, dass wir mit dem Zebrabogen klonale Zellpopulationen, die an einer Organbildung beteiligt sind, spezifisch beobachten und verfolgen können.

Um sich auf die Embryonenentnahme am ersten Tag vorzubereiten, setzen Sie am nächsten Tag zwischen fünf und 18:00 Uhr mehrere männliche und weibliche Paare von sox, 10 ERT zwei Cree zebra bow M transgenen Zebrafischen in geteilten Paarungstanks ein, nachdem Sie unter einem Lichtmikroskop überprüft haben, dass die Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem RFP-Filter das 10-Cellulite-Stadium erreicht haben. Isolieren Sie die hellroten Embryonen und übertragen Sie sie in eine neue Petrischale mit frischem E drei Medium, um die Cree-Rekombination zu induzieren. Geben Sie 10 mikromolare Hydroxytamoxifenlösung in die Petrischale und inkubieren Sie die Embryonen drei Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius.

Dann die Tamoxifenlösung in einen biologischen Abfallbehälter umfüllen und die Embryonen nach der Inkubation der Embryonen über Nacht mehrmals auf den 28. bis 29. Lebensraum mit E drei waschen, die Embryonen in die E drei PTU-Lösung überführen und in den Inkubator zurückbringen. Um die voll entwickelten C-kraniofazialen Strukturen sichtbar zu machen, selektieren Sie Embryonen mit vier DPF mit einem intensiven roten Signal und gelber Cree-Expression in der Netzhaut. Nachdem Sie einen Embryo in Trica betäubt haben, übertragen Sie ihn gemäß dem Textprotokoll in eine Petrischale, die einen Tropfen Methylcellulose auf einem sauberen konfokalen Objektträger enthält.

Geben Sie einen Tropfen frische Methylcellulose und verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um den Embryo dorsal zu positionieren, wobei Sie darauf achten, ihn nicht direkt mit einem 25 x 25 großen Deckglas zu berühren. Decken Sie den Embryo ab und verwenden Sie das Decktuch, um den Embryo bei Bedarf zu manipulieren. Um den Embryo abzubilden, verwenden Sie ein 20-fach-Objektiv mit trockener Linse.

Um auf das Motiv zu fokussieren, drücken Sie die Taste L 100 am Mikroskop und wählen Sie dann die konfokale Setup-Taste. Klicken Sie auf Auto und wählen Sie CFP für Kanal eins, GFP für Kanal zwei und RFP oder M Cherry für Kanal drei. Schließen Sie dann das Fenster.

Schalten Sie die Kanäle zwei und drei ein, bevor Sie auf die Schaltfläche "Interlock entfernen" klicken. Klicken Sie dann auf Wiedergabe, um mit dem Scannen zu beginnen. Nachdem Sie die Einstellungen angepasst haben, nehmen Sie die gewünschten Bilder auf und speichern Sie sie im konfokalen Softwareformat sowie im TIF-Format für die Bildverarbeitung nach Kanälen.

Um CFP-Bildgebung durchzuführen, schalten Sie die Kanäle zwei und drei aus und Kanal eins ein, ohne das Fokusfeld zu ändern. Passen Sie die Scaneinstellungen vor der Bildaufnahme neu an, speichern Sie die Bilder wie gerade beschrieben und führen Sie die Bildverarbeitung wie von pan und Kollegen beschrieben durch, wie hier gezeigt. Die traditionelle Knorpelvisualisierung durch die vollständige Mount-Sian-Blaufärbung war von unschätzbarem Wert bei der Beobachtung des sich entwickelnden Mekel-Knorpels und wird häufig verwendet, um die endgültige zelluläre Organisation zu visualisieren und die sich entwickelnden Chondrozyten im Laufe der Zeit weiter zu analysieren.

Unter Verwendung von SOX 10 kda wurden transgene Linien verwendet, um die Zellmigration, Konvergenz und -extension in lebenden Embryonen unter Verwendung von Live-Bildgebung der transgenen Linie des Zebrabogens zu untersuchen. Um die Organisation der Chondrozyten in der C-kraniofazialen Skelettstruktur weiter zu untersuchen, zeigt sich der Prozess der Chondrozyteninterkollation und -verlängerung, der die Ausdehnung und das Wachstum des Meckel-Knorpels vermittelt. Diese Abbildung zeigt den Unterkiefer von UI Zebra Bow M Sox 10 ERT zwei transgenen Cree-Embryonen zwischen 3D PF und fünf Tage nach der Befruchtung.

Der Unterkiefer ist am besten ventral abgebildet, um einen klaren Blick auf die Zellorganisation im Melesknorpel zu ermöglichen, wie hier gezeigt. Die stabil gepflegten und vererbten Farben ermöglichen eine einfache Abstammungsverfolgung und eine Kartierung des Schicksals von kranialen Neuralleistenzellen. Die einzelne blaue Zelle scheint mit ihren Nachbarzellen zu wandern und zu interpolieren, dann verlängert sie sich entlang der vorderen hinteren Achse, um eine gleichmäßig geformte Chondra-Stelle zu bilden, wodurch die globale Form des Meles-Knorpels beibehalten wird, wenn er sich nach anterior erstreckt.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Katzenentwicklung die Möglichkeit, das Chondro in der Skelettbildung von Zebrafischen zu untersuchen.