Name: Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und -Verbreitung in der embryonalen Meckel-Knorpel mittels Zebrabow-klonaler Zellanalyse in Zebrafisch. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung dynamischer Zellverhaltensweisen während der Organbildung.

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Die Autoren danken Alex Schier für die freundliche Aufteilung der Zebrabow-M transgene Linie, Geoffrey Verbrennungen für den pDest Vektor und Renee Ethier-Daigle für hervorragende Betreuung der Fische Anlage und Leitungen. FINANZIERUNG: Wir sind dankbar für die großzügige finanzielle Unterstützung von NIDCR RO3DE024490 und Shriners Hospitals for Children (ECL) und Post-Doc-Ausbildungsstipendien von Shriners Hospitals for Children (LR und YK).

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt alle Verfahren unter Protokollnummer # 2010N000106. Dies ist im Einklang mit der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International (AAALAC) Richtlinien. 1. Reagenzien und Materialien Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie 1 l 50X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 1) und bereiten 1 l 1X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 2). </li><li> Vorbereitung E3 Embryo Medium mit N-Phenylthioharnstoff (PTU), die durch Zugabe von 30 mg PTU zu 1 l 1X E3. Stir O / N, um sicherzustellen, daß die PTU vollständig gelöst hat. Lagern bei RT. </li><li> Auf Pronase-Lösung herzustellen, verdünnter 150 ul Pronase (0,5 mg / ml) mit 15 ml 1X E3. Diese Menge reicht für 1 Petrischale. Verwenden Sie sofort. </li><li> Bereiten Methylcellulose-Lösung. <ol><li> Vorbereitung E3-Tricaine Lösung durch Mischen von 75 ml 0,2% Tricaine mit 25 ml1X E3. Sieden 3 g Methylcellulose in 75 ml E3-Tricaine Lösung. </li><li> Bilden das Endvolumen auf 100 ml mit E3-Tricaine Lösung. Die endgültige Methylcelluloselösung ist viskos und opak mit einem gelblichen Farbton. Lagerung: RT lichtgeschützt. </li></ol></li><li> Tamoxifen Lager und Induktionslösung <ol><li> Vorbereitung 5 mM Tamoxifen Stammlösung durch Auflösen von 4-Hydroxytamoxifen in 100% Ethanol. Shop Lager bei -80 ° C. </li><li> Bereiten Sie frische Verdünnung von Tamoxifen auf den Wunsch Konzentration in 1X E3, um die Induktion Lösung zu erhalten. VORSICHT! Bitte wenden Sie sich vor dem Gebrauch MSDS. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 1 l 0,2% Tricaine gemäß Tabelle 3. </li><li> Erhalten konfokalen Rutschen. Kleben Sie vier Deckglas (18 x 18) zusammen, um einen Block zu bilden dann legen Sie 2 Blocks auf einem 24 x 60 Deckglas 2 cm voneinander entfernt, damit die Montage des Embryos in der Mitte. </li></ol> 2. Embryo Vorbereitung <ol><li> Transgenen Linien. <br/&gt; Hinweis: Zebrabow-M war ein großzügiges Geschenk von Alex Schier Labor. </li><li> Sox10: ERT2-Cre HINWEIS: Generieren Sie die Targeting-Vektor pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre unter Verwendung von Standardverfahren und molekulare Klonierung kommerziell erhalten Rekombination Cloning-Technologie. <ol><li> Kombinieren Sie 5 &quot;entry clone (pENTR5&#39;- sox10p) enthält 7.2Kb des Sox10-Promotor, eine Gateway-Mitte-Klon (PME-ERT2-Cre) und eine 3&#39;-entry clone (pENTR3&#39;-polyA) in einer LR-Reaktion mit Objektiv Ziel vector pDestTol2- α-Kristallin: YFP. </li><li> Reinige Konstrukt pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre. Co-einspritzen des gereinigten Konstrukts (100 ng / ul) mit Tol2 Transposase mRNA (50 ng / &amp; mgr; l) in WT Embryonen (F0) an dem einen Zellstadium. </li><li> Screen F0 Erwachsenen Gründer für Keimbahn-Übertragung auf der Grundlage starker gelber Fluoreszenz in F1 Embryonen. </li></ol></li><li> Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M <ol><li> Outcross die Zebrabow-MLinie (2.1.1) mit der Sox10: ERT2-Cre transgene Linie. </li><li> Wählen Sie die Embryonen eine starke allgegenwärtigen RFP Ausdruck und YFP Linsenmarkierung und wachsen sie, bis Erwachsenen zeigt. </li></ol></li></ol> 3. Embryonen <ol><li> Richten Sie mehrere Paare von Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M transgenen Zebrafisch von 17.00 bis 06.00 Uhr am Tag 1. </li><li> Am folgenden Tag, ziehen Sie die Teiler in der Früh und sammeln die Eier um die Mittagszeit. </li><li> Übertragen Sie sie auf Petrischalen und fügen Sie 15 ml des Pronaselösung, um die Embryonen dechorionate. </li><li> Die Embryonen für 1 bis 5 min inkubieren, bis ca. 60% der Embryonen wurden dechorionated. Die Reaktion durch Dekantieren der Pronaselösung und waschen Sie die Embryonen 3-4 mal mit frischem E3 Medium. </li><li> Inkubieren Sie die dechorionated Embryonen in E3 bei RT O / N und lassen Sie sie zu entwickeln, um die 10 Somiten Stadium zu erreichen. Inkubieren 50-60 Embryonen pro Gelege zu verschiedenen Entwicklungswachstum zu vermeiden. </li></ol&gt; 4. Behandlung <ol><li> Überprüfen Entwicklungsstadium der Embryonen unter einem Lichtfeld-Mikroskop, um sicherzustellen, sie sind auf dem 10 Somiten Stadium. </li><li> Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem rot fluoreszierendes Protein (RFP) Filter, isolieren die leuchtend roten Embryonen. </li><li> Verfahren zur Induktion des Cre-Rekombination durch Zugabe von 10 uM Hydroxytamoxifen Lösung in eine Petrischale und Inkubieren der isolierten Embryonen bei 28,5 ° C für 3 Stunden. </li><li> Dekantiert man die Tamoxifen-Lösung und waschen Sie die Embryonen mehrmals mit E3. VORSICHT! verwerfen die Tamoxifen-Lösung in einem speziellen biologischen Abfallbehälter. </li><li> Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° CO / N. </li><li> Wenn die Embryonen sind ungefähr 28-29 Somiten Stadium (etwa 24 Stunden nach der Befruchtung), Inkubation der Embryonen bei 28,5 ° C in der E3-PTU-Lösung Jenseits. HINWEIS: PTU hier verwendet, um die Bildung von Melanophoren in den sich entwickelnden Embryonen zu hemmen. Diese Behandlung notwendig istvermeiden Sie die Signalverzerrung der Fluoreszenz von Autofluoreszenz Melanophoren. </li><li> Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° C </li></ol> 5. Embryonenauswahl <ol><li> Um die ausgereifte kraniofazialen Strukturen sichtbar zu machen, wählen Sie die Embryonen im 4 Tage nach der Befruchtung für die Intensität des roten Signals und Cre Expressionsmarker Positivität (gelb in der Netzhaut). </li><li> Betäuben die Embryonen mit E3 / 0,015% Tricaine Lösung. Anästhesie wird bestätigt, wenn keine aktiven Bewegungen oder fin-Aktivität beobachtet wird, wenn sanft Drängen des Embryos. </li></ol> 6. Montage der Embryo in Methylcellulose <ol><li> Übertragung der gewählten Embryo zur Bildgebung in eine Petrischale gegeben, die einen Tropfen von Methylcellulose und sanft embalm den Embryo mit Methylcellulose. </li><li> Auf eine saubere konfokalen Rutsche, einen Tropfen von frischem Methylcellulose und montieren Ihren Embryo innerhalb der Tropfen mit Hilfe eines Microloader Spitze. Position Embryo dorsal unter Vorsicht, nicht zu berührender Embryo direkt. </li><li> Decken Sie die montierten Embryo mit einer 25 x 25 Deckglas und die Position des Embryos ggf. durch Manipulation des Deckglases. </li><li> Der Embryo ist nun bereit, image. </li></ol> 7. Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Nutzen Sie die 20-fach trockenen Linsenobjektiv (numerische Apertur 0,75; Lochblendengröße 2,0 um) zum Fokussieren des Embryos. </li><li> Drücken Sie die L100-Taste auf dem Mikroskop und wählen Sie die Kanäle in der Software. </li><li> Wählen Sie das konfokale Setup-Taste und klicken Sie auf &#39;auto&#39; und wählen Sie die folgenden Kanäle vor dem Schließen des Fensters: Ch1: CFP, Kanal 2: GFP, Ch3: RFP oder mCherry </li><li> Schalten Sie CH2 und CH3, bevor Sie auf die &#39;entfernen Interlock &quot;-Taste. Klicken Sie auf &quot;Play&quot;, um das Scannen zu beginnen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Struktur von Interesse, die sich am besten, indem Sie mit ½ Rahmen / s und Hochspannung (HV) 150 und dann die Einstellungen entsprechend durchgeführt wird, bis die gewünschte Bildqualität achieved. Der RFP wäre heller als andere Farben, damit die HV einzustellen. Ändern Sie die Z-Position, um sowohl YFP und RFP-positiven Zellen zu finden. </li><li> Sobald Sie mit den Einstellungen festgelegt, erfassen Sie das Image Ihres Embryos. Speichern Sie Ihr Bild in der konfokalen Imaging-Software-Format und TIFF-Format für die Bildverarbeitung in jedem Split-Kanal. </li><li> Als nächstes wird für CFP-Bildgebung, schalten Sie CH2 und CH3, und schalten Sie Ch1. Durch Veränderung der Einstellungen wie in Schritt 5 ohne Änderung des Fokusbereichs. HINWEIS: CFP kann wirklich schwer zu erkennen aufgrund von Hintergrundsignal in blauen Kanal, der durch Einstellen der Lochblendengröße umgangen werden kann. Eine größere Lochblendengröße ermöglicht eine bessere Detektion der Fluoreszenz durch die Reduzierung Signal / Rausch-Verhältnis. Allerdings wird eine größere Pinhole konfokalen Effekt zu reduzieren, Kompromisse bei der Bildqualität. Daher ist eine sorgfältige Einstellung der Einstellungen erforderlich ist, um die gewünschte Bildqualität und Intensität zu erreichen. </li><li> Nehmen Sie das Bild und speichern Sie es in der sowohl Format (konfokalen Software und TIFF) für die Bildverarbeitung. Bilder können dann mit gängigen Bildverarbeitungssoftware, um Schichten zusammenzuführen und zur Verbesserung der Farbeinstellungen, wie Pan und Kollegen 8 beschrieben verarbeitet werden. </li></ol>

<ol><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li>
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<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Alcianblau und Photokonvertierbare transgenen Linien wie oben beschrieben, gegenseitig ergänzt den komplizierten Prozess der Knorpel- und Knochenentwicklung zu bestimmen. Allerdings hat Live-Zellmigration und Organisation während der Organogenese lange vermutet worden und indirekt nachgewiesen, aber nie visualisiert. Zebrabow-M transgene Linie gepaart mit einer Knorpel spezifischen Cre ermöglicht die gleichzeitige Live-Beobachtung aller dieser verschiedenen Ereignisse im Knochen- und Knorpelbildung beteiligt. Diese Tech...

Kraniofazialen Entwicklung erfordert komplexe molekularer, zellulärer und Gewebe-Wechselwirkungen, die Zellproliferation, Migration und Differenzierung 1,2, 3 fahren. Diese streng reguliert und komplexer Prozess unterliegt genetischen und umweltbedingten Störungen, so dass kraniofazialen Fehlbildungen gehören zu den häufigsten Geburtsfehlbildungen 1-9. Während chirurgischer Eingriffe bleiben die Hauptstütze der Behandlung für kraniofaziale Anomalien, das Verständnis der Entwicklung Basis ist wichtig, um zukünftige Therapien zu innovieren. Daher Studium der Morphogenese und die Mechanismen in der Konvergenz und der Erweiterung und Zell Integration bietet neue Einblicke in die Bildung des kraniofazialen Skeletts 1. Schädel Neuralleiste migrieren und Füllen der ersten Schlundbogen, dann gepaart bilden Kiefer Prozesse, die zur Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt bilden verlängern. Morphogenese of der Meckel-Knorpel benötigt Chondrozyten-Organisation über Richtungsproliferation, Zellpolarisation und Differenzierung 1,10. Allerdings bleibt die Komplexität der Chondrozyten-Organisation in das Wachstum und die Erweiterung des Meckel-Knorpel unklar. Grundlegendes zu dynamischen Zellverhalten ist entscheidend für das Verständnis angeborene Fehlbildungen betroffen Kiefergröße, wie hypoplastische Mandibula Phänotypen 11. Zebrafischembryonen bieten viele Entwicklungs- und genetische Vorteile für die detaillierte Untersuchung der Meckel-Knorpel Morphogenese. Ihre genetische Lenkbarkeit, Transparenz, ex vivo und schnelle Entwicklung sind leistungsstarke Vorteile verleiht ihm auch zur Beobachtung der Zellbewegung und Organisation von Live-Imaging-6. Verwendung Linie-Tracing-Tools, wie Sox10: kaede transgene Linie, haben wir und andere der Neuralleiste Ursprünge der embryonalen kraniofazialen Skeletts 1,5 abgegrenzt. Using der Sox10: ERT2-Cre mit dem ubi: Zebrabow-M transgene Linie, ist es nun möglich, um Details des Zellbewegungen während kraniofazialen Entwicklung zu erforschen. Die Zebrabow-M, eine transgene Linie mit der Ubiquitin-Promotor, der die Expression von verschiedenen Fluorophore, die jeweils von Lox-Stellen flankiert 8 entwickelt. Die Zebrabow-M Standard Fluorophor Rot, RFP ausdrückt. Nach Induktion der Cre-Expression, die Zebrabow-M zu konstruieren rekombiniert und Zellen exprimieren eine Kombination von verschiedenen Fluorophoren (RFP, CFP und YFP) Erzeugen multispektraler Expression im Embryo. Alle Tochterzellen, die von den markierten Zellen nach dem Rekombinationsereignis teilen werden dann klonal beschriftet, so dass die Zellpopulationen, die aus verschiedenen nebeneinander liegenden Vorläuferzellen abgeleitet werden klonal beschriftet. Durch diese Klonierung Markierung von Zellen, können die Zellen-Proliferation und Migration mit klonaler Auflösung (Abbildung 1 und 2) eingehalten werden.

<table><tbody><tr><td>Pronase</td><td>Roche Life Sciences</td><td>10165921001</td><td>Prepare 500 &mu; l Lageraliquote zu 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-Phenylthiourea)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7619</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>4-HydoxyTamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T176</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>25 x 25 Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540C</td><td></td></tr><tr><td>pENTR5'-TOPO TA Klonierungsset</td><td>Lebenstechnologien&nbsp;</td><td>K591-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Klonierungs-Kit&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR3'-pA</td><td>Tol2Kit</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>pDEST</td><td></td><td></td><td>Geschenk von Geoffrey Burns</td></tr><tr><td>Labs Hellfeldmikroskop&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von chondrozyten-einlagerung und directional verbreitung über zebrabow klonalen zellanalyse in der embryonalen meckel-knorpel

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Entwicklung der Wirbeltiere kraniofazialen Strukturen erfordert eine genaue Abstimmung der Zellmigration, Proliferation, Adhäsion und Differenzierung. Strukturieren der Meckel-Knorpel, einem ersten Schlundbogen-Derivat, beinhaltet die Migration der Schädel Neuralleiste (CNC) Zellen und die fortschreitende Partitionierung, Proliferation und Organisation von differenzierten Chondrozyten. Mehrere Studien haben CNC Migration während der Unterkiefer Morphogenese beschrieben, aber die Details, wie die Chondrozyten zu erreichen Organisation in das Wachstum und die Erweiterung der Meckel-Knorpel, bleibt unklar. Die Sox10 beschränkt und chemisch induzierte Cre-Rekombinase-vermittelte Rekombination erzeugt Permutationen von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (RFP, YFP und CFP), wodurch die Schaffung eines multispektralen Kennzeichnung von Vorläuferzellen und deren Nachkommen, was deutliche Klonpopulationen. Mittels konfokaler Zeitraffer-Fotografie, ist es möglich, die Chondrozyten beobachten behavioder während der Entwicklung des Zebrafisches Meckel-Knorpel. Multispektrale Zellmarkierung ermöglicht es Wissenschaftlern auf eine Verlängerung des Meckel-Chondrozyten zu demonstrieren. Während der Extensionsphase des Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt, interkalieren Chondrozyten zu Verlängerung zu bewirken, wie sie in einer organisierten Einzelzellschicht Reihe stapeln. Die Nichtbeachtung dieser organisierten interkalierenden Prozess zur Zellerweiterung vermitteln, bietet das Mobil mechanistische Erklärung für die hypoplastischen Unterkiefer, die wir in der Unterkieferfehlbildungen zu beobachten.

Traditionelle Knorpel Visualisierung ganze Berg Alcianblau Flecken ist von unschätzbarem Wert bei der Beobachtung der Entwicklung von Meckel-Knorpel und häufig verwendet, um endgültige zelluläre Organisation 12 (1A) zu visualisieren. Um die Entwicklung von Knorpelzellen weiter zu analysieren Überstunden, Linie Tracing mit Sox10: Kaede transgenen Linien hat uns ermöglicht, die Zellmigration, Konvergenz und Extension im Live-Embryonen 2,12 (1B) zu studieren....

Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live- Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Interkollation und Ausdehnung von Chondrozyten mittels zebra bow-klonaler Zellanalyse sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem eine SOX10 ERT2 Cre zebra bow M-Linie erzeugt wird, um eine gewebespezifische Rekombination im kraniofazialen Knorpel von Embryonen für die klonale Analyse zu ermöglichen. Anschließend werden die Embryonen für drei Stunden mit Tamoxifen zum 10-Somite-Stadium gepulst, um den Rekombinationsprozess auszulösen.Anschließend werden Embryonen anhand der Expression der CRE-Aktivität und einer starken roten Fluoreszenz oder RFP-Expression ausgewählt, und die Embryonen werden zur Abbildung des kraniofazialen Knorpels präpariert. Die Ergebnisse zeigen eine multiskalen Zellanalyse der kraniofazialen Chondrozyten basierend auf konfokaler Bildgebung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie S-in-Blau-Färbung oder transgenen Linien wie so und GFP beziehungsweise SOX und kde besteht darin, dass Zebra bow es uns ermöglicht, klonale Zellpopulationen, die an der Organbildung beteiligt sind, gezielt zu beobachten und zu verfolgen.Um die Sammlung der Embryonen am ersten Tag vorzub

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von Knorpeldefekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von autologen Chondrozyten auf einer Matrix ausgesät ist eine gut akzeptierte Methode für den Umbau und die Reparatur von Gelenkknorpelläsionen Bereitstellung befriedigend langfristige Ergebnisse. Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation (MACT) bietet eine standardisierte und klinisch etablierte Methode der Implantation.

Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation für Umbau und Reparatur von Knorpeldefekten in einem Kaninchen-Modell

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Wir präsentieren ein Protokoll zur Präparierung und Kultivierung von embryonalen Mittelfußknochen am Tag 15 (E15). Dieses hochphysiologische ex vivo-Modell der endochondralen Ossifikation bietet Bedingungen, die der in vivo-Situation näher kommen als Zellen in Monolayer- oder 3D-Kulturen und ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung des Knochenwachstums und der Knochenentwicklung.

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

Wir entwickelten zwei Sätze von Kombinationen in Rosa26 tdTomato Tracing (ubiquitär in allen Zellen exprimiert) / Cre (insbesondere in Chondrozyten exprimiert) Mäuse: eine mit 2.3Col1a1-GFP (spezifisch für Osteoblasten) und eine mit Immunofluoreszenz (spezifisch für Knochenzellen). Die Daten zeigen die direkte Umwandlung von Chondrozyten in Knochenzellen.

Co-Lokalisierung von Zell Lineage Marker und die Tomate Signal

Wir stellen ein Verfahren zur Quantifizierung der DNA-Methylierung auf der Basis des 5-Methylcytosin (5-mC) -Dot-Blots vor. Wir haben die 5-mC-Werte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung bestimmt. Diese einfache Technik könnte verwendet werden, um schnell den Chondrozyten-Phänotyp in der ACI-Behandlung zu bestimmen.

Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em&gt; In vitro</em

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Arthrose, genetische Faktoren und/oder verschiedenen laden-Therapien die Verwundbarkeit der in Situ Chondrozyten auswirken.

Echtzeit-Visualisierung und Analyse der Knorpelzelltransplantation Verletzungen aufgrund der mechanischen Belastung in völlig intakt murinen Knorpel Explantaten

Diese Methode beschreibt die Verwendung des R26R-Konfetti (Konfetti) Mausmodells zur Untersuchung mineralisierter Gewebe, die alle Schritte von der Zuchtstrategie bis zu den Bilderfassungen abdeckt. Enthalten ist ein allgemeines Protokoll, das auf alle Weichgewebe angewendet werden kann, und ein modifiziertes Protokoll, das auf mineralisierte Gewebe angewendet werden kann.

Clonale genetische Tracing mit der Konfetti-Maus zur Untersuchung mineralisierter Gewebe

Wir stellen eine Methode vor, um die räumliche Chondrozytenorganisation im Anulus fibrosus der Bandscheibe mit einer optischen Schnittmethode zu untersuchen.

Optische Schnittung und Visualisierung der Bandscheibe von der Embryonalentwicklung bis zur Degeneration

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Chondrozyten, Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleiteten Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorischen Chondroprogenitoren (MCPs) aus menschlichem Gelenkknorpel. Es umfasst enzymatischen Verdau, Fibronektin-Adhäsion und migrationsbasierte Assays zur Isolierung und Charakterisierung dieser Zellen.

Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Lernen Sie die Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und -Verbreitung in der embryonalen Meckel-Knorpel mittels Zebrabow-klonaler Zellanalyse in Zebrafisch. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung dynamischer Zellverhaltensweisen während der Organbildung.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel (Video) | JoVE Journal

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

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