Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Planergradienten-Diffusionskammer zu schaffen, um die Chemosteuern in einer 3D-Kollagenmatrix zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine 3D-Silikonform unter Verwendung einer Bildgebungskammer für lebende Zellen hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, hydrophile und hydrophobe Deckgläser herzustellen und diese für den Zusammenbau der 3D-Silikonform zu verwenden.

Als nächstes wird die Kollagenzellmischung in das mittlere Kompartiment gegeben und polymerisiert gelassen. Der letzte Schritt besteht darin, die hydrophoben Deckgläser nach der Inkubation aus der Form zu entfernen und dem einen Reservoir reines Medium und dem anderen Reservoir Medien mit chemochemopletischem Lockstoff hinzuzufügen. Letztendlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die Chemotaxis der Zellen im Laufe der Zeit zu verfolgen und die Verschiebung der Zellbewegung innerhalb der Kollagenmatrix sichtbar zu machen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Boin-Kammer und der Mikroathletik besteht darin, dass sie einen einfachen Aufbau zur Untersuchung der Migration im 3D-Raum mit einem einfachen Diffusionsgradienten ermöglicht, ohne dass eine Einwegpipette verwendet werden muss. Messen Sie 150 Mikroliter der Aminoseline A-P-T-M-S ab und gießen Sie sie in eine 50 Milliliter Tube. Geben Sie dann mit einer zweiten Einwegpipette 30 Milliliter 100%Ethanol in das Röhrchen und schließen Sie den Deckel.

Die Lösung zwei Minuten lang vortexen, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Gießen Sie dann die Lösung in eine Petrischale aus Glas und stellen Sie sie beiseite. Gießen Sie anschließend 15 Milliliter 100%igen Ethylalkohol in eine zweite Petrischalen und platzieren Sie sie mit einer neuen Einwegpipette mit der ersten Schale.

Messen Sie 30 Milliliter entionisiertes Wasser ab und gießen Sie die Lösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie anschließend mit einer neuen Einwegpipette 1,875 Milliliter Glualdehyd in das Röhrchen und schließen Sie den Deckel. Wirbeln Sie die Lösung zwei Minuten lang vor und gießen Sie die Mischung dann in eine dritte Petrischale.

Nehmen Sie mit einer Pinzette 1 22 Millimeter runder Glasdeckglas heraus und spülen Sie beide Seiten mit 100 % Ethanolmischung ab. Legen Sie mit einer Einwegpipette den Spülglasdeckel in die erste Schale, die Aminosole enthält, und lassen Sie ihn mit einer Pinzette fünf Minuten lang in der Lösung ruhen. Nehmen Sie den Glasabdeckbezug heraus und spülen Sie ihn erneut mit 100 % Ethanol aus.

Lassen Sie dann den gespülten Glasdeckel in die Schüssel mit Glutaraldehyd gleiten und stellen Sie ihn 30 Minuten lang beiseite. Entfernen Sie nach 30 Minuten den Glasdecker mit einer Pinzette und spülen Sie ihn mit entionisiertem Wasser ab. Legen Sie den gespülten Deckslip auf ein Taschentuch, um ihn über Nacht bei Raumtemperatur zu trocknen.

Zur Herstellung von hydrophoben Deckgläsern geben Sie zunächst 500 Mikroliter TTS, 100 Mikroliter Essigsäure und 19,4 Milliliter Heane in ein 50-Milliliter-Röhrchen und wirbeln es zwei Minuten lang. Gießen Sie dann die Lösung in eine Petrischale aus Glas und lassen Sie mit einer sauberen Pinzette eine Glasabdeckung in die vorbereitete Lösung fallen und lassen Sie sie dort zwei Minuten lang stehen. Nehmen Sie nach zwei Minuten den Glasdeckbezug mit einer Pinzette heraus und spülen Sie ihn mit einer Einwegpipette mit entionisiertem Wasser ab, legen Sie den Deckglas auf ein Taschentuch und lassen Sie ihn über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

Bewahren Sie die getrockneten Deckgläser in einer Petrischale aus Kunststoff auf, bis sie zum Starten benötigt werden, und bauen Sie die Bildgebungskammer für lebende Zellen wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben zusammen. Mischen Sie anschließend die Silikonelastomerlösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers, um fünf Milliliter Elastomer herzustellen. Gießen Sie dann mit einem Einweg-Laborspatel die Silikonelastomerlösung langsam in die Bildgebungskammer für lebende Zellen, um die Formkomponenten nicht zu stören.

Stelle die Form an einem sicheren Ort beiseite, um die Raumtemperatur über Nacht zu erhöhen. Ziehen Sie am nächsten Morgen die Form mit einer Pinzette heraus und ziehen Sie den bearbeiteten Aluminium-Metallwürfel vorsichtig aus der Form. Gehen Sie dann zum Waschbecken und spülen Sie die Form mit entionisiertem Wasser aus und legen Sie die Form zum Trocknen auf ein Papiertuch.

Schneiden Sie nach dem Trocknen mit einem Hobbymesser Schlitze im Abstand von 2,34 Millimetern zu jedem Längsende in der Silikonform ab. Stellen Sie sicher, dass die Form vor der Verwendung an einem sicheren und trockenen Ort bleibt, bis sie für das Experiment benötigt wird. Spülen Sie die Form mit 90%igem Ethanol aus und legen Sie die Form in eine mit deionisiertem Wasser gefüllte Petrischale, um sie über Nacht stehen zu lassen.

Übertragen Sie die Form am nächsten Morgen auf ein Papiertuch und lassen Sie sie an der Luft trocknen, während die Form trocknet. Verwenden Sie ein hochpräzises Diamantritzwerkzeug, um das Quadrat zu schneiden. Die hydrophile Abdeckung gleitet in zwei Rechtecke, die etwas größer als 3,95 Millimeter x 5,99 Millimeter sind.

Schieben Sie dann jede der geschnittenen rechteckigen Abdeckungen in die Schlitze, schneiden Sie in die Silikonform, drehen Sie die Form auf den Kopf und tragen Sie mit einer Einwegpipette Vakuumfett entlang des Bodens der Silikonform auf. Drehen Sie dann die Form mit der rechten Seite nach oben zurück und drücken Sie den Boden der Form auf den kreisförmigen Abdeckschirm aus hydrophilem Glas. Um eine Versiegelung herzustellen, bereiten Sie eine Mischung aus Medium und Chemolockstoff in einem 15-Milliliter-Röhrchen in der gewünschten Konzentration vor, pipettieren Sie fünf Milliliter der Mischung in ein neues Milliliterröhrchen und fünf Milliliter reines Medium in ein zweites Röhrchen.

Stellen Sie beide Röhren in ein auf 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Pipettieren Sie anschließend 30 Mikroliter von 10 XPBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie sechs Mikroliter einer normalen Natronlauge in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es 15 Sekunden lang.

Geben Sie dann 18 Mikroliter gelbgrün fluoreszierendes Carboxylat, modifizierte Mikrokügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und 168,3 Mikroliter eiskaltes Röhrchen. Typ eins Rattenschwanzkollagen. Die Mischung 30 Sekunden lang aufreiben.

Fügen Sie anschließend 77,7 Mikroliter der gewünschten Zelle hinzu. Bei zwei mal 10 die sechs Zellen pro Milliliter in Medium in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und mischen. Pipettieren Sie mit einer Pipettenspitze 20 Sekunden lang 300 Mikroliter der Kollagenzellmischung in die mittlere Vertiefung der vorbereiteten Formanordnung.

Stellen Sie dann die Form auf eine Einweg-Petrischale und stellen Sie sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einen Standard-Inkubator. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit mit einer Pinzette beide hydrophoben Deckgläser, indem Sie sie an die Oberseite jedes Deckglases klemmen und dann nach oben und von der Form wegziehen. Bewegen Sie das gesamte System zum Mikroskop und untersuchen Sie die Kammer, um sicherzustellen, dass die Seiten der Kollagenform noch gerade sind, was einen Plandiffusionsgradienten mit einem System ermöglicht, das sich noch unter dem Mikroskop befindet. Geben Sie 100 Mikroliter Zellmedien in die erste Vertiefung.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Zellmedium mit der gewünschten Chemo-Lockstoffkonzentration in die Vertiefung auf der anderen Seite der Matrix. Verfolgen Sie die Zellmigration in Bezug auf die fluoreszenzmarkierten Mikrosphären, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Die hier vorgestellte Bildserie zeigt die Diffusion von Pansen, die sich durch ein Kollagengel von einem Milligramm pro Milliliter bewegen.

Dieses Beispiel zeigt den wahren planaren Diffusionsgradienten des Systems, der auch von allen eingeführten Chemo-Lockstoffen erwartet werden kann. In dem hier gezeigten Beispiel wurde die Intensität des Romin-Signals über die Zeit an den durch die roten Quadrate gekennzeichneten Stellen gemessen. Die Konzentration an jedem dieser Orte ist in diesem Diagramm als separate Linie dargestellt, die bei Messung im stationären Zustand einen linearen Konzentrationsgradienten basierend auf der Position im Gel erzeugt.

Diese Beziehung bleibt über einen Bereich von Kollagenmatrixkonzentrationen hinweg linear, was dieses System sehr nützlich für Zellexperimente macht. In diesem Bild ist ein rot gefärbtes Neutrophil in einer Kollagenmatrix zu sehen, die mit fluoreszierenden grünen Mikrosphären verstreut ist, die als Positionsreferenzen verwendet werden. Die nächsten drei Bilder zeigen die gerichtete Wanderung des Neutrophilen, während er sich über einen Chemo-Lockstoffgradienten nach oben bewegt, was durch den weißen Pfeil dargestellt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine einfache Diffusionskammer erstellen, um die Zellmigration in einer 3D-Kollagenmatrix zu untersuchen.