Name: Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Lernen Sie die Herstellung einer planaren Gradienten-Diffusionskammer zur Untersuchung von Chemotaxis in einer 3D-Kollagenmatrix. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Zellmigration mittels konfokaler Mikroskopie.

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Die Autoren möchten Dr. Jonathan Reichner und Dr. Angle Byrd für ihre Einblicke in Zellexperimente danken. Das Graduate Research Fellowship Program (GRFP) der National Science Foundation unterstützte diese Arbeit.

1. 3D-Formenbau und Parts <ol><li> Schimmel <ol><li> Vor der Arbeit, eine Silikonelastomer-Kit, ein Live Cell Imaging Kammer, eine 22 mm Deckglas und einer bearbeiteten Aluminium-Metall-Würfel mit den Abmessungen 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Bereiten Sie das Live Cell Imaging Kammer zur Formung, indem das Deckglas in der unteren Halterung und Montage der Rest der Kammer, wie den Angaben des Herstellers. </li><li> Als nächstes wird mit einer Pinzette, legen Sie die bearbeiteten Aluminium-Metall-Würfel in der Mitte des Live Cell Imaging Kammergehäuse und auf der Oberseite des Deckglases und dann beiseite stellen. </li><li> Mischungssiliconelastomerlösungen gemäß dem Protokoll des Herstellers zu 5 ml Elastomer bilden. </li><li> Mit einem Einweg-Labor Spatel, gießen Siliconelastomer-Lösung in Live Cell Imaging Kammer-Setup und stellen Sie sicher nicht platziert bearbeitetem Aluminium Metallwürfel bewegen. Stellen Sie die Anlage auf dem Labortisch, an einem sicheren Ort O / N für die Heilung. </li><li> Am nächsten Morgen, dekonstruierendas Live Cell Imaging Kammer, wie vom Hersteller empfohlen wird, und ziehen Sie Form mit einer Pinzette. Mit einer Pinzette vorsichtig heraus das bearbeitete Aluminium-Metall-Würfel von Schimmel. Gehen Sie auf die Wanne und spülen Sie die Form mit VE-Wasser. Legen Sie die Form auf einem Papiertuch, um zu trocknen. </li><li> Nach dem Trocknen mit einem Hobby-Messer, schneiden Schlitze durch die Form, Abstand 2,34 mm von jedem Längsende, in der Silikonform. Achten Sie darauf, die Form bleibt in einem sicheren und trockenen Ort, bis Sie bereit sind, um das System für ein Experiment zu konstruieren sind. </li></ol></li><li> Hydrophilen und hydrophoben Deckgläser Vorbereitung <ol><li> Damit der Kollagenmatrix zu einer Oberfläche haften, zu schaffen hydrophilen Deck: <ol><li> Unter Verwendung einer Einwegpipette, abmessen 150 ul 3-Aminopropyltrimethoxysilan und gießen Lösung in ein 50 ml Röhrchen. 30 ml 100% Ethanol auf die 50-ml-Röhrchen mit einem zweiten Einwegpipette und den Deckel schließen. Vortex die Lösung für 2 min, wodurch eine vollständige Durchmischung. Punsere Lösung in einer Glaspetrischale und beiseite stellen. </li><li> Gießen Sie 15 ml 100% Ethanol in eine zweite Petrischale und beiseite stellen (stellen Sie sicher, um Gerichte zu markieren). </li><li> Mit Hilfe einer neuen Einweg-Pipetten, abmessen 30 ml VE-Wasser und gießen Lösung in einen 50-ml-Tube. Als nächstes wird mit einer neuen Einweg-Pipetten Maßnahme aus 1.875 ul Glutaraldehyd und gießen Lösung in den gleichen 50-ml-Tube und den Deckel schließen. Vortex die Lösung für 2 min, wodurch eine vollständige Durchmischung. Die Mischung in Drittpetrischale, und beiseite stellen. </li><li> Mit einer Pinzette, nehmen Sie eine 22 mm runden Deckglas und spülen Sie beide Seiten mit 100% Ethanol-Gemisch mit einer Einwegpipette. </li><li> Platzieren gespült Deckglas in 3-aminopropyl-trimethoxysilan mit 30 ml 100% ige Ethanollösung Schüssel und zu ermöglichen, in Lösung 5 min stehen lassen. </li><li> Mit einer Pinzette herausnehmen Deckglas und spülen wieder mit 100% Ethanol-Lösung mit Einwegpipette. </li><li> Drop gespült Deckglas in 1875ul Glutaraldehyd und 30 ml entionisiertem Wasser-Gemisch und beiseite für 30 min eingestellt. </li><li> Nach 30 Minuten, entfernen Sie Deckglas mit einer Pinzette und spülen mit VE-Wasser und legen Sie auf das trockene Gewebe O / N bei RT trocknen. </li><li> Wiederholen Sie die Deckeintauchen und Bewegen für so viele Deckgläser als mit den gleichen erzeugten Lösungen benötigt. </li></ol></li><li> Machen hydrophoben Deckgläser durch das gegebene Protokoll. <ol><li> Gib 500 ul Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl wurden 100 ul Essigsäure und 19,4 ml Hexan in einem 50 ml-Röhrchen und Vortex für 2 min. Gießen Lösung in Glaspetrischale und beiseite stellen. </li><li> Mit sauberen Pinzette, nehmen Sie ein Deckglas-and-Drop in die vorbereitete gemischte Lösung für 2 Minuten. Nach 2 Minuten vergangen sind, nehmen Sie Deckglas mit einer Pinzette und spülen mit VE-Wasser unter Verwendung einer Einwegpipette und Ort Deckglas auf das trockene Gewebe O / N bei RT trocknen. Shop Deckglas in Kunststoff-Petrischalen bis zur Verwendung. </li><li> Wiederholen Sie die Deck dipping und Bewegen für so viele Deckgläser als mit den gleichen erzeugten Lösungen benötigt. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mold Assembly <ol><li> Vor der Verwendung von Formen, mit einem Einweg-Pipetten spülen Sie die Form mit 90% Ethylalkohol in einem Behälter für Chemieabfälle. Als nächstes legen Sie die Form in einer Petrischale mit entionisiertem Wasser gefüllt und lassen Sie O / N sitzen. </li><li> Nehmen Sie Form aus der Lösung mit einer Pinzette und auf einem Handtuch an der Luft trocknen, bevor Sie den Formaufbau. </li><li> Während die Form Lufttrocknung, schneiden Sie die quadratische hydrophile Deckgläser in zwei Rechtecke etwas größer als 3,95 mm x 5,99 mm mit einem hochpräzisen Diamantritzwerkzeug. Schieben Sie die Schnitt Rechteck Deckglas in die in die Silikonform geschnitten Slots. </li><li> Drehen Sie die Form auf den Kopf und gelten Vakuumfett auf dem Boden der Silikonform mit einer Einwegpipette. Als nächstes drehen Sie die Form wieder rechten Seite nach oben und drücken Sie den Boden der Form auf die kreisförmige hydrophile GlasabdeckungenLippe, um eine Dichtung zu schaffen. </li><li> Mit Einweghandschuhe, nehmen Sie den zusammengesetzten Form und in einen Einweg-Petrischale und dann in eine Bio-Haube. Schalten Sie UV Bio-Haube-Lampe für 1 Stunde, um die Form zu sterilisieren, bevor Experimente auftritt. </li></ol> 3. Kollagen Mixture und 3D-Matrix <ol><li> Vor der Herstellung der Kollagenmischung, Färbung und Vorbereitung der Zellen zum Abbilden gemß Standardprotokollen 28. </li><li> Verwendung von Standard-Labortechniken und Protokolle 29,30, in einem bio-Haube, mischen Zellmedien und chemische Lockstoffe in einer 15 ml Tube, um die gewünschte Konzentration chemoattractant. Pipette 5 ml spezifischer Zellmedien chemoattractant Konzentration Lösung in einen 15-ml-Röhrchen und bewegen Sie die Lösung in ein beheiztes Wasserbad. </li><li> Mit einer Pipette extrahieren 5 ml nur Zellmedium in einen zweiten 15-ml-Tube und in ein erhitztes Wasserbad zum Aufheizen der Lösung für die Mikroskopie Experimente. </li><li> In einem bio-Haube, Pipette 30 ul 10x Phosphatpuffered Lösung (PBS) in Mikrozentrifugenröhrchen. In 6 ul 1 N Natriumhydroxid (NaOH) in derselben Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex für 15 Sekunden. </li><li> Zu erhalten Kollagen I Rattenschwanz-Lösung aus dem Kühlschrank und zu bewegen, um die bio-Haube mit Standard-Labortechniken und Protokolle 29. Stellen Sie sicher, das Kollagen noch kalt ist. Pipettieren 168,3 ul Kollagen in derselben Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Als Nächstes fügen Sie 18 ul der gelb-grün fluoreszierende Carboxylat-modifizierte Mikrosphären mit einer Pipette auf die gleiche Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbel das Mikrozentrifugenröhrchen mit allen Lösungen für 30 sec. </li><li> In 77,7 ul der gewünschten Zellmedien-Zellgemisch (ca. 2 x 10 6 Zellen / ml-Konzentration) in Mikrozentrifugenröhrchen und mischen mit Pipettenspitze 20 Sek. Wie nötig, ändern Sie die Matrixdichte, indem Sie die benutzerdefinierte Collagen Mischung für den Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen und die Lebensfähigkeit der Zellen Tabelle (Tabelle 1) angepasst. </li><li> Pipette 300 &amp; #181; l von Kollagen-Zellen-Mischung in der Mitte gut (gut # 2) des hergestellten Formanordnung. Legen Sie die Form auf einem Einweg-Petrischale und verschieben Sie sie in ein Standard-Inkubator für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Entfernen System von Inkubator und legen wieder in bio-Haube. Mit einer Pinzette, entfernen Sie die beiden hydrophoben Deckgläser durch Klemmen auf der Oberseite jedes Deckglas und Ziehen nach oben und weg von der Form. </li><li> Bewegen des gesamten Systems auf die gewünschte Mikroskopie und Bild sicherzustellen Kollagen Kokillenseiten noch direkt auf eine planare Diffusionsgradienten ermöglichen. </li><li> Mit dem System immer noch unter dem Mikroskop, mit einem 100 &amp; mgr; Einkanalpipette, fügen Sie 100 ul der Zellmedien in gut # 1. Dann wurde unter Verwendung eines 100 &amp; mgr; Einkanalpipette fügen 100 ul Zellmedium mit den gewünschten chemoattractant Konzentration in gut # 3. </li><li> Unmittelbar nach der Zugabe von Lösungen in beiden Brunnen, beginnen Bildgebung. </li></ol> 4. Imaging und DiffusionModellieren <ol><li> Wenn man die Diffusionskoeffizienten für die spezifische Kollagendichte, die spezifische Konzentration berechnen finden will, folgen Sie der unten Protokoll: <ol><li> Folgen Sie der oben angegebenen Protokoll mit dem Titel &quot;Collagen Mixture und 3D-Matrix&quot;, anstatt Erzeugung Zellmedium mit den gewünschten chemoattractant Konzentration, machen 5 uM Rhodamin in einer 15-ml-Röhrchen mit Standard-Berechnungen und Protokolle 30. </li><li> Bild der 3D-Kollagen-Matrices mit einem konfokalen System auf einem inversen Mikroskop unter Verwendung eines Argon-Laser (488 nm), um die Fluoreszenz zu erfassen montiert. Bild alle 2 oder 3 sec für bis zu 7 Std. </li></ol></li><li> Für Diffusion Modeling: Mit Hilfe der unten mathematisches Modell, einen Rechensoftwarecode für die Verarbeitung und Analyse mit diesen allgemeinen Schritten. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Import von Bildern in Computersoftware für Skalierung und Normalisierung durch die maximale intensity. Konvertieren von Bildern in einer grauen Farbe-Karte des Bildes, um die Kante zu wählen. Pick eine Achse entlang der Mitte des Bildes, auf der rechten Seite der Mitte und links von der Mitte. </li><li> Verwendung der Rechensoftware Code plotten die normalisierte Intensität zusammen mit der wahre Intensität und der Unterschied zwischen den beiden. </li><li> Danach geben die Parameter für die Montage (Konzentration, Zeit und Länge) notwendig. </li><li> Plotten der normierten Konzentration gegen die Zeit und das Konzentrationsprofil in der x-Achse mit einem Polynom-Anpassung an die Daten. </li><li> Berechnen der Diffusionskoeffizient mit Hilfe der Rechensoftwarecode. </li></ol></li></ol> 5. Experimentelle Messungen <ol><li> Rückbezug auf die Diffusionsgleichung, schreiben die Gleichung, um die spezifische Konzentration an jedem Ort innerhalb des Systems zu finden, wie in unten gezeigt. <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Wo: L = Länge der the Kollagenmatrix x = Lage in Untersuchung D = Diffusionskoeffizient t = verstrichene Zeit, </li><li> Während Chemo Experimenten sicherzustellen, um die spezifische Zeit, die das Moment Chemokin wurde System hinzugefügt aufzuzeichnen. Sobald die Zellmigration Bewegung gefunden wird, um sicherzustellen, konfokale Zeitrafferaufnahme aufzeichnen, und beachten Sie den genauen Zeitpunkt und Ort vom Rand, wo Bildgebung aufgetreten. </li><li> Bei der Datenanalyse, schließen die erwähnte abgelaufene Zeit, Standort und der Diffusionskoeffizient für die spezifische Zelle, in der Gleichung auf die normierte spezifische Konzentration an jedem Punkt innerhalb der Kollagen sowohl Diffusion und Zellexperimenten gefunden. </li></ol> 6. Tracking-Zellmigration Verwendung TFM <ol><li> Zu verfolgen, die Zellmigration mit TFM / DVC-Techniken folgen dem Protokoll im Handumdrehen: <ol><li> Nach Zugabe der gewünschten Konzentration chemoattractant in Vertiefung 3, Start Abbilden der 3D-Kollagen-Matrices mit einem konfokalen System auf einem invertierten MICR montiertenOscope zu finden, um eine Zelle zu untersuchen. </li><li> Sobald eine Bewegung Zelle gefunden wird, setzen Sie die Zelle, in der Mitte des Sichtfeld und nutzen eine piezoelektrische Motor (für Bild in der z-Achse), Bild alle 1 oder 2 min. </li><li> Für die Berechnung Zellkrafterzeugung und Verformung, erzeugen eine Rechencode, um die Verschiebungen der Fluoreszenz Perlen nach den TFM / DVC-Protokolle 31 zu finden. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Diffusionsexperimente mit oder ohne Zellen sind: richtig Einrichten der Formanordnung; Entwicklung der notwendigen Fingerfertigkeit, um bei der Extraktion von hydrophoben Deckschäden zu vermeiden; gewährleisten eine sehr gute lineare Startlinie, um den Diffusionskoeffizienten korrekt berechnen zu finden; korrigieren experimentelle Berechnungen von sowohl Kollagen und chemische Lockstoffe; von Live Cell Imaging System, um sicherzustellen, Matrix trocknet nicht aus richtig zu...

Die bevorzugte Bewegung von Zellen in Richtung eines Konzentrationsgefälles Chemotaxis bekannt, spielt eine wichtige Rolle bei pathologischen und physiologischen Prozessen im Körper. Solche Beispiele sind Haut- und Schleimhaut Wundheilung 1, 2 Morphogenese, Entzündungen 3, und das Tumorwachstum 4,5. Es wurde auch gezeigt, daß Krebszellen durch beide individuelle und kollektive Zellmigrationsstrategien 6 migrieren. Darüber hinaus können Diffusionsinstabilität Mechanismen die Trennung von einzelnen oder gruppierten Zellen aus einer Tumor Körper / Objekt zu induzieren und dann kann auf eine Quelle von Nährstoffen einzuwandern und so dringen größere Gebiete und Gewebe 7. Ferner hat es sich gezeigt, dass die vielfältigen Migrationsmechanismen aktiv in 2D und 3D werden, wegen der unterschiedlichen Rollen von Adhäsionsmolekülen 8. Daher ist ein Umzug in physiologisch relevanten in-vitro-Tests an Zellbeweglichkeit in einem measureabl untersuchene und einfache Weise von Bedeutung für das Verständnis Zellbewegung Phänomene 9. Leider ist die Schwierigkeit bei der Analyse von Zellmigration, eine umfassende quantifizierbare Chemotaxis-Assay erfordert in der Regel eine lange mühsame Methode, auf der Messung der unparteiische Zellbeweglichkeit und Transportphänomene Modelle gegründet. Vergangenen experimentellen Ansätzen, um die Zellchemotaxis zu untersuchen sind der Boyden-Kammer 10 und der unter Agarose-Assay 11. Doch innerhalb dieser frühen Tests, die Zellmigration Experimente nicht die Bewegung in Bezug auf die Zeit zu überwachen. Weitere, besonders wichtig, die Konzentrationsgradienten für die Experimente verwendet wurden, nicht gut definiert oder vollständig verstanden, während nur die Erhaltung der Signalisierung für nicht mehr als ein paar Stunden. Weiterhin frühen Chemokammer Versuche beschränkt Zellmigration auf zwei Dimensionen und nicht erlauben, die Kinetik der Migration 12 überwachen. Mit Blick auf die Boyden-Kammer, ein Endpunkt-Assaywürde nicht zulassen, dass der Forscher, um die Migration visuell zu beobachten und nicht direkt zu unterscheiden Chemotaxis (Bewegungsrichtung) von Chemokinese (Zufallsbewegung). Darüber hinaus mehrere Variablen-Unterschiede in der Porengröße und Dicke der Membranen verursachten die Kammer sehr schwierig, einfach zu reproduzieren und verdeckte die Wander Reaktion von Zellen auf Chemokine 13,14. Mit dem neuen Verständnis der Mikrofluidik, haben neue Kammern und Mikrogeräten als Instrument untersucht worden, um Zellbewegung unter Zwischenströmungsbedingungen zu untersuchen oder Chemotaxis 15,16. Unter diesen neuen Geräten wurden neue Zell Metriken eingeführt und untersucht, wie die Wirkung von Scherspannung auf eine Zelle 17,18. Leider vergangenen und aktuellen mikrofluidischen Chemotaxiskammern begrenzt Untersuchungen von Zellmigration, um 2D-Substrate eine wichtige Rückschlag seit vielen biologischen Prozessen wie Tumorzellinvasion und Metastasierung, und imImmunzellmigration, beinhalten 3D-Migration. Direkte Beobachtung Kammern, wo-a chemoattractant Lösung in Kontakt mit einer 3D-Gel enthaltenden Zellen wurden ebenfalls berichtet 19,20. Diese Kammern haben zwei Kammern, von denen eine Lockstoff und eine mit Zellen, die nebeneinander horizontal 21 oder als konzentrische Ringe 22 verbunden sind. Diese Systeme werden in die richtige Richtung, aber nicht über ein Chemotaxis-System zu halten für eine ausgedehnte Zeitperiode. Darüber hinaus haben Forscher auch durch Kollagenmembranen in Dialysezellen sowie die Diffusion von Tracermolekülen durch Kollagenproben gegen hydrostatischen Druck unterworfen 23-25 ​​geprüft Leitfähigkeit. Einige Diffusionsexperimente in Kollagengelen beruhen auf physikalischen und chemischen Modifikationen des Gels mit Magnetfeldern und chemischer Einbau 26. Eine beliebte Methode zur Modellierung von Diffusionsvermögen in collaGenous Gewebe beruht auf der Fluoreszenzabbildung der kontinuierlichen Punkt Photobleichen. Dieses Verfahren wurde Anisotropie der Diffusionskoeffizienten von Makromolekülen in orientierten Kollagengewebe offenbart. Dennoch hat Photobleichens im Gelenkknorpel benutzt und nicht-Kollagen-Matrices. Zwar ähnlich, müssen die erforderlichen Modellversuche durch speziell Verständnis der Diffusionskoeffizient von Kollagengelen erfolgen. Noch wichtiger ist, die Systeme nicht ein Verfahren zur Messung Zellkrafterzeugung nutzen. Leider sind die meisten Systeme scheinen auf ein oder zwei Schlüsselelemente für ein ideales System fehlen: das ermöglicht der Zelle Tracking, einem Diffusionsgefälle Verständnis mit einem chemotaktischen Faktor durch die Matrix, einem relativ einfachen Aufbau mit einer Leichtigkeit der Reproduzierbarkeit, der Minimierung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, sowie die Fähigkeit, Dimensionseinheiten zur Quantifizierung (dh, die Geschwindigkeit, Kraft, spezifische Konzentrations) zu messen. Moghe et al. </em&gt; 27 ein System vorgeschlagen, das weitgehend die Anforderungen in der Zellen wurden zunächst im ganzen Gel dispergiert anstatt auf der Filteroberfläche konzentriert erfüllt, ist aber schwierig zu Kräften, die die Zelle erzeugt messen. Zu diesem Zweck stellen wir eine planare Gradienten-Diffusionssystem zur Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix, die eine moderne Diffusionskammer Beschränkungen vorhandener Assays, die auf Zeitraffermikroskopie beruht, in Verbindung mit Bildanalysetechniken zu Zelle messen zu überwinden ermöglicht untersuchen Kräfte in einer 3D-Umgebung. Dieses Protokoll sieht eine einfache, aber innovative Art der Erstellung einer einfachen 3D-Diffusionskammer, die verwendet werden können, um 3D-Chemotaxis in verschiedenen Zellen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Silikonelastomer-Kit</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>eine zweiteilige Misture mit einer 10:1-Mischung Live-Cell-Imaging-Kammer</td></tr><tr><td>Live-Cell-Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td></td><td>CMB für 18&nbsp; mm runde Deckgläser</td></tr><tr><td>22&nbsp; mm Glasdeckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. Deckglas 22&nbsp; mm 1,5</td></tr><tr><td>Maschinell bearbeiteter Aluminium-Metallwürfel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hobby-Allzweckmesser</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(Aminopropyl)-Trimethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Glutaraldehyd, EM-Qualität, 8%</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Standardboden Modell- und Tischzentrifugen</td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Wiederverwendbare Petrischale: Komplett (60 x 15&nbsp; mm)</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Fine Point Pinzette</td></tr><tr><td>Deckbrille</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Rechteck; 30 x 22&nbsp; Mm; Dicke Nr. 1</td></tr><tr><td>Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Essigsäure ACS Reagenz, &ge; 99,7%</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>wasserfrei, 95%</td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Hochpräzises Diamantritzwerkzeug</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Gerader Ritzer mit verlängerter Spitze, .020" (.50&nbsp; mm) Durchmesser um .200" (5,0&nbsp; mm) Spitzenlänge</td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>Hochvakuumfett</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml konische Zentrifugenröhrchen mit hydrophobe, biologisch inerter Oberfläche</td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1,37 M Natriumchlorid, 0,027 M Kaliumchlorid und 0,119 M Phosphatpuffer</td></tr><tr><td>1&nbsp; N Natronlauge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Natronlauge Konzentrat</td></tr><tr><td>Kollagen I, Rattenschwanz</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Rattenschwanz&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Volumen: 2,0 ml; AD x L: 13&nbsp; x&nbsp; 40&nbsp; Mm; steril; single-wrapped</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Carboxylat-modifizierte Mikrosphären</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; F-8813</td><td>Carboxylat-modifizierte Mikrosphären, 0,5 & Mikro; m, gelb-grün fluoreszierend (505/515), 2% Feststoffe</td></tr><tr><td>Rhodamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamin B für Fluoreszenz</td></tr></tbody></table>

planar gradient diffusionssystem, um chemotaxis in einem 3d-kollagen-matrix untersuchen

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Die Bedeutung der Zellmigration kann durch die Entwicklung des menschlichen Lebens gesehen werden. Wenn Zellen wandern, erzeugen sie Kräfte und übertragen diese Kräfte auf ihre Umgebung, was zu Zellbewegungen und -wanderungen führt. Um die Mechanismen zu verstehen, die die Zellmigration verändern und/oder beeinflussen können, kann man diese Kräfte untersuchen. Theoretisch verspricht das Verständnis der grundlegenden Mechanismen und Kräfte, die der Zellmigration zugrunde liegen, effektive Ansätze zur Behandlung von Krankheiten und zur Förderung der Zelltransplantation. Leider sind moderne Chemotaxiskammern, die entwickelt wurden, in der Regel auf zwei Dimensionen (2D) beschränkt und weisen komplexe Diffusionsgradienten auf, die die Interpretation des Experiments erschweren. Zu diesem Zweck haben wir eine Direct-Viewing-Kammer für Chemotaxis-Studien entwickelt und beschreiben diese in dieser Arbeit, die es ermöglicht, moderne Chemotaxiskammer-Hindernisse zu überwinden, die in der Lage sind, Zellkräfte und spezifische Konzentration innerhalb der Kammer in einer 3D-Umgebung zu messen, um die 3D-Migration von Zellen zu untersuchen. Noch überzeugender ist, dass dieser Ansatz es ermöglicht, die Diffusion durch 3D-Kollagenmatrizen erfolgreich zu modellieren und den Diffusionskoeffizienten eines Chemoattraktors durch mehrere verschiedene Kollagenkonzentrationen zu berechnen, während das System für die Traktionskraftmikroskopie (TFM) und die Analyse der digitalen Volumenkorrelation (DVC) einfach und benutzerfreundlich bleibt.

Die Fähigkeit des Assays, genau zu beurteilen die Migration der Zellen beruht auf einem guten Aufbau des Systems. Daher ist es wichtig für Sie sicher, dass die Diffusion System Form genau entwerfen und große Sorgfalt bei der Platzierung sowohl hydrophobe und hydrophile Deckgläsern, wie in Abbildung 1 veranschaulicht. Wenn das System ordnungsgemäß entworfen und während des Diffusionsmodellierungsstufe gewährleistet eine sehr finden gute lineare Startlinie, ist man in der Lage schön zu erreichen fluoreszi...

Zellmigration ist ein wichtiger Teil der menschlichen Entwicklung und des Lebens. Um die Mechanismen zu verstehen, die die Zellmigration verändern können, stellen wir ein planares Gradientendiffusionssystem zur Untersuchung der Chemotaxis in einer 3D-Kollagenmatrix vor, das es ermöglicht, die Einschränkungen moderner Diffusionskammern bestehender Assays zu überwinden.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine ebene Gradientendiffusionskammer zur Untersuchung von Chemotaxis in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst mit Hilfe einer Live-Cell-Imaging-Kammer eine dreidimensionale Silikonform hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, hydrophile und hydrophobe Deckgläser herzustellen und diese zur Montage der dreidimensionalen Silikonform zu verwenden.Anschließend wird die Kollagen-Zell-Mischung in das mittlere Kompartiment gegeben und polymerisieren gelassen. Im letzten Schritt werden nach der Inkubation die hydrophoben Deckgläser aus der Form entfernt und in ein Reservoir gewöhnliches Medium sowie in das andere Reservoir Medium mit Chemoattraktans hinzugefügt. Abschließend wird mittels konfokaler Mikroskopie die Chemotaxis der Zellen über die Zeit verfolgt und die Bewegungsverschiebung der Zellen innerhalb der Kollagenmatrix visualisiert.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Boin-Kammer und der Mikroathletik liegt darin, dass sie eine einfache Versuchsanordnung zur Untersuchung der Migration im dreidimensionalen Raum mit einem einfachen Diffusionsgradienten ermöglicht, ohne eine Einwegpipette zu verwenden. Messen Sie 150 µL der Aminoseline A-P-T-M-S ab und geben Sie sie in ein 50-mL-Gefäß. Geben Sie anschließend 30 mL 100%igen Ethanol mit einer zweiten Einwegpipette hinzu und verschließen Sie den Deckel.Schwenken Sie die Lösung zwei Minuten lang, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Gießen Sie die Lösung danach in eine Glas-Petri-Schale und stellen Sie sie beiseite. Gießen Sie anschließend 15 Milliliter 100%igen Ethylalkohol in eine zweite Petri-Schale und stellen Sie diese mit einer neuen Einwegpipette zu der ersten Schale. Messen Sie 30 Milliliter entionisiertes Wasser ab und gießen Sie die Lösung in ein 50-Milliliter-Gefäß. Verwenden Sie anschließend eine neue Einwegpipette, um 1,875 Milliliter Glutaraldehyd zum Gefäß hinzuzufügen, und schließen Sie den Deckel. Vortexen Sie die Lösung zwei Minuten lang und gießen Sie danach das Gemisch in eine dritte Petrischale.Mit einer Pinzette eine 22 mm runde Glasdeckfolie entnehmen und beide Seiten mit einer 100 % Ethanol-Lösung spülen. Mit einer Einwegpipette die gespülte Glasdeckfolie in die erste Schale geben, die Aminosilin enthält, und mit Hilfe der Pinzette fünf Minuten in der Lösung belassen. Die Glasdeckfolie herausnehmen und erneut mit 100 % Ethanol spülen.Legen Sie dann den gespülten Glasdeckel in die Schale mit Glutaraldehyd und stellen Sie sie 30 Minuten beiseite. Nach 30 Minuten entfernen Sie den Glasdeckel mit einer Pinzette und spülen ihn mit entionisiertem Wasser ab. Legen Sie den gespülten Deckel zur Übernacht-Trocknung bei Raumtemperatur auf ein Tuch.Zur Herstellung hydrophober Deckgläser zunächst 500 µL TTS, 100 µL Essigsäure und 19,4 mL Hean in einer 50-mL-Tube geben und zwei Minuten lang vermischt. Anschließend die Lösung in eine Glas-Petrischale gießen und mit sauberen Pinzetten ein Deckglas in die vorbereitete Lösung geben und zwei Minuten lang darin belassen. Nach zwei Minuten das Deckglas mit der Pinzette herausnehmen und mit deionisiertem Wasser mithilfe einer Einwegpipette abspülen, das Deckglas auf ein Tuch legen und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen.Bewahren Sie die getrockneten Deckgläser in einer Plastik-Petri-Schale auf, bis sie benötigt werden. Bauen Sie als nächstes die Live-Cell-Imaging-Kammer gemäß der beigefügten Textanleitung zusammen. Mischen Sie anschließend die Silikon-Elastomer-Lösungen gemäß den Herstelleranweisungen, um fünf Milliliter Elastomer herzustellen. Gießen Sie dann mit einem Einweg-Laborspatel langsam die Silikon-Elastomer-Lösung in den Aufbau der Live-Cell-Imaging-Kammer, um die Formbestandteile nicht zu stören.Stellen Sie die Form an einem sicheren Ort beiseite, um bei Raumtemperatur über Nacht zu lagern. Am nächsten Morgen nehmen Sie die Form mit einer Pinzette heraus und entnehmen vorsichtig den bearbeiteten Aluminiumwürfel aus der Form. Gehen Sie danach zum Waschbecken und spülen die Form mit entionisiertem Wasser ab. Anschließend legen Sie die Form zum Trocknen auf ein Papiertuch.Nach dem Trocknen mit einem Bastelmesser Schlitze im Abstand von 2,34 Millimetern an jedem Längsende innerhalb der Silikonform schneiden. Sicherstellen, dass die Form bis zur Verwendung für das Experiment an einem sicheren und trockenen Ort aufbewahrt wird. Die Form mit 90 % Ethanol spülen und anschließend in eine Petrischale mit entionisiertem Wasser geben und über Nacht stehen lassen.Am nächsten Morgen die Form auf ein Papiertuch übertragen und trocknen lassen, während die Form trocknet. Mit einem hochpräzisen Diamantschreibgerät das Quadrat und hydrophile Deckgläser in zwei Rechtecke schneiden, die leicht größer als 3,95 Millimeter mal 5,99 Millimeter sind.Als Nächstes schieben Sie jeden der ausgeschnittenen rechteckigen Deckgläser in die Schlitze des Silikonformkörpers, drehen die Form um und tragen mit einer Einwegpipette Vakuumfett entlang der Unterseite des Silikonformkörpers auf. Danach drehen Sie die Form wieder in die ursprüngliche Position zurück und drücken die Unterseite der Form auf das runde hydrophile Glasdeckglas. Um eine Abdichtung zu erzielen, bereiten Sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen eine Mischung aus Medium und Chemoattraktant in der gewünschten Konzentration vor, pipettieren fünf Milliliter der Mischung in ein neues Milliliter-Röhrchen und fünf Milliliter reines Medium in ein zweites Röhrchen.Stellen Sie beide Röhrchen in ein Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius erhitzt ist. Danach pipettieren Sie 30 Mikroliter 10× PBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie sechs Mikroliter einer einnormalen Natriumhydroxidlösung zu demselben Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und wirbeln Sie 15 Sekunden lang im Vortex. Fügen Sie dann 18 µL gelb-grüner fluoreszierender Carboxylat-mikroverkapselter Sphären in ein Mikrozentrifugenröhrchen und 168,3 µL eiskaltes Typ-I-Ratten-Schwanzkollagen hinzu. Vortexen Sie die Mischung 30 Sekunden lang.Als Nächstes 77,7 Mikroliter der gewünschten Zellen mit einer Konzentration von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in Medium in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und mischen. Mit einer Pipettenspitze 300 Mikroliter der Kollagen-Zell-Mischung für 20 Sekunden in die mittlere Vertiefung der vorbereiteten Formengarnitur pipettieren.Danach die Form auf eine Einweg-Petrischale stellen und für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einen Standardinkubator bringen. Nach der Inkubationszeit beide hydrophoben Deckgläser mit einer Pinzette entfernen, indem man die Spitze jedes Deckglases greift und dann nach oben und weg von der Form zieht. Das gesamte System unter das Mikroskop bringen und die Kammer untersuchen, um sicherzustellen, dass die Seiten der Kollagenform weiterhin gerade sind, was einen planaren Diffusionsgradienten ermöglicht, während das System noch unter dem Mikroskop steht. 100 Mikroliter Zellmedium in das erste Brunnenloch geben.Fügen Sie als Nächstes 100 µL Zellmedium mit der gewünschten Konzentration des Chemotaktikums in die Vertiefung auf der gegenüberliegenden Seite der Matrix hinzu. Verfolgen Sie die Zellmigration relativ zu den fluoreszenzmarkierten Mikrokügelchen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Die hier dargestellte Bildserie zeigt die Diffusion von Rumine, die sich durch ein Kollagen-Gel mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter bewegt.Dieses Beispiel zeigt den tatsächlichen planaren Diffusionsgradienten des Systems, der auch bei allen eingeführten Chemoattraktanten zu erwarten ist. In dem hier dargestellten Beispiel wurde die Intensität des Lumineszenzsignals im Zeitverlauf an den durch die roten Quadrate markierten Positionen gemessen. Die Konzentration an jeder dieser Positionen ist in diesem Diagramm als separate Linie dargestellt, die im stationären Zustand einen linearen Konzentrationsgradienten in Abhängigkeit von der Position im Gel ergibt.Diese Beziehung bleibt über einen Bereich von Kollagenmatrix-Konzentrationen linear, wodurch dieses System für Zellexperimente sehr nützlich ist. In diesem Bild ist ein neutrophiles Granulozyt, rot gefärbt, innerhalb einer Kollagenmatrix zu sehen, die mit fluoreszierenden grünen Mikrokügelchen durchsetzt ist, die als Positionsreferenzen dienen. Die nächsten drei Bilder zeigen die gerichtete Migration des neutrophilen Granulozyten, während er entlang eines Chemotaktischen Gradienten wandert, der durch den weißen Pfeil dargestellt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man eine einfache Diffusionskammer zur Untersuchung der Zellmigration in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix erstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Die Zellmigration ist ein biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen beteiligt ist, wie der Wundheilung und Immunreaktionen und pathophysiologischen Prozessen, wie Krebs. Die 3D-Kollagen-Matrix Migrationstest ist ein vielseitiges Werkzeug, um die Migrationseigenschaften der verschiedenen Zelltypen innerhalb in einer 3D-physiologischen Umgebung wie zu analysieren.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix stark beeinflussen 3D Migration von Zellen. In vitro-Verfahren, um die Raumzeit-Zellmigrationsverhalten in biophysikalisch variable Umgebungen sowohl Bevölkerung und einzelnen Zellebenen zu studieren, wird beschrieben.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Visual-Chemotaxis-Assays sind für ein besseres Verständnis, wie eukaryotische Zellen steuern chemoattractant vermittelten Richtungszellmigration. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden für: 1) in Echtzeit, hochauflösende Überwachung mehrerer Chemotaxis-Assays und 2) gleichzeitig die chemische Lockstoffe Gradienten zu visualisieren und die räumlich-zeitliche Dynamik der Ereignisse in Neutrophilen wie HL60-Zellen signalisiert.

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Hier bieten wir eine Methode zur Analyse des Verhaltens wachsender Axone in 3D-Matrizen, die ihre natürliche Entwicklung imitieren.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Hier beschreiben wir Methoden mit Zeitraffer-Phasen-Kontrast-Mikroskopie, um peritoneale Makrophagen in einem chemotaktischen Komplement C5a-Gradienten zu beleben. Die Protokolle können auf andere Immunzellen ausgedehnt werden.

Zeitraffer-Bildgebung von Mausmakrophage Chemotaxis

Lernen Sie die Herstellung einer planaren Gradienten-Diffusionskammer zur Untersuchung von Chemotaxis in einer 3D-Kollagenmatrix. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Zellmigration mittels konfokaler Mikroskopie.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

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