Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein vereinfachtes System zur Analyse der Zell-Durex bereitzustellen, durch das viele Säugetierzellen bevorzugt in Richtung eines steiferen Substrats wandern. Dies wird erreicht, indem zunächst Polymethylsiloxan oder PDMS-Substrate definierter Steifigkeit hergestellt werden. Anschließend wird das vorbereitete PDMS in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte gegossen und eventuelle Luftblasen entfernt.

Die Durex-Kammern werden anschließend vervollständigt, indem ein sterilisierter Deckgläser auf die PDMS-Oberfläche in jedem Brunnen platziert wird, um eine Überlagerung zu erzeugen. Im letzten Schritt werden Zellen in die Duro-Taxes-Kammern mit einer Dichte ausgesät, die den Zellen ausreichend Platz zum Migrieren bietet, ohne dass nennenswerte Wechselwirkungen mit anderen Zellen auftreten. Schließlich wird die Achse in migrierenden Zellen mittels Live-Cell-Mikroskopie untersucht.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Polyacrylamid besteht darin, dass zwischen dem weichen PDMS und dem starren Glas nur ein einzelner Schritt erforderlich ist, im Gegensatz zu Gradienten-Gel-Alternativen. Außerdem ist zum Beschichten von PDMS mit extrazellulären Matrixbestandteilen wie Fibronectin keine chemische Vernetzung notwendig, die bei Polyacrylamid-Gelen erforderlich ist. Um eine sechs-Well-Zellkulturplatte vorzubereiten, reißen Sie zunächst das Gewicht mit einem 50-Milliliter-Konischgefäß ab.

Wiegen Sie etwa 10 Gramm der Poly-Dimethyl-Suboxan- oder PDMS-Grundlösung in dem 50-Milliliter-Röhrchen ab. Bei einem Verhältnis von 90 zu 1 teilen Sie das gemessene Gewicht der PDMS-Grundlösung durch 90. Um die korrekte Menge an Vernetzerlösung zu bestimmen, geben Sie die berechnete Menge an PDMS-Vernetzerlösung hinzu und mischen die A-P-D-M-S-Grundlösung und den Vernetzer gründlich fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Mit einem kleinen Spatel enthält die Mischung in diesem Stadium eine geringe Anzahl von Luftblasen. Zentrifugieren Sie das PDMS-Substrat fünf Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 50 ×g. G. Fügen Sie Raumtemperatur hinzu, um die Blasen zu entfernen, falls noch Blasen vorhanden sind.

Nach den fünf Minuten erneut zentrifugieren und ein Milliliter des 90 zu 1 PDMS-Substrats in jede Vertiefung der mit Gewebekultur behandelten 6-Loch-Platte pipettieren. Verbleibende Luftblasen im PDMS können in diesem Schritt durch Vorspießen mit einer 21-Gauge-Nadel entfernt werden.

Lassen Sie das PDMS 30 Minuten lang in der Vertiefung ausbreiten. Kochen Sie anschließend 12 Millimeter große Deckgläser der Klasse eins drei Mal insgesamt je fünf Minuten lang in destilliertem Wasser. Legen Sie ein getrocknetes Deckglas vorsichtig an einer Seite anfassend in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte.

Geben Sie die Deckglas in die PDMS-Lösung und lassen Sie dann das Deckglas auf das PDMS fallen. Während sich das Deckglas setzt, beginnt das PDMS, über die Ränder des Deckglases vorzudringen, deckt es jedoch nicht vollständig ab. Dies erzeugt nach der Aushärtung eine Grenzfläche zwischen PDMS und Glas.

Die Platte 16 Stunden lang bei 70 Grad Celsius in einem Ofen inkubieren, um das PDMS auszuhärten. Abschließend die Platte in eine Zellkulturhaube stellen und 10 Minuten lang mit UV-Licht sterilisieren. Jede Durox-Kammer mit einem Milliliter Fibronectin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium für eine Stunde bei 30 Grad Celsius beschichten.

Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche in der Fibronectin-haltigen PBS-Lösung eingetaucht ist. Bereiten Sie hitzedenaturiertes 1 % Rinderserumalbumin (BSA) vor, indem Sie 0,5 Gramm BSA abwiegen und in 50 Milliliter gefiltertem PBS lösen. Sterilisieren Sie die Lösung durch ein 0,22-Mikrometer-Filter, bevor Sie sie 12 Minuten lang bei 80 Grad Celsius erhitzen.

Als Nächstes die Fibronectin-Lösung abpipettieren und die Kammer dreimal mit PBS waschen. Fügen Sie je einen Milliliter hitzedenaturiertes BSA in PBS zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie die Augen mit Trypsin behandeln und die gewünschten Zellen zählen, während die Durex-Kammern mit der Hitze blockiert werden. Pipettieren Sie die hitzedenaturierte BSA-Lösung kurz vor dem Ansäen der Zellen aus den Kammern ab.

Plattieren Sie 10.000 Zellen in einem Volumen von zwei Millilitern in jede Vertiefung der Doax-Kammer. Unter Verwendung des für den jeweiligen Zelltyp erforderlichen Mediums lassen Sie die Zellen vier Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 an der Unterlage anhaften und sich ausbreiten. Führen Sie die Live-Cell-Bildgebung an einem umgekehrten Mikroskop mit Phasenkontrast und einem 10×-Objektiv durch. Das Mikroskop sollte mit einer geschlossenen, befeuchteten Umweltkammer ausgestattet sein, die während der Langzeitbildgebung die Kontrolle der Temperatur bei 37 Grad Celsius und von 5 % CO2 ermöglicht.

Bildgebung, nachdem sich die Zellen etwa 3,5 Stunden ausgebreitet haben, die Platte in der Mikroskopkammer zusammenbauen. Die Proben 30 Minuten lang in der Kammer äquilibrieren lassen. Automatisierte Mehrpunkt-Aufnahmen am Mikroskop einrichten, falls verfügbar.

Konzentrieren Sie sich auf die Grenzfläche zwischen PDMS und der Glasdeckfolie und wählen Sie Punkte aus, um die gesamte Grenzfläche abzubilden. Bei durchschnittlich 40 Punkten pro Durex-Kammer-Bildgebung der Zellen alle 10 Minuten über einen Zeitraum von bis zu 16 Stunden erscheint der interessierende Bereich als zwei Linien, wobei die äußere Linie dem Rand der Deckfolie und die innere Linie der tatsächlichen Grenzfläche zwischen PDMS und der Glasdeckfolie entspricht. Zur Datenanalyse erstellen Sie eine Tabellenkalkulation wie in der Textanleitung gezeigt.

Zählen Sie die Anzahl der Übertrittsereignisse vom PDMS zur Glasoberfläche und umgekehrt für jeden erzeugten Film. Ein Übertrittsereignis ist definiert als das Passieren des Zellkerns über die Grenzfläche zwischen PDMS und Glas in beide Richtungen. Tragen Sie die Anzahl der Übertrittsereignisse in die entsprechende Spalte der Excel-Tabelle ein, um mehrfache Übertritte zu quantifizieren.

Zählen Sie, wie oft die Zelle die Grenzfläche überquert hat. Diese Zahl sollte in die Excel-Spalte eingetragen werden, die dem Substrat entspricht, auf dem sich die Zelle am Ende des Films befand. Wiederholen Sie die Analyse für jede Zelle, die im Film die Grenzfläche überquert.

Schließen Sie Zellen aus, die während der Bildgebung aus dem Sichtfeld wandern. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die von PDMS auf die Glasoberfläche gewandert sind und somit Duro Texas durchlaufen haben. Gehen Sie dazu wie folgt vor.

Addieren Sie die Anzahl der Übergangsereignisse von weich zu hart und der mehrfachen Übergangsereignisse, die auf hart endeten, und teilen Sie durch die Gesamtanzahl der Übergangsereignisse. Berechnen Sie den Prozentsatz mehrfacher Übergänge, indem Sie die Gesamtanzahl mehrfacher Übergänge durch die Gesamtanzahl aller Übergänge dividieren, um beginnend die molekulare Mechanismen zu verstehen, durch die Zellen auf mechanische Reize in ihrer Umgebung reagieren. Bestimmte Proteine können mithilfe von IRNA, wie hier gezeigt, herunterreguliert werden.

Etwa 70 % der Kontroll-irna-behandelten Zellen wiesen Axxis auf. Im auffallenden Gegensatz dazu zeigten die Zellen, bei denen CD gap mittels RNAi herunterreguliert wurde, keine Präferenz dafür, ob sie auf das harte oder weiche Substrat wanderten. Darüber hinaus überquerten die CD gap-Herunterregulierungs-Zellen die Grenze mehrfach.

Während Kontrollzellen, die mit irna behandelt wurden, im Allgemeinen nur einmal die Grenze überqueren, zeigen repräsentative Spuren von Kontroll-irna-Zellen, dass diese Zellen typischerweise einmal über die Grenze wandern und bevorzugt auf der steiferen Oberfläche verbleiben, verglichen mit CD-gap-irna-behandelten Zellen, die keine Präferenz für eine der beiden Steifigkeiten zeigten und die Grenze mehrfach überquerten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die PDMS-Substrate vorbereitet, die Duris-Kammern zusammenbaut und DUR-Taxes quantifiziert.