Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis In-vitro-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein vereinfachtes System für die Analyse von Zelldurex bereitzustellen, durch das viele Säugetierzellen bevorzugt zu einem steiferen Substrat wandern. Dies wird erreicht, indem zunächst Polymethylsuboxan- oder PDMS-Substrate mit definierter Steifigkeit hergestellt werden. Als nächstes wird das vorbereitete PDMS in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte gegossen und alle Luftblasen werden entfernt.

Die Durex-Kammern werden dann durch das Platzieren eines sterilisierten Deckglases auf dem PDMS in jeder Vertiefung vervollständigt, um eine Überlagerung zu erzeugen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in die Duro-Steuerkammern mit einer Dichte zu säen, die den Zellen genügend Raum gibt, um ohne signifikante Wechselwirkungen mit anderen Zellen zu wandern. Letztendlich wird die Lebendzellmikroskopie verwendet, um Axxis in wandernden Zellen zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Polyacrylamid besteht darin, dass es einen einzigen Schritt zwischen dem weichen PDMS und starrem Glas anstelle von Gradientengelalternativen gibt. Auch Beschichtung von PDMS mit extrazellulärer Matrix Komponenten wie Fibronektin erfordern keine chemische Vernetzung, wie sie für Polyacrylamid-Gele erforderlich ist. Um eine Sechs-Well-Gewebekulturplatte vorzubereiten, zerreißen Sie zuerst die Waage mit einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen.

Wiegen Sie etwa 10 g der Polydimethylsuboxan- oder PDMS-Basislösung in der 50-Milliliter-Tube ab. Für ein Substrat von 90 zu eins dividieren Sie das gemessene Gewicht der PDMS-Basislösung durch 90. Um die richtige Menge der benötigten Vernetzerlösung zu bestimmen, geben Sie die berechnete Menge PDMS-Vernetzerlösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in das Rohr, das kräftig gemischt wurde.

Wenn Sie in diesem Stadium einen kleinen Spatel verwenden, enthält die Mischung eine kleine Anzahl von Luftblasen. Zentrifugieren Sie das PDMS-Substrat in einer Tischzentrifuge fünf Minuten lang mit 50 Mal. G.Fügen Sie Raumtemperatur hinzu, um die Blasen zu entfernen, falls noch Blasen vorhanden sind.

Nach den fünf Minuten zentrifugieren Sie erneut einen Milliliter des 90 to 1 PDMS-Substrats in jede Vertiefung der behandelten Gewebekultur. Sechs-Well-Platte. Alle verbleibenden Luftblasen, die im PDMS vorhanden sind, können in dieser Phase beseitigt werden, indem sie mit einer 21-Gauge-Nadel zum Platzen gebracht werden.

Lassen Sie das PDMS 30 Minuten lang in der Vertiefung verteilen. Als nächstes kochen Sie 12 Millimeter Glas Nummer eins, Deckgleiten in destilliertem Wasser für fünf Minuten, insgesamt dreimal. Legen Sie einen getrockneten Deckschirm in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte, indem Sie vorsichtig eine Seite der Abdeckung berühren.

Schlüpfen Sie in die PDMS-Lösung und lassen Sie dann den Deckglas auf das PDMS fallen. Wenn sich der Deckglas absetzt, beginnt das PDMS, über die Ränder des Deckglases hinauszuragen, deckt es jedoch nicht vollständig ab. Dadurch wird nach dem Aushärten eine Grenzfläche zwischen dem PDMS und dem Glas erzeugt.

Inkubieren Sie die Platte bei 70 Grad Celsius in einem Ofen für 16 Stunden, um das PDMS auszuhärten. Zum Schluss legen Sie die Platte in eine Zellkulturhaube und sterilisieren sie 10 Minuten lang mit UV. Beschichten Sie jede Durox-Kammer eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius mit einem Milliliter Fibronektin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium.

Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche in das Fibronektin in PBS-Lösung eingetaucht ist. Bereiten Sie hitzebehaftetes 1%iges Rinderserumalbumin oder BSA vor, indem Sie 0,5 Gramm BSA wiegen und in 50 Millilitern PBS-Filter auflösen. Sterilisieren Sie eine Lösung durch einen 22-Mikron-Filter, bevor Sie sie 12 Minuten lang auf 80 Grad Celsius erhitzen.

Als nächstes aspirieren Sie die Fibronektinlösung und waschen die Kammern dreimal mit PBS. Geben Sie einen Milliliter hitzedenaturiertes BSA in PBS in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, trypsinieren Sie die Augen und zählen Sie die Zellen Ihrer Wahl, während die Durex-Kammern mit der Hitze verstopfen. Denaturiertes BSA aspiriert BSA-Lösung aus Kammern kurz vor der Beschichtung der Zellen.

Platte 10.000 Zellen in einem Volumen von zwei Millilitern in jede Vertiefung der Doax-Kammer. Lassen Sie die Zellen unter Verwendung des für den jeweiligen Zelltyp erforderlichen Mediums vier Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 auf dem Substrat haften und verteilen. Führen Sie die Bildgebung lebender Zellen an einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast mit einem 10-fach-Objektiv durch. Das Mikroskop sollte mit einer geschlossenen befeuchteten Kammer ausgestattet sein, die eine Kontrolle der Temperatur auf 37 Grad Celsius und 5 % CO2 während der Langzeitbildgebung ermöglicht.

Nachdem sich die Zellen etwa 3,5 Stunden lang ausgebreitet haben, wird die Platte in der Mikroskopkammer zusammengebaut. Lassen Sie die Proben 30 Minuten lang in der Kammer äquilibrieren. Richten Sie einen automatisierten Mehrpunktbesuch am Mikroskop ein, falls verfügbar.

Konzentrieren Sie sich auf die Schnittstelle zwischen dem PDMS und dem gläsernen Deckglas und wählen Sie Punkte aus, die rund um die Schnittstelle abgebildet werden sollen. Bei durchschnittlich 40 Punkten pro Durex-Kammerbild, die Zellen alle 10 Minuten für bis zu 16 Stunden, wird der interessierende Bereich als zwei Linien angezeigt, wobei die äußere Linie dem Rand des Deckglases und die innere Linie der tatsächlichen Schnittstelle zwischen dem PDMS und dem Deckglas entspricht. Um die Daten zu analysieren, erstellen Sie eine Tabelle, wie sie im Textprotokoll angezeigt wird.

Zählen Sie die Anzahl der Kreuzungsereignisse vom PDMS zur Glasoberfläche und umgekehrt für jeden generierten Film. Ein Kreuzungsereignis ist definiert als der Zellkern, der die Grenze zwischen dem PDMS und dem Glas in beide Richtungen überquert. Notieren Sie die Anzahl der Kreuzungsereignisse in der entsprechenden Spalte in der Excel-Tabelle, um mehrere Kreuzungen zu quantifizieren.

Zählen Sie, wie oft die Zelle die Schnittstelle überquert hat. Diese Nummer sollte in der Excel-Spalte aufgezeichnet werden, die dem Substrat entspricht, auf dem sich die Zelle am Ende des Films befand. Wiederholen Sie die Analyse für jede Zelle, die die Benutzeroberfläche im Film kreuzt.

Schließen Sie Zellen aus, die während der Bildgebung aus dem Sichtfeld wandern. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die von PDMS auf die Glasoberfläche migriert sind und daher Duro Texas durchlaufen haben. Um dies zu tun.

Addieren Sie die Anzahl der Kreuzungsereignisse von weich bis hart und die Anzahl der Kreuzungsereignisse, die auf schwer endeten, und dividieren Sie durch die Gesamtzahl der Kreuzungsereignisse. Berechnen Sie den Prozentsatz der Mehrfachkreuzungen, indem Sie die Gesamtzahl der Mehrfachkreuzungen durch die Gesamtzahl der Kreuzungen dividieren, um den molekularen Mechanismus zu verstehen, durch den Zellen auf mechanische Signale in ihrer Umgebung reagieren. Spezifische Proteine können mit IRNA abgebaut werden, wie hier gezeigt.

Etwa 70% der mit irna behandelten Zellen wiesen Axxis auf. Im krassen Gegensatz dazu hatten die Zellen bei der Unterdrückung der CD-Lücke mit RNAi keine Präferenz, ob sie auf das harte oder weiche Substrat migrierten. Darüber hinaus überschritten die CD-Gap-Knockdown-Zellen das Grenzmultiple.

Während mit Kontroll-Irna behandelte Zellen in der Regel nur einmal repräsentative Kontrollpfade überschreiten, überschreiten sie die Grenze. Irna-Zellen zeigen, dass die Zellen in der Regel einmal über die Grenze wandern und im Vergleich zur CD-Lücke bevorzugt auf der steiferen Oberfläche bleiben. Irna behandelte Zellen, die keine Präferenz für eine der beiden Steifigkeiten zeigten und die Grenze mehrmals überquerten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die PDMS-Substrate vorbereiten, die Duris-Kammern zusammenbauen und die DUR-Steuern quantifizieren.