Name: Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Lernen Sie ein vereinfachtes System zur Analyse der Zell-Durotaxis mit PDMS-Substraten definierter Steifigkeit. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Zellmigration in Richtung festerer Substrate.

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Diese Arbeit wird durch NIH R01 GM47607, CA163296 und NSF 1.334.493 um CET unterstützt. Wir danken Mitglieder der Turner-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Alle in diesem Bericht angegebenen Daten wurden durch die Erlaubnis von Wormer et al. 2014 11 wiedergegeben.

1. Herstellung von Durotaxis Chambers <ol><li> Einem 6-Loch-Gewebekulturplatte herzustellen, tarieren Sie die Waage mit einem 50-ml konischen Röhrchen. Man wiegt etwa 10 g des PDMS-Grundlösung in der 50-ml-Tube (die Lösung ist ziemlich viskos). </li><li> Für ein 90: 1 Substrat (Einhaltung von ~ 1 kPa), unterteilen das gemessene Gewicht des PDMS-Grundlösung in der Röhre um 90, um die richtige Menge an Vernetzer-Lösung benötigt bestimmen. Die berechnete Menge des PDMS-Vernetzer-Lösung auf die gleiche Röhre. Beispiel: 10 g / 90 = 0,11 g. In 0,11 g des PDMS-Vernetzer-Lösung auf den PDMS-Basislösung. HINWEIS: Die Basis und Vernetzungslösungen werden sowohl in der PDMS-Kit zur Verfügung gestellt. </li><li> Kräftig mischen die PDMS-base / Vernetzer-Mischung für 5 min bei RT mit einem kleinen Spachtel. In diesem Stadium wird die Mischung einer großen Anzahl von Luftblasen enthält. </li><li> Zentrifugieren Sie die PDMS-Substrat in einer Tischzentrifuge 5 min bei 50 × g bei RT, die bub entfernenbles. Wenn es noch Blasen nach 5 min, Zentrifuge erneut. </li><li> Pipette 1 ml 90: 1 PDMS Substrat in jede Vertiefung der Gewebekultur behandelten Platte mit 6 Vertiefungen. Eventuell verbleibende Luft in den PDMS vorhanden Blasen können in dieser Phase durch knallen sie mit einer 21 G-Nadel beseitigt werden. Ermöglichen, dass die PDMS für 30 min in der gut verteilen. </li><li> Boil 12 mm Glas # 1 Deckgläser in destilliertem Wasser für 5 min. Wiederholen Sie zweimal, und speichern Sie die Deckgläser in destilliertem Wasser. </li><li> Legen Sie ein, getrocknet Deckglas in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte durch leichtes Berühren einer Seite des Deckglases in die PDMS-Lösung fallen dann das Deckglas auf die PDMS. Als das Deckglas gelegt hat, wird die PDMS beginnen, um die Kanten des Deckglases über eingreifen, aber nicht vollständig abdecken. Dies wird eine Schnittstelle zwischen den PDMS und Glas nach dem Härten erzeugen (siehe 1A, B). </li><li> Die Platte bei 70 ° C in einem Ofen für 16 Stunden, um zu heilen (verhärten) die PDMS. Setzen Sie den plate in einer Zellkultur Kapuze und UV Sterilisation für 10 Minuten. HINWEIS: Am besten ist es, um die Platten innerhalb von ein paar Tagen der Anwendung zu machen. Jedoch können die Platten in Parafilm ohne Puffer eingewickelt und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen ohne nennenswerten Qualitätsminderung gelagert werden. </li></ol> 2. Zell Plating HINWEIS: Wenn die Untersuchung der Wirkung von siRNA-vermittelten Knockdown, führen Sie die Zuschlags mit den Anweisungen des Herstellers oder des optimierten Protokoll für den Zelltyp der Wahl. <ol><li> Mantel jeweils durotaxis Kammer mit 1 ml von 10 ug / ml Fibronektin in PBS ohne Calcium und Magnesium für 1 h bei 37 ° C. Alternativ kann das Fibronektin kann den Tag vor der Analyse durch Inkubation der PDMS mit 10 ug / ml Fibronektin in PBS für 16 Stunden bei 4 ° C angewendet werden. Sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche der Fibronektin in PBS-Lösung eingetaucht. </li><li> Bereiten hitzedenaturierte 1% BSA. Wiege 0,5 g BSA und löst ihn in 50 ml PBS.Filter sterilisiert die Lösung durch ein 0,22 um Filter und Hitze bei 80 ° C für 12 min. Hinweis: Diese Lösung ist der Tag vor dem Beschichten und bei 4 ° C Zelle. </li><li> Saugen Sie das Fibronektin-Lösung und wäscht 3 mal mit PBS. 1 ml der hitzedenaturierten BSA in PBS in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei RT. </li><li> Trypsinize und zählen Zellen der Wahl, während die durotaxis Kammern sind mit der Hitze denaturiert BSA blockiert. </li><li> Platte 1 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 2 ml in jede Vertiefung der durotaxis Kammer mit dem für den jeweiligen Zelltyp der Wahl erforderlichen Medien. Damit sich die Zellen anhaften und verteilt auf dem Substrat für 4 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO 2. HINWEIS: U2OS-Zellen werden routinemäßig in DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 10 IU / ml Penicillin, 10 ug / ml Streptomycin ergänzt. HINWEIS: Die Zellzahl in diesem Beispiel verwendet wird, für eine optimierteU2OS-Zellen. Optimierung für andere Zelltypen erforderlich sein können. Diese Dichte verleiht den Zellen genügend Platz, um ohne signifikante Wechselwirkungen mit anderen Zellen wandern. </li></ol> 3. Bildgebung lebender Zellen <ol><li> Führen Sie Live Cell Imaging auf einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast mit einer 10X-Objektiv. Das Mikroskop ist mit einem geschlossenen ökologischen, feuchten Kammer eingebaut werden und ermöglicht die Steuerung der Temperatur bei 37 ° C und 5% CO 2 während einer Langzeitbildgebung. </li><li> Nachdem die Zellen für ca. 3,5 Stunden verteilt, montieren Sie die Platte in das Mikroskop Kammer. Die Probe (n) in die Kammer für 30 Minuten äquilibrieren. </li><li> Up automatisierte Multi-Point-Besuch auf dem Mikroskop falls vorhanden eingestellt. Konzentrieren Sie sich auf der Schnittstelle zwischen den 90: 1 PDMS und dem Deckglas, und wählen Sie Punkte für Bild in der ganzen Oberfläche mit durchschnittlich 40 Punkte pro durotaxis Kammer. Bild die Zellen alle 10 min bis zu 16 h. HINWEIS: Die WiederRegion von Interesse wird als zwei Zeilen angezeigt wird, mit der Außenleitung, die dem Rand des Deckglases und der Innenleitung entsprechend der tatsächlichen Grenzfläche zwischen den PDMS und dem Deckglas. Siehe Abbildung 1B. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Erzeugen Sie eine Tabelle wie in Tabelle 1. </li><li> Zählen die Anzahl der Durchgangsereignisse aus den PDMS auf der Glasoberfläche und umgekehrt von jedem Film erzeugt. Notieren Sie die Anzahl der Durchgangsereignisse in der entsprechenden Spalte in der Excel-Tabelle. HINWEIS: Ein Durchgangsereignis wird als der Zellkern, der über die Grenze zwischen dem PDMS und Glas in jede Richtung definiert. </li><li> Um mehrere Übergänge zu quantifizieren, zu zählen, wie oft die Zelle überquerte die Schnittstelle. Diese Nummer in dem Excel-Spalte entsprechend dem Substrat, auf dem die Zelle an dem Ende des Films angeordnet sind, aufgenommen werden. Wiederholen Sie die Analyse für jede Zelle, die die Schnittstelle in t durchquerter Film. Zellen, die während der Bilderzeugung aus dem Sichtfeld zu migrieren auszuschließen. Anmerkung: Es ist auch wichtig, um zu verifizieren, die durch Zellzählung zu Beginn des Experiments, dass die Zellen der Lage sind, auch für die fibronektinbeschichtete PDMS und Deckglas Oberflächen haften. </li><li> Wird der Prozentsatz an Zellen, die aus PDMS auf der Glasoberfläche (dh unterzog durotaxis) migriert. Hinzufügen der Anzahl der Durchgangsereignisse von weich bis hart und den mehreren Durchgangsereignisse, die auf harte und Dividieren durch die Gesamtzahl der Durchgangsereignisse beendet. </li><li> Berechnung des Prozentsatzes der mehrfachen Durchgänge durch Teilen der Anzahl von Mehrfachdurchgängen durch die Gesamtzahl von Übergängen. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Hier beschreiben wir eine einfache Test um durotaxis in migrierenden Zellen zu studieren. Eine große Stärke dieses Tests ist die Leichtigkeit der Herstellung der durotaxis Kammern mit PDMS. Die Steifigkeit der Substrate können leicht durch Ändern des Verhältnisses der PDMS-Basislösung zu Vernetzer, das Studium der verschiedenen Steifigkeiten im Assay ermöglicht manipuliert werden. Allerdings ist eine potenzielle Beschränkung des Systems, dass die Zellen nur auf eine einzige Änderung in der Steifigkeit Substrat ausgesetz...

Die extrazelluläre Matrix (ECM) besteht aus einer komplexen Reihe von strukturellen und Vernetzungsproteinen einschließlich Kollagen, Fibronectin und Laminin besteht. Es ist zwar bekannt, dass die ECM liefert wichtige strukturelle Unterstützung für Zellgewebe gibt es zunehmend Hinweise darauf, daß Zellen, aktiv auf physikalische Veränderungen zu reagieren in der ECM-Umgebung zu unterschiedlichen zellulären Prozessen, einschließlich der Zellüberlebens, der Differenzierung und der Zellmigration regulieren. Beispielsweise können Unterschiede in der Steifigkeit der ECM mesenchymalen Stammzellen gegenüber verschiedenen Linien fahren, mit weicher Substrate (~ 1 kPa) Förderung neurogene Linien während steife (~ 25 kPa) Substrate fördern osteogene Differenzierung 1. Ähnlich kann eine Erhöhung der Steifigkeit Stromamatrix wurde gezeigt, dass Brust Epithelzelle Tumorigenese und Invasion in das umliegende Gewebe 2,3 fördern. Ein besonders interessanter Aspekt dieser mechanosignaling Aktivität resultiert in einem Verfahren, wie durotaxis, bei dem Zellen wandern bevorzugt in Richtung eines starren Substrats 4,5 bekannt. Zellen ständig erfassen die physikalischen Eigenschaften ihrer extrazellulären Umgebung durch Integrin-Rezeptor-Bindung an den ECM. Dies wiederum fördert die Ansammlung von zahlreichen strukturellen und Signalproteinen, ihre zytoplasmatischen Domänen, die Bildung von Klebstoff fokalen Adhäsionen oder fokalen Kontakten 6,7 bekannten Strukturen zu fahren. Da Integrine haben keine inhärente enzymatische Aktivität werden Signale von der ECM durch diese Hilfsproteine ​​übertragen, um die Antwort der Zelle auf ihre sich verändernden Umwelt 8 koordinieren. Dementsprechend ist die Identifizierung und Charakterisierung der Schlüsselproteinen regulieren mechanosignaling und durotaxis involviert ein wichtiges Forschungsgebiet. Verschiedene Modellsysteme entwickelt worden, um zu studieren durotaxis in vitro, aber die meisten habenverwendet kollagenbeschichteten Polyacrylamid Substrate 4. Jedoch kann die Vorbereitung der Polyacrylamid Substrate technisch anspruchsvoll sein und das Kollagen in diesen Assays verwendet werden, müssen chemisch vernetzt mit dem Substrat 9 ist. Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrate wurde gezeigt, dass vergleichbare mechanische Eigenschaften wie die Polyacrylamid Substrate 10 aufweisen. Jedoch PDMS Substraten durch einfaches Mischen ein Verhältnis der Base zu Vernetzer hergestellt, und diese Substrate können mit ECM-Proteine ​​ohne die Notwendigkeit für eine chemische Vernetzung beschichtet werden, wodurch eine einfachere PDMS Werkzeug, um die Wirkungen der Steifheit auf das Zellverhalten zu untersuchen. Hier beschreiben wir, wie eine einfache durotaxis Kammer, in der ein weiches PDMS-Substrat mit einem starren Deckglas integriert vorzubereiten. Der Test, wie unten beschrieben, bietet eine schnelle und einfache Methode, um durotaxis studieren. Für diese Studie menschlichen U2OS Osteosarkom-Zellen in Kombination mit siRNA-vermittelten verwendeten wirKnockdown von cdGAP, um die Rolle dieser focal adhesion protein in durotaxis 11 zu studieren. Wichtiger ist, daß dieses Protokoll leicht den individuellen Bedürfnissen angepasst werden. Andere Zelltypen können für die U2OS-Zellen ersetzt werden und jedes Protein kann abgerissen oder überexprimiert wird, um die Auswirkungen auf das Zellverhalten während durotaxis bestimmen. Weiterhin kann das Protokoll angepasst ist, um fluoreszent markierte Proteine ​​enthalten, um ihre Dynamik und das Verhalten mit FRAP oder FRET Ansätze analysiert werden.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td></tr><tr><td>#1 Deckglas 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

ein vereinfachtes system zur bewertung der zell mechanosensing und durotaxis<em&gt; in-vitro-</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Die Zusammensetzung und die mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix sind sehr variabel zwischen Gewebetypen. Diese Bindegewebsstroma Vielfalt großen Einfluss auf das Zellverhalten normalen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Zellproliferation, Differenzierung, Adhäsion Signalisierung und gerichtete Migration zu regulieren. In dieser Hinsicht ist die angeborene Fähigkeit von bestimmten Zelltypen, auf eine steifere oder weniger nachgiebig Matrixsubstrat wird als durotaxis bezeichnet migrieren. Dieses Phänomen spielt eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Invasion von Krebszellen. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur durotaxis studieren, in vitro, mit Polydimethylsiloxan (PDMS) Substraten. Herstellung der beschriebenen durotaxis Kammern schafft eine Steifigkeit Schnittstelle zwischen dem relativ weichen PDMS-Gel und einem starren Deckglas. Im vorliegenden Beispiel haben wir diese durotaxis Kammern verwendet, um eine Rolle des cdc42 demonstrieren / Rac1 GTPase aktivierende Protein, cdGAP, in mechanosensing und durotaxis Regulierung im menschlichen U2OS Osteosarkom-Zellen. Dieser Test ist leicht an andere Zelltypen und / oder Zuschlags anderer Proteine ​​von Interesse, ihre jeweiligen Rollen in mechanosignaling und durotaxis erkunden.

Ein Schema des durotaxis Kammer ist in 1A gezeigt. Weichen PDMS-Substrat (eine 90: 1 Mischung von PDMS Basis Lösungen Vernetzer) in einer 6 Well-Platte verteilt und ein Deckglas wird oben auf den PDMS, die dann teilweise die obere Oberfläche des Deckglases abdeckt angeordnet, wodurch eine Schnittstelle schaffen zwischen den beiden Substraten unterschiedlicher Compliance. Die Steifigkeit des weichen PDMS Substrat ~ 1 kPa, vergleichbar mit der typischen Einhaltung des Hirngewebes ist, während die Steifigk...

Viele Säugetierzellen wandern bevorzugt durch Durotaxis zu einer steiferen Matrix oder einem Substrat. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches In-vitro-System bereitzustellen, das zur Untersuchung und Manipulation des Durotaxis-Verhaltens von Zellen verwendet werden kann, indem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrate mit definierter Steifigkeit integriert werden, die mit Glasdeckgläsern verbunden sind.

Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis<em&gt; In-vitro-</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein vereinfachtes System zur Analyse der Zell-Durex bereitzustellen, durch das viele Säugetierzellen bevorzugt in Richtung eines steiferen Substrats wandern. Dies wird erreicht, indem zunächst Polymethylsiloxan oder PDMS-Substrate definierter Steifigkeit hergestellt werden. Anschließend wird das vorbereitete PDMS in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte gegossen und eventuelle Luftblasen entfernt.Die Durex-Kammern werden anschließend vervollständigt, indem ein sterilisierter Deckgläser auf die PDMS-Oberfläche in jedem Brunnen platziert wird, um eine Überlagerung zu erzeugen. Im letzten Schritt werden Zellen in die Duro-Taxes-Kammern mit einer Dichte ausgesät, die den Zellen ausreichend Platz zum Migrieren bietet, ohne dass nennenswerte Wechselwirkungen mit anderen Zellen auftreten. Schließlich wird die Achse in migrierenden Zellen mittels Live-Cell-Mikroskopie untersucht.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Polyacrylamid besteht darin, dass zwischen dem weichen PDMS und dem starren Glas nur ein einzelner Schritt erforderlich ist, im Gegensatz zu Gradienten-Gel-Alternativen. Außerdem ist zum Beschich

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Biologie

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Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Um neue Mutationen zu identifizieren, die die Mechanoempfindung beeinflussen, haben wir einen Assay entwickelt, der die Verhaltensreaktion auf taktile Stimulation von Fliegenborsten in mutierten Klonen misst, die mit der MARCM-Methode erzeugt wurden. Die Kombination der Techniken ermöglicht die Identifizierung mechanosensitiver Mutationen, die sonst tödlich wären.

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Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.

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Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

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Neue Werkzeuge für die Mechanobiology Forschung sind erforderlich, um verstehen, wie mechanischen Beanspruchung biochemische Stoffwechselwege aktiviert und biologische Reaktionen hervorruft. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur selektiven mechanischen Stimulation der immobilisierten Tiere mit einem mikrofluidischen Trap ermöglicht hochauflösende Bildgebung der zellulären Antworten.

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Wir präsentieren Ihnen eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt mit einem leichten Bogen Mikroskop und deren Umsetzung, Zelle Mechanik ohne Perlen in Drosophila Embryos zu erforschen.

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Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt das Design, die Herstellung und die Charakterisierung eines mikrofluidischen Systems, das in der Lage ist, Hunderte von Drosophila melanogaster-Embryonen mit minimalem Benutzereingriff auszurichten, zu immobilisieren und präzise zu komprimieren. Dieses System ermöglicht hochauflösende Bildgebung und Rückgewinnung von Proben für die Analyse nach der Stimulation und kann skaliert werden, um andere mehrzellige biologische Systeme aufzunehmen.

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