Name: Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Synthese magnetischer bakterieller Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikeln zur Rekonstruktion beschädigter Blutgefäße. Diese Methode ermöglicht minimale invasive Behandlungen bei Hirnaneurysmen.

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Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium unter der Vertragsnummer W81XWH-11-2-0067 finanziert

1. Herstellung von bakteriellen Nanocellulose (BNC) Anmerkung: Alle Schritte werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. <ol><li> Bereiten Kulturmedium. <ol><li> Bereiten 500 ml flüssiges Kulturmedium durch 25 g Hefeextrakt kombinieren, 15 g Pepton, 125,0 g Mannit und 500 ml vollentsalztem Wasser auf. Autoklav diese Mischung bei 120 ° C für 20 min und bei 4 ° C. </li><li> Herstellung von 100 ml halbfesten Medien durch Zugabe von 15 g Agar und 5,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 25,0 g Mannit und 100 ml vollentsalztem Wasser auf. Autoklaviert diese Mischung bei 120 ° C für 20 min. Sobald autoklaviert Ablagerung 5 ml der Mischung in einem 90 mm x 16 mm Kunststoff-Petrischale. Lassen Sie die Lösung zu Gel bei 4 ° C und lagern bei dieser Temperatur bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Rehydrate G. xylinus erhaltenen Stamm in gefriergetrockneten Ampullen durch Zugabe von 1 ml des flüssigen Kulturmediums und Pipettieren undnach unten, wie durch den Anweisungen des Herstellers angegeben. </li><li> Impfen die Petrischalen halbfest Medien mit kleinen Tröpfchen von bakteriellen Suspension, die Impföse. Stellen Sie sicher, dass der Impfstoff die gesamte Petrischale deckt durch die Schleife in einer Zick-Zack-Richtung vom Rand in die Mitte des Tellers zu bewegen. </li><li> Inkubieren der Petrischalen bei 26 ° C für 72 Stunden in einem Inkubator ohne CO 2. Sobald der Inkubationsperiode abgeschlossen ist, kleine weiße Kolonien sichtbar. Wenn die Kolonien nicht sofort verwendet wird, speichern Sie die Petrischalen bei 4 ° C durch den Deckel mit Parafilm Versiegelung und das Geschirr legen den Kopf. Die Kolonien können für bis zu 6 Monate in dieser Weise gespeichert werden. </li><li> Transfer 2 ml des flüssigen Kulturmedium in Stufe (1.1.1) in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Nehmen Sie zwei Kolonien mit einer Impfnadel von den geimpften Petrischalen in Schritt (1.3) und legen Sie sie in die erste Vertiefung der Gewebekulturplatte. Ran wiederholen das gleiche Verfahren für die restlichen 23 Bohrlöcher. </li><li> Inkubieren der Gewebekulturplatte bei 30 ° C für 7 Tage. Dies wird insgesamt 24 BNC Häutchen mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Dicke von ca. 2-3 mm Durchmesser ergeben , wie in Abbildung 1 dargestellt. Hinweis: Verwenden Sie nicht die Bakterienkultur zu irgendeinem Zeitpunkt während Inkubationszeit stören, zum Beispiel durch die Platten schütteln. Während der Inkubationszeit, G. xylinus extrudieren glucopyranose Zuckermoleküle ein polymeres kristallinen mesh in der Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche zu bilden, die die Form und Größe des Kolbens unter statischen Kultivierungsbedingungen annimmt. Diese polymere Matrix, wie bakterielle Nanocellulose (BNC) bekannt ist, ist auffällig am Ende der Inkubationszeit. </li><li> Sammeln Sie die BNC - Häutchen von den Wachstumsmedien und sterilisieren sie in 200 ml einer 1% igen NaOH - Lösung für 1 h bei 50 ° C, um alle Spuren von G. zu entfernen xylinus. Optional rühren diese Lösung bei 300 Umdrehungen pro Minute eine Magnetleisteund eine Rührplatte. Entsorgen Sie die NaOH-Lösung und mit 200 ml frisch 1% NaOH-Lösung hergestellt. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal mehr, oder bis die BNC Häutchen in Lösung erwirbt ein durchscheinendes Aussehen. </li><li> Spülen Sie die BNC-Häutchen dreimal mit Wasser und speichern sie in hochreinem Wasser bei RT. Machen Sie den BNC Häutchen sicher im Wasser vollständig untergetaucht und nicht erlaubt, jederzeit zu trocknen. </li><li> Autoklave mit BNC Häutchen bei 121 ° C für 20 min. Hinweis: Eine in vivo subkutan Studie an Ratten durchgeführt von Märtson und Mitarbeiter zeigten , nicht Abbau Zeichen des BNC nach 60 Wochen der Implantation. Tatsächlich ist BNC abbaubar in der Natur durch mikrobielle und Pilzenzyme, die bei Säugetieren fehlen. Auf der anderen Seite kann die biologische Abbaubarkeit des BNC das Ergebnis von mechanischen, chemischen und biologischen Prozesse, die die Mikrofibrillen Netzwerk in vivo 4 schwächen. </li></ol> 2. Synthese von polymerbeschichtetenEisenoxid-Nanopartikel und seiner Ablagerung in einer bakteriellen Membran Nanocellulose <ol><li> Blase 1000 ml hochreinem Wasser mit Stickstoffgas, um jeglichen gelösten Sauerstoff im Wasser zu entfernen und ersetzen Sie es mit Stickstoff. </li><li> Verwenden Sie einen Dreihalsrundkolben , eine Lösung in einem 2 vorzubereiten: 1 - Molverhältnis von Eisen (III) -chlorid - Hexahydrat (FeCl 3 · 6 H 2 O) und Eisen (II) -chlorid - Tetrahydrat (FeCl 2 · 4H 2 O) verdünnt mit dem sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit. Verwenden Sie zum Beispiel 5,4 g FeCl 3 · 6 H 2 O und 1,98 g FeCl 2 · 4H 2 O in 10 ml sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit. Wenn diese Zubereitung zu viskos und schwierig dreht sich zu rühren, verwenden Sie 0,54 g FeCl 3 · 6 H 2 O und 0,198 g FeCl 2 · 4H 2 O in 20 ml sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit. Hinweis: Reduzieren Sie die Belichtungszeit der FeCl 2 · 4H 2 O , um Luft durch diese ch mit einem Gewicht vonemical Verbindung so schnell wie möglich. Einmal im Rundkolben Dreihals eingeführt, schließen Sie das Dreihalsrundkolben mit Septum Stopper, bis sie an das Stickstoffgasversorgung und dem Kondensatorrohr verbunden ist. </li><li> Verwenden Sie zwei Hälse des Schiffes einen konstanten Eingang und Ausgang von Stickstoffgas zu schaffen, durch den Stickstoffgaszufuhr zu einer Nadel in Septumstopfen und fixiert ist, um die Schiffs Hälse gestanzt verbindet. </li><li> Platzieren 1 BNC Häutchen, die zuvor in Schritt hergestellt wurde, 1,5 (15,6 mm Durchmesser und 2-3 mm Dicke) in dem Gefäß mit den Reaktanden. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist. </li><li> Verbinden des verbleibenden Hals des Gefäßes zu einem Kondensatorrohr. Zusätzlich verwenden ein Trockenrohr mit wasserfreiem Calciumsulfat auf dem Kondensatorrohr gefüllt. Führen Sie Wasser durch das Kondensatorrohr. </li><li> Siegel alle Glasfugen mit Vakuumfett. </li><li> Die Lösung wird in einem Siliconöl-Bad auf 80 ° C ein Rühren unter Verwendung vondiese Temperatur bis Schritt 2.10 Heizplatte und zu halten. Verwenden Sie einen kleinen magnetischen Rührstab die Reaktanden für 5 Minuten bei 350 Umdrehungen pro Minute zu mischen. Stellen Sie sicher, dass der BNC wird in geeigneter Weise mit der Eisenlösung und die Reaktanden werden vollständig gelöst imprägniert. Halten der Mischung, bis zum Ende des Experiments gerührt. Anmerkung: Man verwendet eine Thermometer die Temperatur des Silikonöls zu verifizieren. Es sollte auf 80 ° C stabil sein. </li><li> Erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 700 rpm und füge (durch Fallenlassen), in einem Zeitintervall von 5 min wurden 5 ml Ammoniumhydroxid (NH 4 OH, 14%) zu der 10 ml Eisenlösung mit einer Pipettiernadel verwendet, die gewesen auch in Septumstopfen gestanzt. Nach der Zugabe des Ammoniumhydroxids, ändert sich die Farbe der Lösung von gelb / orange bis schwarz. </li><li> Weiterhin die Lösung bei 80 ° C für weitere 5 min gerührt wurde. Vermeiden Sie hohe Geschwindigkeit Regungen, um die Integrität der Probe zu erhalten. Hohe Drehzahlen, dh höher als 1000 Umdrehungen pro Minute, kann zerstörendie Probe. </li><li> Senken Sie die Temperatur der Lösung auf 30 ° C, um die Temperaturregelung Boden des Rühren Heizplatte mit und halten für weitere 5 min gerührt wurde. Dann schalten Sie die Kochplatte aus. Zu diesem Zeitpunkt haben die IONP wurde in die BNC-Mesh eingebaut. </li><li> Man kühlt die Mischung auf RT und trennen die magnetischen Nanopartikel (MNP) und BNC einen starken Permanentmagneten mit ( zum Beispiel 1 Tesla). Dazu übertragen Sie die Mischung in einen Kolben vorgelegt und dann, während der Magnet der Nähe des Schiffes zu halten, halten Sie die MNPs und die BNC an Ort und Stelle, während der Überstand dekantiert. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, wenn starken Magneten Handhabung, da sie bei falscher Anwendung schädlich sein kann. Für die Schritte (2.12) - (2.14) und (2.16) verwenden, um die sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit hergestellt zuvor in (2.1) Teilchen vor Oxidation zu verhindern. </li><li> Resuspendieren MNPs und BNC in 100 ml Wasser. Schütteln Sie die Lösung, die alle MNPs zu entfernen, die nicht stark in die BNC aufgenommen werden. Dekantiert die supernatant wieder durch die MNP und den BNC an Ort und Stelle hält den Magneten verwendet wird. </li><li> Waschen Sie die MNPs und die BNC mehrmals mit Wasser, bis der Überstand neutralen pH-Wert (pH ~ 7) erreicht, wie mit Hilfe eines kolorimetrischen Streifen gemessen. </li><li> Trennen Sie die magnetische funktionalisierte BNC oder magnetische bakterielle Nanocellulose (MBNC) von der MNP mit einer Pinzette und spülen Sie die MBNC mehrmals mit Wasser, bis das Wasser klar ist. </li><li> Sterilisieren Sie die MBNC durch die MBNC O / N mit UV-Belichtungs (110-280 nm). </li><li> Autoklav 500 ml deoxygenated hochreinem Wasser bei 120 ° C für 20 min und speichern Sie die MBNC in 20 ml dieses Wassers. </li><li> Aseptisch, tauchen Sie die Probe in 1% PEG und rühre 2 Stunden bei RT (37 ° C). Dieses Verfahren verbessert die Biokompatibilität und Stabilität der Nanopartikel Eisenoxid in der BNC abgeschieden, insbesondere 5-7 die an der Oberfläche freigelegt. Die PEG-Beschichtung wird über die MBNC 3D-Netzwerk verteilt werden. Hinweis: Naked IONP werden an der Luft leicht oxidiertwegen ihrer hohen chemischen Aktivität 8. Obwohl PEG ein nicht-biologisch abbaubares Material betrachtet wird, hängt die chemische Stabilität der angewandten biologischen Bedingungen wie Wassergehalt, pH, Temperatur, Gegenwart von Enzymen, reaktive Sauerstoffspezies, reaktive Stickstoffspezies und andere 9. </li></ol> 3. Charakterisierung des BNC und MBNC Pellikel <ol><li> Mechanische Eigenschaften <ol><li> Führen normalen Be- und Entladen Nanoindentierung Test Berkovich Indenter verwenden. Der Radius des Berkovich Diamant-Eindringkörper ist 20 nm. </li><li> Verwenden Sie Fused Silica und Wolfram Kontaktfläche als Funktion der Eindringtiefe bei RT kalibrieren. Während des Tests montieren Sie die Proben auf der Vertiefung unter Verwendung von Klebstoff. Der Eindringkörper näherte sich den Proben, die in ihrer Dickenrichtung. </li><li> Randomly wählen Vertiefung Stellen an Proben Oberflächen. Halten Sie den Abstand zwischen zwei Einzüge zwischen 200-300 mm. </li><li> Tragen Sie die Last auf dieProben in den Schritten und die entsprechende Verschiebung des Eindringkörpers aufzuzeichnen. Analysieren Sie den Plot der Last vs Tiefe der Young-Modul zu finden. </li><li> Führen Sie die Nanoindentierung Test der Proben in Gegenwart von entsalztem Wasser (VE-Wasser) und Test durch Anwendung Lastraten zwischen 0,0001 mN / s und 0,005 mN / sec, mit Spitzenbelastung zwischen 0,01 mN und 0,60 mN. </li><li> Verwenden Sie eine flüssige Zelle und halten Proben unter der Flüssigkeiten Umwelt. Diese einzigartige Einrichtung in einer flüssigen Umgebung eingetaucht nanome- Charakterisierung ist ideal, um effektiv die Reichweite biomechanische Funktionalität von BNC und MBNC Membranen simulieren. </li></ol></li><li> Strukturelle Charakterisierung von SEM <ol><li> Charakterisieren Sie die Nanocellulose Faserstruktur durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM). </li><li> Lyophilisieren die Proben für 24 Stunden bei -80 ° C. Montieren Sie dann auf SEM-Bolzen, Sputter mit Au-Pd-Film für 10 sec und analysieren REM. </li><li> Nimmt Bilder bei einer Vergrößerung von 22,000Xund 60,000X, mit einer Beschleunigungsspannung von 5 kV. </li></ol></li><li> magnetische Domänen <ol><li> Erlauben, die MBNC Häutchen vollständig trocken bei RT und anschließend 5 min zu einem Permanentmagneten belichten (1 Tesla). </li><li> Sofort durchführen, die magnetischen Kraftmessungen eine Bio-AFM gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Für jede Messung erfassen die Topografiemerkmale erste und die magnetischen Domänen während eines zweiten Durchlauf erhalten. Erhalten Sie beide Messungen mit dem Bio-AFM in der berührungslosen Modus. </li><li> Magnet Charakterisierung der Nanopartikel verwendet Vibrationsprobenmagnetometers (VSM) in dem physikalischen Eigenschaftsmessungen System (PPMS) von Quantum Design, mit einem Magnetfeld im Bereich von -10.000 bis 10.000 Oe bei RT (300 K), durchgeführt. </li></ol></li><li> Cytocompatibility <ol><li> Seed menschliche Aorta-Glattmuskelzellen (HASMC) in einer 6-Well-Gewebekulturplatte in einer Dichte von 1,0x10 <sup&gt; 3 Zellen / cm 2 und in Gegenwart der Testproben für 24 Stunden inkubieren: BNC und MBNC Häutchen (jeweils mit einem 15,6 mm Durchmesser). </li><li> Verwenden Populationen von unbehandeltem und Wasserstoffperoxid behandelte Zellen als negative und positive Kontrollen. </li><li> Führen Sie die Comet - Assay nach Herstellerprotokollen und den Richtlinien vorgeschlagen von A. Azqueta &amp; AR Collins 10. </li><li> Verwenden Sie die Nukleinsäure Farbstoff SYBR Gold in diesem Test zu interkalieren und beschriften fluoreszenz die in den elektrophoresiert Proben enthielten DNA nach dem Protokoll des Herstellers. Hinweis: Zellen, die durchlaufen keine DNA-Schäden in Gegenwart von BNC und MBNC Proben, eine fluoreszierende runde grüne Nucleoid zeigen wird, während DNA geschädigte Zellen lange Kometen haben - positive Proben Nukleoide haben (der Kopf des Kometen), gefolgt von Endstücke, die fragmentierte DNA-Material (Anteil der DNA in die Schwanzvene) enthalten. </li></ol></li></ol>

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<li>Olsson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+flexible+magnetic+aerogels+and+stiff+magnetic+nanopaper+using+cellulose+nanofibrils+as+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates.</a> Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).</li>
<li>Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force+microscopy+and+energy+loss+imaging+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Dicke und Größe des BNC Häutchen kann leicht durch Änderung der Inkubationszeit und die Größe des Kolbens betätigt werden, in der sie während des statischen Kultivierungs angebaut wird. Die microproperties des BNC, wie Porosität, kann durch Veränderung des Sauerstoffanteils in der statischen Kultur modifiziert werden. Höhere Sauerstoffkonzentrationen ergeben härter BNC 11. A. Bodin und Mitarbeitern hergestellten Röhren BNC mit einem Berstdruck von bis zu 880 mm Hg durch die Sauerstoff - Verhältnis von atm...

Die bacterian Nanocellulose (BNC) durch Acetobacter xylinum - Stamm synthetisiert, die auch als Gluconacetobacter xylinus bekannt und in Form von Filmen oder Häutchen auf der Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche während des stationären Kultur abgeschieden. Diese BNC Häutchen nehmen die Form des Behälters , wo sie angebaut werden, und ihre Dicke ist abhängig von der Anzahl der Tage in der Kultur. A. xylinus verwendet die Glucose in dem Medium für die Synthese der Cellulose - Mikrofibrillen durch einen Prozess der Polymerisation und anschließender Kristallisation. Die Polymerisation der Glucosereste an der bakteriellen extrazellulären Membran durchgeführt, wobei Glucanketten aus einzelnen Poren über die Zellhülle verteilt extrudiert werden. Die Kristallisation der Cellulose - Mikrofibrillen auftritt , in den extrazellulären Raum mit der Bildung von Glucankette Blätter durch van der Waals - Bindung , gefolgt von 1 durch H-Bindung der Blätter zu stapeln. Magnetic Nanopartikel zu einer BNC-Matrix integriert kann durch ein externes Magnetfeld, um die Kraft zu erhöhen, leicht manipuliert werden, die notwendig zu lenken und glatten Muskelzellen (SMCs) mit magnetischen Nanopartikeln beschränken, an der beschädigten Stelle der Arterienwand. Diese Strategie hält aus anderen Geweben der SMCs weg und hält die Zellen an Ort und Stelle gegen die Kraft, die durch den Blutfluss ausgeübt wird. Es hat sich gezeigt , dass SMCs eine wichtige Rolle in der vasoelasticity des Blutgefäßes spielen gezeigt, wo sie reichlich Schichten befinden sich hauptsächlich in der Tunica media 2 bilden. Das Verfahren zur Synthese von MBNC verwendet beinhaltet BNC Häutchen eingetaucht und in einer Lösung von Eisen (III) -chlorid-Hexahydrat und Eisen (II) -chlorid-tetrahydrat bei 80 ° C gerührt. Ammoniumhydroxid zugegeben Eisenoxid-Nanopartikel im Inneren des BNC Netz zu bilden. Die Zugabe von Ammoniumhydroxid ändert sich die Farbe der Lösung von orange bis schwarz. Die IONPs kompakt zusammen entlang der BNC-Fibrillens mit einer ungleichmäßigen Verteilung. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Konstruktion eines bakteriellen Nanocellulose magnetische Nanopartikel Häutchen, die wir magnetische bakterielle Nanocellulose (MBNC) genannt haben, die als Ersatz für die Verwendung fehlen, beschädigt oder verletzt kleinem Durchmesser Blutgefäßen bestimmt ist. HS Barud und Mitarbeiter haben kürzlich eine ähnliche Arbeit veröffentlicht 3 eine BNC-basierte flexible Magnet Papier durch Mischen BNC Häutchen in einer stabilen wäßrigen Dispersion von PEG und superparamagnetische Eisenoxid - Nanopartikel zu erzeugen. Hier beschreiben wir die Produktion von bakterieller Cellulose und ihre Imprägnierung in situ mit magnetischen Nanopartikeln. Ein Zytotoxizitätstest auf Detektion von einzelnen DNA-Strangbrüche auf Basis verwendet, um die Biokompatibilität der BNC und MBNC Häutchen zu testen.

<table><tbody><tr><td>Glucoacetobacter xylinus</td><td>ATCC</td><td>700178</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol Bioxtra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>bakteriologisches Pepton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, 50% ige Lösung in Wasser</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid&nbsp;</td><td>Macron Feinchemikalien</td><td>6665-46</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol), durchschnittlich Mn 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202398-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Petrischale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR452000</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Impfschlaufe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-604&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Calciumsulfat</td><td>W.A. Hammond Drierit&nbsp;</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Labor-Pipettiernadel mit 90° stumpfen</td><td>Enden Sigma Aldrich</td><td>CAD7937-12EA</td><td></td></tr><tr><td>pH-Teststreifen&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4786-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Destillierkolben mit rundem Boden und drei Halswinkeln</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4965250</td><td></td></tr><tr><td>Silikonöl für Ölbäder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85409-250ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trockenrohr</td><td>Chemglass</td><td>CG-1295-01</td><td></td></tr><tr><td>Septumstopfen, Hülsentyp</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-98</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührstab</td><td>Chemglass</td><td>CG-2001-05</td><td></td></tr><tr><td>Kondensator</td><td>Chemglass</td><td>CG-1218-01</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>BriskHeat</td><td>SDC120JC-A</td><td></td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49SH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Comet Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nukleinsäure Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Bio-AFM</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard 4a BioScience AFM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindenter</td><td>Micro Materials Ltd</td><td>Mechanischer Tester mit mehreren Modulen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskopie (REM)</td><td>Hitachi High Technologies America</td><td>Hitachi S-4800</td><td></td></tr></tbody></table>

die herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle nanocellulose mit eisenoxid-nanopartikel

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In dieser Studie, die durch die Bakterien produziert Gluconacetobacter bakterielle Nanocellulose (BNC) xylinus synthetisiert wird und in situ mit Eisenoxid - Nanopartikel (IONP) (Fe 3 O 4) imprägniert , um ein magnetisches bakterielle Nanocellulose (MBNC) zu ergeben. Die Synthese von MBNC ist eine präzise und insbesondere mehrstufiges Verfahren entwickelt. Kurz gesagt, werden bakterielle Nanocellulose (BNC) Häutchen aus konservierten G. gebildet xylinus Stamm nach unseren experimentellen Anforderungen der Größe und Morphologie. Eine Lösung von Eisen (III) -chlorid - Hexahydrat (FeCl 3 · 6 H 2 O) und Eisen (II) -chlorid - Tetrahydrat (FeCl 2 · 4H 2 O) mit einem 2: 1 - Molverhältnis in sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit hergestellt und verdünnt. A BNC Häutchen wird dann in den Behälter mit den Reaktanten eingeführt. Diese Mischung wird gerührt und bei 80 ° C in einem Silizium Ölbad und Ammoniumhydroxid (14%) erhitzt wird dann durch Fallenlassen der auszufällenEisenionen in die BNC-Mesh. Dieser letzte Schritt ermöglicht in situ Magnetit - Nanopartikel (Fe 3 O 4) innerhalb der bakteriellen Nanocellulose - Mesh Bildung zu magnetischen Eigenschaften zu BNC Häutchen verleihen. Ein toxikologischer Test wurde verwendet, um die Biokompatibilität des BNC-IONP Häutchen zu bewerten. Polyethylenglykol (PEG) wurde verwendet, um die IONPs zu decken, um ihre Biokompatibilität zu verbessern. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bilder zeigten, dass die IONP Räume der BNC-Matrix vorzugsweise in der Fibrille angeordnet waren Interlacing, aber einige von ihnen wurden auch entlang der BNC Bändern gefunden. Magnetkraftmikroskop-Messungen auf dem MBNC ausgeführt erfasst die Anwesenheit magnetischen Domänen mit hoher und schwache Intensität Magnetfeld, die magnetische Natur des MBNC Häutchen bestätigt. Young-Modul-Werte in dieser Arbeit erhaltenen auch in angemessener Übereinstimmung mit denen für mehrere Blutgefäße in früheren Studien berichtet.

Die Inkubationszeit von G. xylinus war insgesamt 9 Tage, aber die Häutchen begann früher zu bilden , und waren nach ca. 2 Tagen evident. Das makroskopische Erscheinungsbild des BNC ist in Figur 1 angezeigt, dessen Form nachahmt , dass der schalen gewachsenen Kultur. 2 beschreibt das Verfahren zur Herstellung von BNC-IONP Häutchen, welches die Hauptschritte in dem obigen Protokoll ebenfalls beteiligt Zusammenfassungen als die Anordnung der Hauptk...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer bakteriellen Nanocellulose (BNC) magnetisch für Anwendungen bei der Rekonstruktion geschädigter Blutgefäße. Das BNC wurde durch den Stamm G. xylinus synthetisiert. Andererseits wurde die Magnetisierung des BNC durch in situ Ausfällung von Fe2+ und Fe3+ Eisenionen innerhalb des BNC-Netzes realisiert.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bakterielle Nanozellulose, oder BNC, herzustellen und durch In-situ-Imprägnierung mit Eisenoxid-Nanopartikeln magnetisch zu machen. Magnetische BNC-Membranen sind dafür konzipiert, magnetisierte Zellen lokal anzuziehen und gegen den hämodynamischen Fluss festzuhalten. Der Hauptvorteil der in diesem Verfahren synthetisierten magnetischen BNC liegt darin, dass sie eine minimalinvasive Behandlung in der Nähe von Hirnaneurysmen ermöglicht.Herkömmliche Behandlungen von Gehirnaneurysmen wie das Abklemmen sowie die neuronale und vaskuläre Kerntrombose sind invasiv und traumatisch und für die meisten Patienten mit erhöhtem Risiko nicht geeignet. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie vaskulärer Erkrankungen, da vaskuläre Transplantate aus magnetischen Gerüsten die Heilung beschleunigen können, indem sie die Zellretention an der Verletzungsstelle verbessern. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung des flüssigen Kulturmediums, wie im Textprotokoll beschrieben.Übertragen Sie zwei Milliliter des flüssigen Kulturmediums in jedes Loch einer 24-Loch-Gewebekulturplatte. Nehmen Sie mit einer Inokulationsnadel zwei Kolonien von den in Schritt inokulierten Petrischalen und geben Sie sie in das erste Loch der Gewebekulturplatte. Wiederholen Sie denselben Vorgang für die verbleibenden 23 Löcher. Inkubieren Sie die Zellkulturschale bei 30 Grad Celsius für sieben Tage. Dies ergibt insgesamt 24 BNC-Pellicles mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Dicke von etwa 2 bis 3 mm. Sammeln Sie die BNC-Pellicles aus dem Wachstumsmedium und sterilisieren Sie sie in 200 Milliliter einer einprozentigen Natriumhydroxidlösung für eine Stunde bei 50 Grad Celsius, um alle Rückstände von G. xylinus zu entfernen.Entsorgen Sie die Lösung und geben Sie 200 Milliliter frisch zubereitete einprozentige Natriumhydroxidlösung hinzu. Wiederholen Sie denselben Vorgang noch einmal oder bis die BNC-Pellicles in Lösung eine durchscheinende Erscheinung annehmen. Spülen Sie die BNC-Pellicles dreimal mit Wasser ab und lagern Sie sie bei Raumtemperatur in hochreinem Wasser.Stellen Sie sicher, dass die BNC-Pellicles vollständig im Wasser eingetaucht sind und zu keinem Zeitpunkt austrocknen. Anschließend sterilisieren Sie die BNC-Pellicles im Autoklaven bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten. Um die Synthese zu beginnen, spülen Sie 1000 Milliliter hochreines Wasser mit Stickstoffgas durch, um den gelösten Sauerstoff aus dem Wasser zu entfernen und durch Stickstoff zu ersetzen.Verwenden Sie einen dreihalsigen Rundkolben, um eine Lösung im molaren Verhältnis von 2 zu 1 aus Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat und Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat herzustellen, die mit deoxygeniertem hochreinem Wasser verdünnt ist. Nutzen Sie zwei Hälse des Kolbens, um einen ständigen Ein- und Auslass von Stickstoffgas bereitzustellen, indem Sie die Stickstoffgaszufuhr an eine durch eine Septumstopfen gestochene Nadel anschließen, die am Hals des Kolbens befestigt ist. Geben Sie eine BNC-Pellicle zusammen mit den Reaktanten in den Kolben.Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in der Flüssigkeit eingetaucht ist. Füllen Sie daraufhin alle Glasverbindungen mit Vakuumfett. Verbinden Sie den verbleibenden Hals des Gefäßes mit einem Kühler, der oben mit einem Trockenrohr, gefüllt mit wasserfreiem Calciumsulfat, abgeschlossen ist.Lassen Sie Wasser durch das Kühlerrohr fließen. Erwärmen Sie anschließend die Lösung in einem Silikonölbad auf 80 Grad Celsius unter Verwendung einer heizbaren Rührplatte und halten Sie diese Temperatur konstant. Rühren Sie die Reaktionsansätze 5 Minuten lang mit einem kleinen magnetischen Rührstab bei 350 U/min.Stellen Sie sicher, dass die BNC angemessen mit der Eisensalzlösung imprägniert ist und die Reaktanten vollständig gelöst sind. Erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 700 U/min. Geben Sie innerhalb eines Zeitintervalls von fünf Minuten fünf Milliliter Ammoniumhydroxid zu den 10 Millilitern Eisensalzlösung hinzu, und verwenden Sie dazu eine Pipettiernadel, die in einen Septumverschluss gestochen wurde. Nach Zugabe des Ammoniumhydroxids wechselt die Farbe der Lösung von gelb-orange zu schwarz. Rühren Sie die Lösung weitere fünf Minuten bei 80 Grad Celsius weiter. Vermeiden Sie schnelles Rühren, um die Integrität der Probe zu bewahren. Senken Sie die Temperatur der Lösung mit dem Temperaturregelknopf des Heizrührers auf 30 Grad Celsius ab und rühren Sie weitere fünf Minuten weiter.Danach schalten Sie das Heizgerät aus. An diesem Punkt wurden die Eisenoxid-Nanopartikel in den BNC-Verbund eingebaut. Kühlen Sie die Mischung anschließend auf Raumtemperatur ab und überführen Sie sie in einen Kolben, um die magnetischen Nanopartikel (MNPs) und den BNC mithilfe eines starken Permanentmagneten zu trennen.Um dies durchzuführen, halten Sie den Magneten nahe am Gefäß, um die MNPs und BNC an ihrem Platz zu fixieren, während Sie den Überstand abgießen. Resuspendieren Sie die MNPs und BNC in 100 Milliliter Wasser. Schütteln Sie die Lösung vorsichtig, um alle MNPs zu entfernen, die nicht fest in die BNC eingebaut sind.Danach gießen Sie das Überstand erneut ab, indem Sie die MNPs und die BNC mit dem Magneten an ihrem Platz halten. Waschen Sie die MNPs und die BNC mehrmals mit Wasser, bis der Überstand einen neutralen pH-Wert erreicht, gemessen mit einem kolorimetrischen Streifen. Trennen Sie die magnetisch funktionalisierte BNC, oder MBNC, mithilfe einer Pinzette von den MNPs und spülen Sie die MBNCs mehrmals mit Wasser, bis das ablaufende Wasser klar ist.Sterilisieren Sie das MBNC, indem Sie es über Nacht der UV-Strahlung aussetzen. Lagern Sie das MBNC in 20 Milliliter deoxygeniertem, hochreinem Wasser, das bei 120 Grad Celsius 20 Minuten lang im Autoklaven sterilisiert wurde. Tauchen Sie die Probe aseptisch in ein Prozent Polyethylenglykol (PEG) ein und rühren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur. Die Beschichtung mit PEG verbessert die Biokompatibilität und Stabilität der Eisenoxid-Nanopartikel, die im BNC abgeschieden sind, da sie über das dreidimensionale Netzwerk des MBNC verteilt ist.Das makroskopische Erscheinungsbild des BNC wird hier gezeigt. Das Kulturgefäß bestimmt die Form der Pellicles. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt, dass feine Bänder die Mikrostruktur des BNC bilden, mit einem Durchmesser von etwa 50 Nanometern, die offene Poren über das gesamte Netzwerk hinweg erzeugen.Die magnetische Funktionalisierung des BNC führt im Vergleich zum BNC zu einer weniger verdichteten Fibrilstruktur. Die Eisenoxid-Nanopartikel befinden sich bevorzugt zwischen den durch Fibrilverschlingung gebildeten Poren. Die Rasterkraftmikroskopie-Topographie detektierte den magnetischen Kraftgradienten, der durch zwei Domänen an der MBNC-Oberfläche charakterisiert ist.Ein Magnetfeld mit hoher Intensität, dargestellt in Gelb, und ein Magnetfeld mit geringer Intensität, dargestellt in Grün. Das Vorhandensein magnetischer Domänen, beobachtet mittels MFM, wird durch Daten des vibrierenden Probenmagnetometers bestätigt, die zeigen, dass die Eisenoxid-Nanopartikel superparamagnetisch sind, wodurch die BNC magnetisch werden. Die Integrität der DNA in humanen Aorten-Smooth-Muskelzellen bleibt nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden erhalten, wenn die Zellen in Abwesenheit sowie in Gegenwart von BNC oder MBNC kultiviert werden, wie beim Vergleich mit Zellen deutlich wird, die einer Behandlung mit Wasserstoffperoxid unterzogen wurden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bakterielle Nanocellulose für Anwendungen in der Rekonstruktion beschädigter Blutgefäße magnetisch macht. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir einen Dichtegradienten aus magnetischen Nanopartikeln erzeugen mussten, die in der komplexen Matrix des bakteriellen Nanocellulose-Netzwerks dispergiert sein mussten. Um die Eisenoxid-Nanopartikel in dieses Netzwerk einzubinden, war es erforderlich, eine Methode während der Synthese der BNC anzuwenden.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da mehrere komplexe Schritte erforderlich sind, um Eisenoxid-Nanopartikel in BNC einzubringen.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Arias, S. L., et al. Herstellung einer funktionalisierten magnetischen bakteriellen Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikeln. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert die In-situ-Synthese von Magnetit-Nanopartikeln in einem bakteriellen Nanocellulose-Pellikel, das von Gluconacetobacter xylinus produziert wird. Es erklärt, wie magnetische bakterielle Nanocellulose durch Eisenioneninfusion, alkalische Fällung und Reinigung erzeugt wird.

Erzeugung von magnetit-eingebetteten bakteriellen Nanocellulose-Pellikeln

Quelle: Arias, S. L., et al. Herstellung einer funktionalisierten magnetischen bakteriellen Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikeln.  J. Vis. Exp. (2016).Dieses Video demonstriert die Herstellung von Nanocellulose durch die Kultivierung zelluloseproduzierender Bakterien in einem nährstoffhaltigen Medium mit Mannitol. Die Bakterien metabolisieren Mannitol zu Glukose, das dann polymerisiert und als Glukoseketten extrudieren wird, die zu Zellulosefolien kristallisieren und so eine...

Herstellung von bakteriellen Nanocellulose-Pellikeln aus zelluloseproduzierenden Bakterien

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Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

Erfahren Sie die Synthese magnetischer bakterieller Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikeln zur Rekonstruktion beschädigter Blutgefäße. Diese Methode ermöglicht minimale invasive Behandlungen bei Hirnaneurysmen.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

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