Name: Produktion von Nurr-1 spezifischen polyklonalen Antikörper Frei von Kreuzreaktivität gegen seine Close Homologe, Nor1 und Nur77 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Spezifität von Antikörpern gegen homologe Proteine durch Affinitätschromatographie erhöhen. Diese Methode entfernt kreuzreaktive Antikörper und verbessert die Zielgenauigkeit für präzise immunologische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse (NS070577 und NS084869) unterstützt.

Hinweis: Die Zusammensetzung aller nachstehend genannten Lösungen können in der Werkstoffe / Zubehör Tabelle gefunden werden. 1. Protein A Säule Reinigung der Antikörper <ol><li> Äquilibrieren ein Protein, eine Spin-Säule und alle benötigten Puffer auf Raumtemperatur 15 min vor dem Beginn des Verfahrens. </li><li> Verdünne das Immunserum 1: 1 mit Protein A IgG Bindungspuffer. (5 ml Serum wird empfohlen). </li><li> Klopfen Sie leicht ein Protein, eine Spin-Säule auf der Tischplatte, jede Harz, das in die Kappe eingelegt werden können, zu entfernen. Entfernen Sie die obere Kappe und sanft Snap aus dem Bodenverschluss. Legen Sie die Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube und lassen Speicherlösung ablaufen. </li><li> 5 ml Protein A IgG Bindungspuffer und die Lösung ablaufen. </li><li> Übernehmen Sie die verdünnt Immunserum an die Säule und sammeln Sie die Durchströmung. Für beste Ergebnisse, einen Probenvolumen, das eine Antikörperkonzentration als 80% der Antikörper-bindenden capacit der Spalte enthält wenigery. </li><li> Mit 15 ml Protein A-IgG-Bindungspuffer oder bis die Absorption bei 280 nm unter 0,1 Die Säule. </li><li> 100 l Neutralization Buffer zu fünf markierten Sammelröhrchen. </li><li> 5 ml der IgG Elutionspuffer auf Protein A-Säule und Sammeln Fraktionen von 1 ml in jedes der Rohre mit den 100 ul Neutralisierungspuffer. </li><li> Die Extinktion jeder Fraktion bei 280 nm und Poolfraktionen mit einer Absorption von mehr als 0,5. Halten Sie die vereinigten Fraktionen auf Eis, bis sie zur Dialyse. </li><li> Regenerieren die Säule durch Zugabe von 8 ml IgG Elution Buffer und lassen Sie die Lösung durch die Säule fließen. </li><li> Spülen der Säule mit Protein A IgG Bindungslösung, bis die Laufmittel pH wieder auf 7,4. </li><li> Bewahren Sie die Spalte durch Zugabe von 5 ml-Speicherlösung (0,02% Natriumazid in PBS). Wenn etwa 3 ml bleiben in der Spalte, Kappenboden und befestigen Sie die obere Abdeckung. Bewahren Sie die Spalte bei 4 ° C. </li><li> Bestimmen Sie die Länge of Dialyseschlauch nach der Anleitung des Herstellers erforderlich ist. Unter Verwendung von 16 mm Flachrohrdurchmesser verwenden 5.47 cm Rohrlänge pro ml Lösung, um dialysiert werden. Schneiden Sie den Schlauch und Spülen mit PBS, pH 7,4, für 15 bis 30 min. </li><li> Falten und Clip ein Ende der Dialyseschlauch, überweisen Sie den gepoolten IgG enthaltenden Fraktionen in einen Dialyseschlauch in PBS pH 7,4 ins Gleichgewicht gebracht, und schließen Sie das andere Ende. </li><li> Dialyse bei Raumtemperatur gegen 200 Volumina PBS pH 7,4 für 2 Stunden. </li><li> Ändern die Dialysepuffer (frisch PBS pH 7,4) dialysiert und für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Ändern Sie den Dialysepuffer (frisches PBS pH 7,4) dialysiert und über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Halten Sie die dialysiert Antikörperlösung bei 4 ° C, bis bereit, mit weiteren Reinigungsschritten fortfahren. </li><li> Bewertung der Antikörperkonzentration unter Verwendung seiner Absorption bei 280 nm und der molare Absorptionskoeffizient von Antikörpern bei 280 nm von 210.000 M -1 cm -1 12. </li></ol> 2. Kupplung von LBD Proteine, um die Kopplung Resin Aminolink <ol><li> Bereiten Sie zwei Spalten, eine für Nor1 und die andere für Nur77. Folgen Sie dem gleichen Protokoll sowohl Proteinen. </li><li> Aufzutauen, dass das Protein an das Harz auf Eis gekoppelt werden. Bestimmung der Proteinkonzentration unter Verwendung seines molaren Extinktionskoeffizienten und seine Absorption bei 280 nm 12. <ol><li> Alternativ können Sie einen Proteinbestimmung Assay wie dem Bicinchoninsäure-Assay 13. Wenn das Protein in einer aminhaltigen Puffer dialysiert oder Pufferaustausch gegen den Kopplungspuffer gelöst. Wenn das Protein in einem geeigneten Puffer (keine freien Amine) verdünnen 4fach in Kopplungspuffer. </li></ol></li><li> Ein 2-ml Harz für 2 mg Protein. Alle Schritte, die folgen, beziehen sich auf 2 ml Harz in einem 10-ml-Säule. Bis zu 10 mg Protein pro 1 ml Harz (: 1 Aufschlämmung 2 ml 1) verbunden werden. </li><li> Bereiten Sie eine 10 ml-Säule, indem Sie eine Fritte nach unten und läuft PBS pH 7,4 durch. Cap ter Boden der Säule und 2 ml Kopplungspuffer. </li><li> Fügen Sie das gewünschte Volumen an Schlamm (4 ml bis 2 ml Harz zu erhalten) an die Säule, entfernen Sie die Bodenkappe und lassen Sie die Spalte Drain. Spülen der Säule mit einer Gesamtzahl von 6 ml (3 Harz-Bettvolumen) Kopplungspuffer und damit der Säule ablaufen. Nach der Kupplungspuffer entleert, ersetzen Sie die Bodenkappe. </li><li> Hinzuzufügen 2-4 ml Protein in Kupplungspuffer suspendiert, um die Säule (keep ein Aliquot der Proteinlösung, um die Kopplungseffizienz, indem die Proteinkonzentration des Eluats in Schritt 2.11 unter Verwendung von entweder der Absorption bei 280 nm oder die Bicinchoninsäure-Assay zu beurteilen) . Kappe und mischen kopfüber, um eine homogene Lösung zu haben. </li><li> Wiegen Sie eine leere 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zu bewegen, um den Abzug. Sorgfältig über NaCNBH 3 (etwa 0,05 g) in der vorgewogen Rohr. Schließen Sie den Schlauch und wiegen die Röhrchen mit NaCNBH 3. Das Rohr Öffnen Sie nicht außerhalb der Haube. </li><li> Bezogen auf das GewichtNaCNBH 3 in das Rohr übertragen, machen Sie eine 5 M-Lösung durch Zugabe von 1 M NaOH. Das Molekulargewicht des NaCNBH 3 62,84 g deshalb 0,05 g gleich (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 Mol) 7,96 x 10 -4 mol ist. Um eine 5 M Lösung add (7,96 x 10 -4 / 5) 159 ul 1 M NaOH zu machen. </li><li> Messen Sie Gesamtvolumen der Reaktion der Einnahme des Harzvolumen in Betracht. In 10 ul 5 M NaCNBH 3 pro ml Reaktions. <ol><li> Zum Beispiel: für einen 4 ml Reaktionsvolumen werden 40 &amp; mgr; l von 5 M NaCNBH 3. 1 ml Harz und 3 ml zugesetztes Protein, das Gesamtvolumen von 4 ml. </li></ol></li><li> Verschließen Sie die Spalte und Mischen über Kopf. Befestigen Sie die Säule an einem Rohr Rotator und ließ die Reaktion über Nacht weiter bei 4 ° C. </li><li> Am Morgen bringen die Spalte an die chemischen Haube und entfernen Sie die Kappe so etwas Gas gebildet haben sorgfältig. Entleeren Sie die Säule in ein sauberes Röhrchen und speichern Sie das Eluat, das Protein con messentration mit der Absorption bei 280 nm Methode 12 oder die Bicinchoninsäure-Assay und vergleichen ihn mit dem Ausgangsprotein-Konzentration in Schritt 2.6. </li><li> Das Harz wird mit 4 ml Kopplungspuffer und lassen Sie die Spalte Drain. </li></ol> 3. Blocking Verbleibende Seiten <ol><li> Mit 4 ml Puffer Abschrecken Waschen des Harzes. Abtropfen lassen und ersetzen Sie die Bodenkappe. 2 ml Puffer und Abschrecken auszusetzen Harzes. </li><li> Beurteilung des gesamten Reaktionsvolumens durch Messung der Harzvolumen und das Abschrecken Puffervolumen dann werden 10 ul 5 M NaCNBH 3 pro ml Reaktionsvolumen. </li><li> Vorsichtig mischen bei Raumtemperatur für 30 min End-Over-End. Nach 30 Minuten bringen Sie die Spalte in der Abzugshaube. Entfernen Sie vorsichtig die obere und dann die untere Kappe und lassen Sie die Spalte Drain in einen Abfallrohr. </li><li> Mit 5 Harzvolumina Waschlösung Die Säule. Überwachen Sie die Waschanlagen für die Anwesenheit von Restproteine ​​durch Messung des Eluats der absorbance bei 280 nm. Entkoppelt Proteine ​​werden durch die hohe Salzkonzentration gewaschen. </li><li> Mit 6 ml entgastem PBS pH 7,4, enthaltend 0,02% Natriumazid Waschen des Harzes. Halten der Säule auf 4 ° C, bis es benötigt. </li></ol> 4. Reinigung von Nurr1 spezifischer Antikörper <ol><li> Spülen Sie die Nur77 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie das abgelassen Nur77 LBD gekoppelt Säule in ein neues 15 ml Sammelröhrchen. </li><li> 5 ml Protein A-gereinigten Anti-Nurr1-Antikörpern, die Kappe die Säule und den Platz auf einem Schüttler bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch. Beiseite auf Eis, bis bereit gesetzt, um zum Nor1 LBD gekoppelt Spalte hinzuzufügen. </li><li> Spülen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube. </li><li> In den Fluss durch von der Nur77 Putsch LBDLED-Säule vom Säule und auf einem Rotator bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch. </li><li> Messung der Antikörperkonzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm. </li></ol> 5. ELISA-basierte Analyse von gereinigten Anti-Nurr1 Antikörper <ol><li> 100 l Protein (2,5 ug / ml) in die Vertiefungen einer 96 Well-Platte. Wenn die Prüfung 3 verschiedene Proteine ​​wird mit 100 ul Protein 1 die Vertiefungen A1 bis H4 wurden 100 ul Protein 2, die Vertiefungen A5 bis H8 und 100 &amp; mgr; l von Protein 3 zu Vertiefungen A9 bis H12. Die Platte und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zweimaliges Waschen der beschichteten Wells mit 300 ul pro Napf an PBS, pH 7,4 und 300 ul ELISA Blockpuffer an die gesamte Antigen-beschichteten Vertiefungen und inkubiert 2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Während die Platte blockiert Vorbereitung eines gewünschten Ausgangsverdünnung von gereinigtem anti-Nurr1-Antikörper (im Bereich von 10 bis 100 ug / ml) im ELISA Blockpuffer. </li><li> Nach 2 Stunden der Sperrung, ersetzen Sie den ELISA-Blockpuffer mit 100 ul frisch ELISA-Blockpuffer in alle Vertiefungen. </li><li> 100 l des verdünnten gereinigten anti-Nurr1 Antikörper in jede Vertiefung in der Reihe A. Seriell verdünnte die Antikörper durch die Übertragung von 100 ul der Lösung von Reihe A zu den Vertiefungen in der Reihe B, gefolgt von Übertragen von 100 ul der Lösung von Reihe zu Reihe B C Fortsetzung auf G. rudern Nach dem Mischen der Lösungen in den Vertiefungen in der Reihe G entsorgen Sie die zusätzliche 100 ul. Wells in Reihe H erhalten nur die ersten 100 l Blocking-Puffer. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Drei (3) mal mit 300 ul pro Vertiefung von 0,05% Tween 20 waschen Sie die Platte in PBS pH 7,4 und trocknen Sie die Platte, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen. </li><li> 100 l Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG ELISA in Blockpuffer verdünnt (1: 8.000 Verdünnung; der typische Bereich von 1: 5.000 bis 1: 25.000). Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie die Platte threie (3) mal so in 5.6 beschrieben. Spülen Sie alle Vertiefungen durch mit 300 ul entionisiertem Wasser füllt sie. Tupfen Sie überschüssiges Wasser durch Umdrehen der Platte auf absorbierendes Papier. </li><li> Füge 100 ul 3, 3 &#39;, 5, 5&#39; Tetramethylbenzidin (auf Raumtemperatur erwärmt) in jede Vertiefung und inkubiert 15 bis 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 NH 2 SO 4. </li><li> Extinktion bei 450 nm subtrahiert Hintergrund bei 650 nm. </li></ol>

<ol><li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li>
<li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor%2C+NURR1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li>
<li>Zetterström, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li>
<li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li>
<li>Peña de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3%2Fnurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li>
<li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB%3ACBP-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li>
<li>Colón-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus%3A+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li>
<li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li>
<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Erfolg dieses Protokoll beruht auf der Verfügbarkeit von reinen Proteinen zur Charakterisierung von Antikörpern gegen ein bestimmtes Mitglied der Proteinfamilie von Interesse angehoben. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Antikörper unter Verwendung von Protein A / G bis zum deutlich festgestellt, dass es signifikante Kreuzreaktivität mittels ELISA und Western-Blotting zu reinigen. Wie im Text erwähnt, ist es wichtig zu vermeiden, Suspendieren des Proteins (en) werden auf der Säule in...

Der Transkriptionsfaktor Nurr1 und seinen Homologen (Nur77 und Nor1) gehören zu der Kernrezeptorfamilie 4A (NR4A) 1. Sie sind auch Orphanrezeptoren weil ihre endogene Liganden noch nicht identifiziert. Nurr1 wurde erstmals 1992 kloniert, und obwohl bekannt ist, im Gehirn 2 ausgedrückt werden, wurde ihre wesentliche Rolle für die Entwicklung und Wartung von Mittelhirnneuronen mit Dopamin-knockout Maus-Studien 3 offenbart. Außerdem wurde seine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Dopamin-Neuronen im Mittelhirn vor kurzem von einem Knockout-Studie 4 gezeigt. Aufgrund dieser eleganten Studien zeigen Nurr1 kritische Rollen für Dopamin-Neuronen im Mittelhirn, viele nachfolgende Untersuchungen weitgehend auf die Dopamin-Neuronen im Mittelhirn und Dopamin bezogene neurodegenerative Erkrankung konzentriert, Parkinson-Krankheit (PD) 5. Bemerkenswert ist, Nurr1 nicht nur in den Mittelhirn Dopamin (MDA) Neuronen, sondern auch in di ausgedrücktVers Gehirnbereichen 2, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise funktionelle Rolle in vielen nicht-DA Bereichen, die stark durch neuere Studien zeigen, dass Nurr1 spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Hirnfunktionen unterstützt wird. Beispiele wurde wie Lern gezeigt, dass die Speicher-induzierende Aktivitäten oder andere Hippocampus abhängigen Aufgaben ergeben sich im Hochregulierung von Nurr1-Expression im Hippocampus 6,7. Darüber hinaus nach unten von Nurr1-Expression im Hippocampus Klopf war ausreichend, um das Langzeitgedächtnis und / oder der synaptischen Plastizität 8-11 beeinträchtigen, was stark darauf hinweist, daß Nurr1 spielt verschiedene Rollen in vielen Bereichen des Gehirns. Um somit die zelltypspezifisch und subzellulären Expression Nurr1 weiter zu verstehen, ist es wünschenswert, Nurr1-spezifische Antikörper, die keine Kreuzreaktivität gegenüber seinen Homologen oder Nur77 Nor1 nicht aufweisen, zu verwenden. Dieses Papier beschreibt eine Pre-Adsorption-Protokoll, um Nurr1-spezifische Antikörper vorhanden und zusätzliche Daten, die seine Spezifität zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>Aufgereinigte Ligandenbindungsdomäne aus Nurr1, Nor 1 und Nur77</td><td></td><td></td><td>Säulenspeicherlösung</td></tr><tr><td>AminoLink Kupplungsharz und Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Spin-Säule</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Platten mit flachem Boden, hoher Flansch, 330 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Normales Ziegenserum</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Milchverdünnungsmittel / Blockierungskonzentrat</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG-Elutionspuffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Harz</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydin</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Feinchemikalien</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protein A IgG-Bindungspuffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG-Elutionspuffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Säule Lagerlösung</td><td></td><td></td><td>Phosphat gepuffert Kochsalzlösung mit 0,02 % Natriumazid</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 vorbehandelter Dialyseschlauch</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Einwegsäulen</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink Kupplungspuffer</td><td></td><td></td><td>0,1 M Natriumphosphat, 0,05 % NaN3, pH 7,0</td></tr><tr><td>Quenching Puffer</td><td></td><td></td><td>1M Tris. HCI, 0,05 % NaN3, pH 7,4</td></tr><tr><td>Waschlösung</td><td></td><td></td><td>1 M NaCl, 0,05 % NaN3</td></tr><tr><td>ELISA-Blockierungspuffer</td><td></td><td></td><td>1 % normales Pferdeserum (NHS), 1 % normales Ziegenserum (NGS) in 1X KPL Milchverdünnungsmittel</td></tr><tr><td>Lagerlösung</td><td></td><td></td><td>PBS pH 7,4 mit 0,02 % Natriumazid</td></tr><tr><td>Mikropipetten: 10 &mu; l; 20 &mu; l; 200 &mu; l; 1000 &mu; l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produktion von nurr-1 spezifischen polyklonalen antikörper frei von kreuzreaktivität gegen seine close homologe, nor1 und nur77

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Die Kernrezeptor-Unterfamilie 4 (NR4A) besteht aus 3 verwandten Proteinen, die sich eine DNA-Bindungsdomäne (DBD) und eine Ligandenbindungsdomäne (LBD) teilen. Das nukleäre Rezeptor-verwandte 1-Protein (Nurr1 oder NR4A2) spielt eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung des dopaminergen Systems. Zu den Dopamin-Dysfunktionen, die mit dem Nurr1-Gen verbunden sind, gehören unter anderem die Parkinson-Krankheit, Schizophrenie und manische Depressionen. Darüber hinaus deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Nurr1 auch in anderen Hirnbereichen wie dem Hippocampus exprimiert wird und eine entscheidende Rolle für Lernen und Gedächtnis spielt. Die anderen Mitglieder der Familie sind der Nervenwachstumsfaktor IB (Nur77 oder NR4A1) und der von Neuronen abgeleitete Orphan-Rezeptor 1 (NOR1 oder NR4A3). Um die genaue funktionelle Rolle von Nurr1 bei dopaminergen und anderen neuronalen Dysfunktionen der Gehirnregion zu untersuchen, wurden Antikörper benötigt, die keine Kreuzreaktivitäten gegen Nur77 und NOR1 aufweisen. Da die Proteine in ihren LBDs stärker voneinander abweichen als in ihren DNA-Bindungsdomänen, sollte die Immunisierung mit gereinigten LBDs Antikörper liefern, die spezifisch für Nurr1 sind, mit minimalen Reaktivitäten gegen Nur77 und/oder NOR1. Obwohl es gelang, Anti-Nurr1-Antikörper zu erzeugen, zeigten diese eine signifikante Immunreaktivität gegen die anderen Mitglieder der Familie. Die Affinitätschromatographie über immobilisiertem Protein A, gefolgt von einer Präadsorption gegen immobilisierte Nur77- und NOR1-LBDs, ergab Nurr1-spezifische Antikörper ohne Kreuzreaktivität. Hier zielen wir selektiv auf Antikörper gegen ein bestimmtes Mitglied einer hochkonservierten Proteinfamilie ab, indem wir Tiere mit ihren unterschiedlichsten Regionen immunisieren und anschließend kreuzreaktive Antikörper durch Präadsorption entfernen. Ziel des Protokolls ist es, die Spezifität polyklonaler Antikörper durch Präadsorption gegen kreuzreaktive Antigene zu erhöhen.

Ein Vergleich der Protein A-Säule gereinigt Nurr1-spezifische Antikörper mit Protein A gereinigter anti-Nurr1-Antikörper, gefolgt von Passage durch Nur77 LBD und Nor1 LBD Spalten ist in Figur 1 dar. Wie gezeigt ist ersichtlich, Protein A-gereinigten Nurr1-Antikörper zeigte eine starke Bindungs um Nurr1 LBD. Jedoch zeigte sich auch eine signifikante Bindung an Nur77 LBD und Nor1 LBD. Wenn Protein A-gereinigten Antikörper wurden Nurr1 weiter gegen Nur77 LBD und Nor1 LBD endgültigen affinitätsgereinigtem N...

Hier zielen wir selektiv auf Antikörper gegen ein spezifisches Mitglied einer hochkonservierten Proteinfamilie ab, indem wir Tiere mit ihren unterschiedlichsten Regionen immunisieren, gefolgt von der Entfernung kreuzreaktiver Antikörper durch Präadsorption.

Produktion von Nurr-1 spezifischen polyklonalen Antikörper Frei von Kreuzreaktivität gegen seine Close Homologe, Nor1 und Nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Spezifität von Antikörpern gegenüber eng verwandten Proteinen zu erhöhen, indem kreuzreagierende Antikörper entfernt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteinbereiche mit der größten Divergenz zwischen homologen Proteinen identifiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese Proteinbereiche zu exprimieren und zu reinigen.Anschließend werden diese Proteindomänen über das N- oder C-Terminus an eine Chromatographiematrix gekoppelt. In dieser Demonstration wird Spheros verwendet. Der letzte Schritt besteht darin, das Immungemisch mit Harzen zu inkubieren, die an die jeweils kreuzreagierenden Domänen gekoppelt sind.Schließlich werden ELISA und Western Blotting durchgeführt, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung monoklonaler Antikörper oder der Affinitätsreinigung besteht darin, dass wir die Affinität gegenüber dem gewünschten Ziel beibehalten können, während wir bekannte kreuzreaktive Epitope eliminieren. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da das Protein, das sie untersuchen möchten, instabil ist.Dr. Uri Kim, ein Postdoktorand aus unserem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Diese Studie erfordert zwei Säulen, eine für das aus Neuronen stammende Waisenrezeptorprotein, auch bekannt als nor1, und eine andere für das NER-Wachstumsfaktorprotein IB oder nor77. Da derselbe Protokollablauf für beide Proteine gilt, wird nur die Herstellung einer Säule gezeigt.Tauen Sie das Protein, das an die Harzmatrix gekoppelt werden soll, auf Eis auf und bestimmen Sie anschließend die Protein-Konzentration unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten und der Absorption bei 280 Nanometern. Verwenden Sie zwei Milliliter Harz pro zwei Milligramm Protein. Alle folgenden Schritte beziehen sich auf zwei Milliliter Harz.In einer 10-Milliliter-Säule bereiten Sie eine 10-Milliliter-Säule vor, indem Sie eine FR bis zum Boden drücken und PBS pH 7,4 hindurchlaufen lassen. Verschließen Sie das untere Ende der Säule und geben Sie zwei Milliliter Kopplungspuffer hinzu. Geben Sie vier Milliliter der Suspension in die Säule, um zwei Milliliter Harz zu erhalten.Entfernen Sie die untere Kappe und lassen Sie die Säule ablaufen. Spülen Sie die Säule mit insgesamt sechs Milliliter oder drei Säulenvolumina an Kopplungspuffer und lassen Sie den Puffer ablaufen. Nach dem Ablaufen des Kopplungspuffers setzen Sie die untere Kappe wieder auf.Fügen Sie anschließend zwei bis vier Milliliter des in Kopplungspuffer suspendierten Proteins der Säule hinzu. Heben Sie eine Aliquotprobe der Proteiniösung auf, um die Kopplungseffizienz zu bewerten. Verschließen Sie die Säule später und mischen Sie sie end-over-end.Um eine homogene Lösung herzustellen, messen Sie das Gesamtvolumen der Reaktion unter Berücksichtigung des Harzvolumens und geben Sie 10 Mikroliter Fünf-Molar-Natriumsanoborhydrid pro Milliliter Reaktionsvolumen hinzu. Verschließen Sie die Säule und mischen Sie sie kopfüber-kopfunter. Befestigen Sie die Säule an einem Röhrenrotator und lassen Sie die Reaktion über Nacht weiterlaufen.Am nächsten Morgen bei vier Grad Celsius nehmen Sie die Säule vorsichtig in die chemische Abzugshaube und entfernen Sie die Kappe, da sich möglicherweise etwas Gas gebildet hat. Lassen Sie die Säule in ein sauberes Gefäß ablaufen und bewahren Sie das Ilu auf. Die Proteinkonzentration des IIT wird gemessen und mit der Ausgangsproteinkonzentration verglichen.Um die Kopplungseffizienz zu beurteilen, waschen Sie das Harz mit vier Millilitern Kopplungspuffer und lassen Sie die Säule abtropfen. Sobald die Ligandenbindungsdomäne oder LBD an das Harz gekoppelt wurde, besteht der nächste Schritt darin, die verbleibenden Bindungsstellen zu blockieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, waschen Sie das Harz mit vier Millilitern Puffer zum Abblocken, lassen Sie es abtropfen und ersetzen Sie die untere Kappe.Geben Sie zwei Milliliter Puffer zur Reaktionsbeendigung hinzu und suspendieren Sie die Harzpartikel. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen der Reaktion durch Messung des Harzvolumens und des Volumens des Puffers zur Reaktionsbeendigung. Fügen Sie 10 Mikroliter einer fünf Molaren Natriumcyanborhydrid-Lösung pro Milliliter Reaktionsvolumen hinzu.Vorsichtig 30 Minuten bei Raumtemperatur mischen. Am Ende der 30 Minuten die Säule in die Abzugshaube bringen. Vorsichtig die obere Kappe entfernen, dann die untere Kappe abnehmen und die Säule in ein Abfallgefäß entleeren lassen.Spülen Sie die Säule mit fünf Resin-Volumina Spüllösung. Überwachen Sie die Spülgänge auf das Vorhandensein von Restproteinen, indem Sie die Extinktion bei 280 Nanometern messen. Ungebundene Proteine werden durch die hohe Salzkonzentration ausgewaschen. Spülen Sie das Resin abschließend mit sechs Millilitern DGAs PBS, das 0,02 % Natriumazid enthält. Bewahren Sie die Säule bei vier Grad Celsius auf, bis sie verwendet wird.Beginnen Sie das Verfahren zur Reinigung spezifischer Antikörper gegen Neuroein, indem Sie die mit NORE 77 LBD gekoppelte Säule mit 10 Millilitern PBS spülen und die Säule ablaufen lassen. Verschließen Sie das untere Ende der Säule und stellen Sie die durchgelaufene, mit Neuro 77 LBD gekoppelte Säule in ein neues 15-Milliliter-Sammelröhrchen. Geben Sie 5 Milliliter des Proteins, gereinigte Anti-Neuroein-Antikörper, auf die Säule und verschließen Sie sie. Stellen Sie die Säule eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einen Rotator.Entfernen Sie anschließend die oberen und unteren Verschlüsse und sammeln Sie den Durchlauf. Stellen Sie den Durchlauf bis zum Zeitpunkt der Zugabe zum nor auf Eis. Eine LBD-gekoppelte Säule.Spülen Sie die nor-eine-LBD-gekoppelte Säule mit 10 Milliliter PBS und lassen Sie die Säule ablaufen; verschließen Sie das untere Ende der Säule und stellen Sie die nor-eine-LBD-gekoppelte Säule in ein 15-Milliliter-Sammelröhrchen. Geben Sie das Durchflussvolumen der north-77-LBD-gekoppelten Säule hinzu. Verschließen Sie die Säule und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotor.Nach einer Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Verschlüsse und sammeln Sie den Durchlauf. Messen Sie die Antikonzentration, indem Sie die Absorption bei 280 Nanometern messen.Der gereinigte Anti-Nore-Eins-Antikörper wird anschließend mittels ELISA analysiert. Geben Sie 100 Mikroliter Protein in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Falls drei verschiedene Proteine getestet werden, geben Sie 100 Mikroliter Protein eins in die Vertiefungen A1 bis H4, 100 Mikroliter Protein zwei in die Vertiefungen A5 bis H8 und 100 Mikroliter Protein drei in die Vertiefungen A9 bis H12. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius bis zum folgenden Morgen. Waschen Sie die beschichteten Vertiefungen zweimal mit je 300 Mikrolitern PBS pro Vertiefung. Geben Sie anschließend 300 Mikroliter Eliza-Blockpuffer in alle antigenbeschichteten Vertiefungen und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur.Nach zwei Stunden der Blockierung ersetzen Sie den ELISA-Blockpuffer in jedem Well durch 100 Mikroliter frischen ELISA-Blockpuffer. Geben Sie 100 Mikroliter verdünnter, gereinigter Anti-EU-eins-Antikörper zu allen Wells in Reihe A hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.Spülen Sie die Platte dreimal mit 0,05 % Tween 20. Nach dem dritten Spülschritt tupfen Sie die Platte, um überschüssige Waschpufferlösung zu entfernen. Geben Sie 100 Mikroliter mit Meerrettichperoxidase markierten, konjugierten Ziegen-Anti-Hasen-IgG, verdünnt in ELISA-Blockierpuffer, in jedes Loch und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde spülen Sie die Platte erneut dreimal mit 0,05 % Tween 20, wie zuvor beschrieben. Nach dem dritten Spülschritt. Spülen Sie alle Vertiefungen, indem Sie diese mit 300 Mikrolitern entionisiertem Wasser füllen, und entfernen Sie überschüssiges Wasser, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier stürzen. Geben Sie 100 Mikroliter von drei drei Strich, fünf, fünf Strich Tetraethylbenzidin in alle Vertiefungen, erwärmen Sie auf Raumtemperatur und inkubieren Sie 15 bis 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter zwei normaler Schwefelsäure zu jeder Vertiefung hinzufügen.Zuletzt die Extinktion bei 450 Nanometern messen. Die Hintergrundabsorption bei 650 Nanometern subtrahieren. Ein Vergleich von Protein. Ein gereinigter Antikörper ohne spezifische Bindung zum Protein.Ein gereinigter Anti-Noro-one-Antikörper, der über No-77-LBD- und No-one-LBD-Säulen geleitet wurde, zeigte, dass der protein-Agereinigte Anti-No-one-Antikörper stark an No-one-LBD bindet. Er zeigte jedoch auch eine signifikante Bindung an No-77-LBD und an No-one-LBD. Eine weitere Reinigung des Anti-No-one-Antikörpers gegen No-77-LBD und No-one-LBD entfernte diese Kreuzreaktivität vollständig. Diese Spezifität wurde weiterhin durch eine Western-Blot-Analyse von Extrakten aus Zellen bestätigt, die mit Expressionsvektoren transfiziert wurden, die Mick-markierte, vollständige Nor-one-, Nor-one- und Nor-77-Proteine enthielten. Anti-Mic-Antikörper zeigten, dass jedes vollständige Protein bei seinem erwarteten Molekulargewicht exprimiert wurde. Protein-Agereinigter Anti-Nor-one detektierte robust das vollständige Nor-one-Protein, erkannte jedoch auch Nor-one und Nor-77, wenn auch weniger effizient.Im Gegensatz dazu zeigte der vollständig gereinigte Nor-1-Antikörper keinerlei nachweisbare Kreuzreaktivität gegenüber Nor-1 und Nor-77. Die immunhistochemische Analyse von Mittelhirn-Dopaminneuronen mit dem vollständig gereinigten Nor-1-Antikörper bestätigte die starke Expression von Nor-1. Die Verwendung von Tyrosinhydroxylase zeigte zudem, dass Neuro-1 ebenfalls ausschließlich im Zellkern von Dopaminneuronen des Mittelhirns im Bereich der Substantia nigra exprimiert wird. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumhydrid äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter einem Abzug, während Sie dieses Verfahren durchführen.

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern gegen Metallopeptidase. Rekombinante Plasmide, die Gene für den Antikörper, das grün fluoreszierende Protein und die Antibiotikaresistenz tragen, werden mit Lipofectamin in Epithelzellen transfiziert. Die transfizierten Zellen werden selektiert und kultiviert, um rekombinante Antikörper zu erzeugen.

Ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Antikörper gegen Metallopeptidase

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Hier beschreiben wir eine Methode zum Ausdruck bringen und eine hohe Qualität Norovirus vorstehende (P) Domänen in E. reinigen coli für die Verwendung in der Röntgenkristallographie Studien. Dieses Verfahren kann auf andere Calicivirus P Domänen angewendet werden, sowie Nicht-Strukturproteine, dh., Virales Protein - Genom-linked (VPg), Protease und RNA - abhängige RNA - Polymerase (RdRp).

Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in<em&gt; E. coli</em&gt; Für Röntgenkristallographie

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Wir drückten ectopically NR1 Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins in den menschlichen embryonalen Zellen (HEK293) als Antigen Autoantikörper gegen NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht mit autoimmune Enzephalitis zu erkennen. Diese einfache Methode möglicherweise zu screening-Zwecken in klinischen Umgebungen geeignet.

Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Hier präsentieren wir eine zellbasierte Flow-zytometrie-Methode zur Erkennung neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien in einer menschlichen Matrix wie zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF) oder Humanserum stören.

Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

Das rekombinante Antikörperprotein, das in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen und monoklonalen Antikörpern, die mit der traditionellen Hybridomtechnologie hergestellt werden, exprimiert wird, kann das porcine Aminopeptidase N (APN)-Protein erkennen und daran binden.

Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel des Schweins

Die Messung der Giermoment des angebundenen Drosophila mit dem Drehmoment-Meter ermöglicht die Neurowissenschaftler exquisite Kontrolle der Reizsituation des Versuchstieres. Zusammen mit dem einzigartigen genetischen Werkzeuge in der Fruchtfliege, ist dieses Paradigma für eine Vielzahl von neurobiologischen Forschung eingesetzt.

Operanten Lernens von Drosophila an der Torque Meter

Erfahren Sie, wie Sie die Spezifität von Antikörpern gegen homologe Proteine durch Affinitätschromatographie erhöhen. Diese Methode entfernt kreuzreaktive Antikörper und verbessert die Zielgenauigkeit für präzise immunologische Anwendungen.

Produktion von Nurr-1 spezifischen polyklonalen Antikörper Frei von Kreuzreaktivität gegen seine Close Homologe, Nor1 und Nur77

Weitere Videos entdecken