Name: Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Primärkultur von Endothelzellen aus der Maus-Aorta ohne spezielle Ausrüstung. Diese Methode liefert hohe Zellviabilität und Ausbeute für kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Studie wird unterstützt durch den American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 und den National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). Wir danken Roberto Mendez von der Wayne State University für die Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.

1. Isolierung von Aorta von Mäusen Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von der Wayne State University genehmigt. <ol><li> Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer der Anästhesiemaschine. Stellen Sie die Isofluran - Flow auf 4% in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O 2. Anesthetize die Maus durch Inhalation von Isofluran (4% für die Induktion, ± 1,0% für die Wartung) in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O 2 über Induktionskammer durch einen eigenen Bugnase gefolgt. HINWEIS: Anästhesie mit Isofluran kann in 75% Sauerstoff / 25% Luft oder 100% Sauerstoff zugeführt werden. </li><li> Überprüfen Sie die Maus alle 5 Minuten, bis die angemessene Höhe der Anästhesie erreicht ist (Mangel an Rückzug bis Fuß Prise). </li><li> Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und weiter Isofluran Inhalation obwohl die spezielle Nasenkegel, die mit dem Anästhesiegerät angeschlossen ist. Schalten Sie dieIsofluran fließen zu 1% Anästhesie aufrechtzuerhalten. </li><li> Während es unter Narkose ist, legen Sie die Maus auf eine Operation Pad, auf dem Rücken positioniert. Verwenden Labor Band, die Glieder zu sichern. </li><li> Verwenden Sie eine Wärmelampe die Maus warm zu halten. Halten Sie die Lampe in einem angemessenen Abstand von der Maus, so dass die Maus nicht überhitzen. </li><li> Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden Sie Dissektion Schere den Bauch von der Mittellinie zu öffnen und die Bauchaorta aussetzen. Öffnen Sie die Brusthöhle und setzen das Herz und die Lunge. </li><li> Schneiden Sie die Bauchaorta in der Mitte mit Dissektion Schere, um das Blut zu lösen. </li><li> Füllen einer 1 ml Spritze (25 G Nadel) mit 1 ml PBS, enthaltend 1,000 U / ml Heparin. Injizieren PBS, enthaltend 1,000 U / ml Heparin zu dem linken Ventrikel und die Aorta perfundieren. Schieben Sie das Herz und die Lunge mit einer Pinzette an den großen Arterien auf die rechte Seite der Mäuse der thorakalen Aorta zu belichten. </li><li> Entfernen Sie schnell die Brustaorta Mikro di mitssection Zange und legte sie in eiskaltem 1x PBS (steril), transportieren dann den Behälter in eine laminare Luftströmung Haube. </li><li> Legen Sie eine 1-ml-Spritze mit 25 G-Nadel in ein Ende der Aorta eingesetzt und sanft die Aorta mit eiskaltem PBS spülen das Blut zu entfernen. </li><li> Verwenden einer Pinzette Mikrodissektion so viel des anhänge Fettgewebe und kleine seitliche Gefäße wie möglich zu entfernen. </li><li> Unmittelbar nach der Aorta übertragen Wachstumsmedium an Endothelzellen. </li><li> Schneiden Sie die Aorta in 1 mm Ringe ein steriles Skalpell verwendet wird. Ernte etwa 8 - 10 Ringe pro Aorta. </li><li> Öffnen Sie jeden Aorten-Ring ein Paar von Mikro-Dissektion Schere. </li></ol> 2. Seed die Aorten-Segmente auf Matrix <ol><li> Wenn nicht in Gebrauch, halten den Wachstumsfaktor reduzierte Matrix in 20 ° C Erstarrungs zu verhindern. Setzen Sie den Wachstumsfaktor reduzierte Matrix in 4 ° C mindestens über Nacht ein komplettes Tauwetter zu ermöglichen. </li><li> Vorkühlung eine 6-Well-Platte und Pipettenspitzen bis -20 ° C für mindestens10 Minuten. Legen Sie die 6-Well-Platte auf Eis und Mantel eine Vertiefung der Platte mit 1 ml Matrix ohne Luftblasen einzuführen. Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten die Matrix zu ermöglichen, sich zu verfestigen. </li><li> Implantieren Sie die Aorten-Stücke auf die verfestigte Matrix mit sterilen Mikro-Dissektion Pinzette. Legen Sie die Stücke Lumen-Seite nach unten auf die Matrix ohne das Endothel zu berühren. Platzieren von 3 bis 4 aortic Segmente nahe beieinander auf der Matrix. </li><li> In gerade genug endothelialen Zellwachstumsmedium zu halten Segmente nass (~ 200 ul). </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C unter 5% CO 2 für 4 bis 6 h. Am Ende des Tages, fügen Sie einfach genug Medium die Aorten-Segmente abzudecken. </li><li> Beachten Sie die Aorten-Segment in regelmäßigen Abständen unter einem Phasenkontrastmikroskop sprießen. Überprüfen mittleren Ebene und das Zellwachstum pro Tag. In Medium bei Bedarf abgedeckt Aorten-Segmente zu halten. </li><li> Am 4. Tag, entfernen Sie das Medium und entfernen Sie die Aorten - Segmente fROM mit der Matrix mit einer sterilen Nadel ohne die wachsenden Endothelzellen zu unterbrechen. </li><li> In 2 ml neuen endothelialen Zellwachstumsmedium und damit die Endothelzellen weiterhin auf Matrix 2 zu vermehren - 3 Tage. </li></ol> 3. Erste Passagierung der Maus Aortic Endothelial Cells <ol><li> Mantel ein neuer T12.5 Kolben mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Matrixplatten vorsichtig mit sterilem PBS 37 ° C. </li><li> In 2 ml neutralen Proteinase (50 U / ml) auf die Matrixplatten und Inkubation bei Raumtemperatur auf Wippschüttler mit gelegentlichem Schütteln. Schauen Sie sich die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop die Mehrzahl der Zellen, um sicherzustellen, abgelöst werden. </li><li> 2 mL D-Val in die neutrale Proteinase zu inaktivieren. </li><li> Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Platte mit 2 ml D-Val und sammeln den Überstand. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 g für 5 min bei room Temperatur. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml Endothelzellen-Wachstumsmedium und der Platte in dem T12.5 Kolben mit Gelatine beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 h. </li><li> Ersetzen Sie das Medium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 , bis sie 85% - 90% konfluent. </li></ol> 4. Passagierung der Maus Aortic Endothelial Cells <ol><li> Mantel zwei neue T12.5 Kolben mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Vorheizen Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 0,02 EDTA in PBS) und sterile PBS bei 37 ° C für etwa 15 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einer sterilen 37 ° C PBS. </li><li> In 0,5 ml Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 0,02 EDTA in PBS) und Inkubation bei 37 ° C für ca. 1 min oder bis die Mehrzahl der Zellen umdrehen. </li><li> 2 mL endothelialen Zellwachstumsmedium, das die Verdauung zu stoppen. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten in den Kolben mehrmals. Verwenden Sie bei Bedarf eine ZelleSchaber um die Zellen zu sammeln. </li><li> Sammeln der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml Endothelzellen-Wachstumsmedium und der Platte in 2 T12.5 Kolben mit Gelatine beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 h. </li><li> Ersetzen Sie das Medium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 , bis sie 85% - 90% konfluent. </li><li> Verwenden Sie die Maus Aorten-Endothelzellen nach 2 - 3 Passagen. </li></ol> 5. Charakterisierung der Maus Aortic Endothelial Cells <ol><li> Re-Platte die Zellen. <ol><li> Mantel eine 6-well-Platte mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Spülen Sie die Platte mit PBS. </li><li> Vorheizen Trypsin-EDTA und sterilem PBS auf 37 ° C für etwa 15 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit steriler PBS 3 mal. In 0,5 ml Trypsin / EDTA zu den Zellen, Inkubation für ca. 1 min bei 37 ° C or, bis die Mehrheit der Zellen umdrehen. </li><li> 2 mL endothelialen Zellwachstumsmedium, das die Verdauung zu stoppen. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten in den Kolben mehrmals. Verwenden Sie bei Bedarf einen Zellschaber um die Zellen zu sammeln. </li><li> Sammeln der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand verwerfen, wieder die Zellen in endothelialen Zellwachstumsmedium. Samen , die Zellen in 6-Well - Platte , beschichtet mit Gelatine in einer Dichte von 3 x 10 5 / Vertiefung. </li><li> Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 werden die Zellen zu erlauben , auf die Kulturoberfläche zu befestigen. </li></ol></li><li> Dil-Ac-LDL uptaken und Ulex -lectin Bindung. <ol><li> Bewahren Sie die 1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;- tetramethylindo-Carbocyaninfarbstoffes Perchlorat-markierten acetyliertes LDL (Dil-Ac-LDL) bei -20 ° C. Vor dem Färben, auftauen Dil-Ac-LDL auf Eis. Die Aktie Dil-Ac-LDL solution beträgt 1 mg / mL. Lagern Sie den FITC-markierten Ulex europaeus Agglutinin (Ulex -Lectin, 1 &amp; mgr; g / ml) bei 4 ° C. Die Aktie Ulex -Lectin Lösung beträgt 1 mg / ml. Store Hoechst 33342 bei 4 ° C. Die Aktie Hoechst 33342 Lösung ist 100 ug / ml. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l von Dil-Ac-LDL-Stammlösung auf 1 ml Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 ug / ml zu erhalten. </li><li> Vor der Färbung, entfernen Sie das alte Medium und waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit neuen Medium. </li><li> Nehmen Sie das neue Medium und fügen Sie die Dil-Ac-LDL-Färbung Medium. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1 h. </li><li> Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal. </li><li> 1 ml 10% Formalin, die Zellen zu fixieren. Legen Sie die Platte in Raumtemperatur für etwa 30 min. </li><li> Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal. Vermeiden Sie Licht. </li><li> In 1 ml sterile 1x PBS , die 10 &amp; mgr; l von Ulex -Lectin enthält. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei Raum temperature im Dunkeln für 1 h. </li><li> Entfernen Sie die Ulex-Lektin, indem die Zellen mit steriler PBS 1x 3-mal gewaschen wurde. </li><li> Hinzufügen Hoechst 33342 bis zu einer Endkonzentration von 1 ug / ml, 10 min Inkubieren im Dunkeln. </li><li> Sehen Sie sich die Fluoreszenz von Dil-Ac-LDL (rot, Anregungswellenlänge von 576 nm), Ulex -Lectin (grün, Anregungswellenlänge von 519 nm) und Hoechst (blau, Anregungswellenlänge von 361 nm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li><li> Fluoreszenzfärbung für CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin und Calponin. <ol><li> Store FITC-konjugiertem anti-Maus-CD31-Antikörper, Antikörper eNOS, VE-Cadherin-Antikörper FITC-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG bei 4 ° C im Dunkeln. Store VEGFR2 Antikörper in -20 ° C. </li><li> Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal. </li><li> 1 ml 10% Formalin, die Zellen zu fixieren. Legen Sie die Platte in Raumtemperatur für etwa 30 min. </li><li> Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal. </li><li> Beflecken CD31, 1 ml steriler 1xPBS, das 10 &amp; mgr; l von CD31-FITC-Antikörper enthält. Um Fleck entweder VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin, 1 mL sterile 1x PBS, die 4 ul VEGFR2 enthält, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin primären Antikörper sind. </li><li> Inkubieren der Zellen auf Eis für 1 h in der Dunkelheit. </li><li> Entfernen der Antikörper, die durch die Zellen mit steriler PBS 3 mal waschen. </li><li> Für die Färbung von VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin, 1 ml steriler 1x PBS, das 10 &amp; mgr; l FITC-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG enthält. Inkubieren der Zellen auf Eis für 1 h in der Dunkelheit. Entfernen Sie die IgG, indem die Zellen mit steriler PBS 3 mal waschen. </li><li> Hinzufügen Hoechst 33342 bis zu einer Endkonzentration von 1 ug / ml, 10 min Inkubieren im Dunkeln. </li><li> Sehen Sie sich die Fluoreszenz von CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin, Calponin (grün, Anregungswellenlänge von 518 bis 535 nm) und Hoechst (blau, Anregungswellenlänge von 361 nm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+early+structural-functional+changes+in+the+endothelium+for+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).</li>
<li>Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells%2C+antineutrophil+cytoplasmic+antibodies%2C+and+cytokines+in+the+pathogenesis+of+systemic+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+rheumatology+reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis.</a> Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Reactive+protein-induced+endothelial+microparticle+generation+in+HUVECs+is+related+to+BH4-dependent+NO+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+vascular+research%22%5BJournal%5D)">C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation.</a> Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+circulating+CD31%2B%2FCD42-+microparticles+are+associated+with+impaired+systemic+artery+elasticity+in+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+hypertension%22%5BJournal%5D)">Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects.</a> American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).</li>
<li>Mackay, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+from+patients+with+severe+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema.</a> Respiratory research. 14, 23(2013).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>Bowden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+alpha4+integrin+and+VCAM-1+in+CD18-independent+neutrophil+migration+across+mouse+cardiac+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium.</a> Circulation research. 90, 562-569 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+induces+apoptosis+in+mouse+aortic+endothelial+cells+and+endothelial+dysfunction+in+mice+fed+high-calorie+and+high-cholesterol+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets.</a> Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).</li>
<li>Atkins, G. B., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+differentiation%3A+molecular+mechanisms+of+specification+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).</li>
<li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brothers+and+sisters%3A+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation research. 108, 929-939 (2008).</li>
<li>Shimamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+and+foods+on+contraction+of+endothelial+cells+as+a+key+mechanism+in+atherogenesis+and+treatment+of+atherosclerosis+with+endothelial-cell+relaxants+%28cyclic+AMP+phosphodiesterase+inhibitors%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors).</a> Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).</li>
<li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).</li>
<li>Rostgaard, J., Qvortrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+demonstrations+of+filamentous+molecular+sieve+plugs+in+capillary+fenestrae%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae.</a> Microvascular research. 53, 1-13 (1997).</li>
<li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+endothelial-myocardial+signaling%3A+its+role+in+cardiac+growth%2C+contractile+performance%2C+and+rhythmicity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Studie zeigt, ein einfaches Verfahren zur Isolierung und Kultur Endothelzellen von einer Maus Aorta ohne spezielle Ausrüstung. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, daß die Mehrzahl der Zellen Endothelzellen nach dem zweiten Durchgang waren. Es wird vorgeschlagen , dass die Zellen am zweiten in den dritten Durchgang geeignet sind , in vitro und in vivo Experimenten endothelial biology zu studieren. Die EVP - ED aus dem Protokoll <p ...

Das vaskuläre Endothel nicht nur eine Barriereschicht ist , die Blut und Gewebe trennt, wird eine große endokrine Drüse betrachtet , die mit einer Oberfläche von 400 Quadratmetern 1 über den gesamten Gefäßbaum erstreckt. Das Wohlbefinden des Endothels ist wesentlich für vaskuläre Homöostase. Die dysfunktionalen Endothels beteiligt sich an verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen wie Atherosklerose, Vaskulitis und Ischämie / Reperfusion Verletzungen, usw. 2-4. Bis heute sind die spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen in dieser Krankheitseinstellungen beteiligt sind nicht gut verstanden durch die diffuses anatomischen Natur des Endothels. Die Maus ist ein wichtiges Modell für die Forschung, da genetische Manipulationstechniken mehr bei Mäusen entwickelt als in jeder anderen Säugetierspezies. Jedoch ist die Isolierung von primären Maus-Aorta-Endothelzellen als besonders schwierig, da die geringe Größe der Aorta enzymat machtic Verdauung von Endothel nicht praktikabel. Einige Verfahren berichtet , zu isolieren und zu reinigen ECs 5-7 erfordern. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches Verfahren zu verwenden, um Endothelzellen aus der Maus Aorta zu isolieren und zu erweitern, ohne eine spezielle Ausrüstung. In diesem Protokoll wird die frisch isolierten Aorta in kleine Segmente geschnitten und ausgesät auf einer Matrix mit dem Endothel für endothelial Austrieb zu ermöglichen nach unten zeigt. Nach Segmenten entfernt werden, werden Endothelzellen in Endothel-bevorzugtes Medium erweitert und sind für Experimente nach zwei oder drei Passagen bereit. Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens sind, dass: 1) beträchtlich hohe Anzahl von Endothelzellen aus einer einzigen Aorta geerntet werden; 2) die Lebensfähigkeit der Zellen ist gut erhalten; und 3) keine spezielle Ausrüstung oder Technik erforderlich ist. Sie stellt ein wirksames Mittel zur spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen in Endothelzellen Pathophysiologie identifizieren. Für diejenigen, die bei der Untersuchung pr interessiert sindimary kultivierten Endothelzellen aus entweder Gen-Knock-out-Mäuse, Gen-Knock-in-Mäusen, oder einem murinen Krankheitsmodell ist dieses Protokoll sehr nützlich und leicht zu praktizieren.

<table><tbody><tr><td>4 oder 6 Wochen alte Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>#10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1x PBS mit 1.000 U/ml Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzell-Wachstumsmedium (Dulbeccos' Modifizierter Adler" s Medium [DMEM] mit 25&nbsp; mM HEPES [Gibco, #12320-032], ergänzt mit 100&nbsp; &mu; g/mL Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen aus rinderischem Nervengewebe [EKGS, Sigma, #2759], 10% fötales Rinderserum [FBS, Gibco, #10082-147], 1.000&nbsp; U/mL Heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10.000&nbsp; U/mL Penicillin und 10&nbsp; mg/ml Streptomycin [Gibco, #15140-122])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor reduzierte Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale Proteinase (Dispase, 1&nbsp; U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) und D-Val Medium (D-Valin, 0,034&nbsp; g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos' Modifizierter Adler" s Mittel, niedriger Glukosegehalt (Gibco, #12320-032)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindo-Carbocyanin-perchlorat-markiertes acetyliertes LDL (Dil-ac-LDL)</td><td>Life Technologies</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>FITC-markiertes Ulex europaeusAgglutinin (Ulex-Lectin)</td><td>Sigma</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD31-FITC-konjugierter Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>553372</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>9698</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase</td><td>Abcam</td><td>ab5589</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus vaskuläres Endothel-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>33168</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Calponin</td><td>Abcam</td><td>700</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Sigma</td><td>F6005</td><td></td></tr><tr><td>1-ml-Spritze mit 25-G-Nadel</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-900-04222</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Perischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-516</td><td></td></tr><tr><td>Sechs-Well-Zellkulturplatten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>T12.5 Kulturflasche</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-076</td><td></td></tr><tr><td>Scheren, Pinzetten, Mikrodissektionsscheren und -zangen, Skalpellklinge</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiegerät mit Isofluran</td><td>Webster Veterianary Supply</td><td>07-806-3204</td><td></td></tr><tr><td>Heizlampe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugengerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und primärkultur von maus aortic endothelial cells

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Das vaskuläre Endothel ist essentiell für die normale vaskuläre Homöostase. Seine Funktionsstörung ist an verschiedenen Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt. Die Maus ist ein wichtiges Modell für die Erforschung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Diese Studie demonstriert eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus ohne spezielle Ausrüstung zu isolieren und zu kultivieren. Um Endothelzellen zu isolieren, wird die thorakale Aorta schnell aus dem Mauskörper entfernt und das anhaftende Fettgewebe und Bindegewebe aus der Aorta entfernt. Die Aorta wird in 1 mm dicke Ringe geschnitten. Jeder Aortenring wird geöffnet und mit dem Endothel nach unten auf eine wachstumsfaktorreduzierte Matrix ausgesät. Die Segmente werden für etwa 4 Tage in Endothelzellwachstumsmedium kultiviert. Die Endothelkeimung beginnt bereits am 2. Tag. Anschließend werden die Segmente entfernt und die Zellen kontinuierlich kultiviert, bis sie die Konfluenz erreichen. Die Endothelzellen werden mit neutraler Proteinase geerntet und für zwei weitere Passagen in Endothelzellwachstumsmedium kultiviert, bevor sie für Experimente verwendet werden. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass nach der zweiten Passage die Mehrzahl der Zellen doppelt positiv für die Dil-ac-LDL-Aufnahme, die Lektinbindung und die CD31-Färbung war, die typischen Eigenschaften von Endothelzellen. Es wird vermutet, dass Zellen an der zweiten bis dritten Passage für in vitro und in vivo Experimente zur Untersuchung der Endothelbiologie geeignet sind. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung spezifischer zellulärer und molekularer Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.

Endothelzell Sprießen Spontane Endothelzellen aus einem Maus-Aorta-Segment gestartet sprießen. Die Maus-Aorta-Segment wurde für 4 Tage auf einem Wachstumsfaktor-reduzierte Matrix dann in endothelialen Zellwachstumsmedium wachsen gelassen. Die Endothelzellen Austrieb erscheint in der Regel innerhalb von 2 - 4 Tage. Photomikrographien wurden am Tag 4 (Figur 1) aufgenommen. Wie in den Abbildungen gezeigt, wandern zahlreiche Endothelzellen aus dem Segment entfer...

Die vaskulären Endothelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei vielen wichtigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus zu isolieren und zu erweitern, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung von Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit einer einfachen Methode Endothelzellen aus der Maus-Aorta zu isolieren und zu vermehren, ohne auf spezielle Ausrüstung zurückzugreifen zu müssen. Andere Methoden zur Isolierung von Endothelzellen werden überwiegend am Herzen oder an der Lunge angewendet, nicht an der Aorta. Diese Technik für die Aorta liefert eine deutlich höhere Zellausbeute, eine hohe Zellviabilität und erfordert keine speziellen Geräte oder Techniken.Während diese auf die Untersuchung primärer endothelialer Zellen zutreffen, entweder durch Knockout oder bei Mäusen, stammen die meisten Krankheitsmodelle. Dieses Protokoll ist sehr nützlich und einfach anzuwenden. Beginnen Sie dieses Protokoll am Tagessanfang.Nach der Anästhesie eines Mäuses und Bestätigung des Fehlens von Reflexen wird die Maus in Rückenlage auf ein chirurgisches Kissen gelegt und eine Wärmelampe darüber positioniert, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Anschließend wird der Bauch durch Besprühen mit 70 % Ethanol desinfiziert. Danach wird mit einer Präzisionsschere der Bauch entlang der Mittellinie geöffnet, um die Bauchaorta freizulegen.Öffnen Sie dann die Brusthöhle, um Herz und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Wir berichten über eine zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären tumorspezifischen Endothelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Isolierung und Kulturtechniken von murinen primären vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) aus dem koronaren Kreislauf zu demonstrieren. Sobald VSMCs isoliert wurden, können sie für viele Standardkulturtechniken verwendet werden.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats"Myovascular".

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

Beschrieben wird eine wirksame enzymatische Methode zur Isolierung von primären porcineaortischen Endothelzellen (pAECs) von Miniaturschweinen. Die isolierten primären pAECs können verwendet werden, um die Immun- und Gerinnungsreaktion bei Xenotransplantation zu untersuchen.

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Ein Protokoll wird für die Isolierung und Primärkultur von mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) aus neonatalem Maus-Hirngewebe vorgestellt, um ein robustes In-vitro-Modell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schrankfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erstellen.

Isolierung und Kultur mikrovaskulärer Endothelzellen im Maushirn

Lernen Sie die Isolation und Primärkultur von Endothelzellen aus der Maus-Aorta ohne spezielle Ausrüstung. Diese Methode liefert hohe Zellviabilität und Ausbeute für kardiovaskuläre Forschung.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

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