Name: Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines 3D-Seiden-Kollagen-Modells für neuronale Netzwerke mit primären Rattenkortikalneuronen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonaler Wachstumsprozesse und neuronaler Interaktionen.

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Wir danken dem Labor von Dr. Stephen Moss für die Bereitstellung von embryonalem Rattenhirngewebe. M.D.T. hat das ursprüngliche Protokoll entworfen. Diese Arbeit wurde durch den P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520 der National Institutes of Health finanziert. K.C. wurde mit einem Postdoctoral Fellowship der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (CH 1400/2-1) unterstützt.

Das Hirngewebe Isolation Protokoll wurde von der Tufts University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und entspricht den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institutional Animal Care und Verwenden Committee B2011-45). 1. Silk Scaffold Vorbereitung <ol><li> Herstellung von Seidenlösung von Bombyx mori Kokons wie zuvor 19,20 beschrieben. <ol><li> Schneiden Sie die einzelnen Kokon in 8 gleiche Teile mit einer Schere. Verwenden Sie ca. 11 abhaspelbare 5 g fragmentierten Kokons. (15 min) </li><li> Bereiten 2 l 0,02 M Na 2 CO 3 -Lösung und bringen es zum Kochen unter Verwendung einer Heizplatte. (15 min) </li><li> Man wiegt 5 g fragmentierten Kokons und kochen Sie sie in Na 2 CO 3 Lösung für 30 min. Rühren Sie das kochende Seiden alle paar Minuten mit einem Spachtel. Dieser Schritt, auch als de-Gummierung, reinigt Seidenfibroin von hydrophilen Proteinen, sericins. (30 min) </li><li&gt; Wringen Sie das Fibroin von Hand und spülen Sie ihn in destilliertem Wasser mindestens dreimal zu waschen Sie das restliche Sericin und Chemikalien. (5 Min) </li><li> Setzen Sie den nassen Fibroin auf eine Petrischale und trocknen Sie das Fibroin-Extrakt in der Flow-Haube O / N. </li><li> Am nächsten Tag wiegen die Trockenmasse Fibroin und legen Sie das Fibroin in einem Becherglas. (15 min) </li><li> Um das Fibroin in 9,3 M LiBr-Lösung, berechnen die erforderliche Volumen (in ml) LiBr durch Multiplikation der Masse des trockenen Fibroin von 4. Gießen Sie langsam auflösen LiBr-Lösung über die Seidenfibroin und tauchen alle Fibroinfasern mit Spachtel. Decke den Becher, um Verdunstung zu vermeiden und ihn bei 60 ° C für 4 Stunden, damit die Fasern sich aufzulösen. (15 min) </li><li> Mit der Spritze, sammeln die Fibroinlösung aus dem Becherglas und laden Sie es in die MWCO 3.500 Dialyse-Kassetten. Zuführen Dialyse gegen destilliertes Wasser für 48 Stunden. Wechseln Sie das Wasser alle paar Stunden. </li><li> Mit der Spritze, sammeln die Fibroinlösung ausdie Kassetten in 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert zweimal bei 9000 UpM (~ 12.700 xg) bei 4 ° C für 20 min. Gießen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen nach jedem Zentrifugationsschritt und entsorgen Sie das Pellet. (40 min) </li><li> Messung der Konzentration des Fibroin durch Abschätzen der Trockenmasse. Gießen Sie 1 ml Seidenlösung in einen wiegen Boot. Trocknen der Probe im Ofen bei 60 ° C für 2 Std. Das trockene Seidenfibroin und berechnet die Konzentration des Seidenfibroinlösung durch Multiplikation des Gewichts durch 100. Der erwartete Konzentration Seide Lösung 6-9% (w / v). </li><li> Stellen Sie die Seiden Konzentration auf 6% (w / v), indem sie in destilliertem Wasser verdünnt. Haltepunkt: Die Flüssigkeit Seidenfibroin kann bei 4 ° C für bis zu einem Monat in einem geschlossenen Behälter gelagert werden. </li></ol></li><li> Herstellung von porösen Gerüsten aus Seide Lösung. <ol><li> Sieb des körnigen NaCl zur Trennung der Granulate bemessen 500-600 &amp; mgr; m, die in späteren Schritten verwendet werden sollen. Entsorgen Sie das Granulats bemessen unterhalb 500 um und oberhalb von 600 &amp; mgr; m. (15 min) </li><li> Pour 30 ml 6% Seide Lösung in das Polytetrafluorethylen (PTFE) Form (Abbildung 1). Streuen Sie vorsichtig 60 g gesiebten NaCl über die Seide. Tippen Sie auf den Container, um eine gleichmäßige Schicht von Salz zu erhalten. Man inkubiert 48 Stunden bei Raumtemperatur, um die Seide zu polymerisieren. </li><li> Legen Sie das Gerüst haltigen PTFE-Form im Ofen bei 60 ° C für 1 Stunde, um die Polymerisation abzuschließen und zu verdampfen restliche Flüssigkeit. </li><li> Platzieren des Inhalts des PTFE-Form in ein Becherglas mit 2 l destilliertem Wasser für 48 Stunden zum Auslaugen des Salzes. Wechseln Sie das Wasser 2-3 mal pro Tag. Entfernen Sie die Schwamm Gerüste aus den Formen, wenn das Salz vollständig ausgelaugt Haltepunkt:. Die Schwämme können gespeichert unter Wasser bei 4 ° C in einem geschlossenen Behälter, um die Gerüste vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Wenn Sie fertig sind, schneiden Sie die Gerüste mit 5 mm Durchmesser Biopsie Punsch. Vorgeschnitten die Gerüste auf etwa 2 mm in der Höhe zu erreichen. PuNch die Mitte des Gerüstes mit 2 mm Durchmesser Biopsie Stempel (2A). (1 h) </li><li> Autoklaven werden die Gerüste in Wasser eingetaucht, um sie zu sterilisieren (Nasszyklus, 121 ° C, 20 min) Haltepunkt:. Die Schwämme können gespeichert unter Wasser bei 4 ° C in einem geschlossenen Behälter, um die Gerüste vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Vor dem geplanten Zellaussaat, tauchen die Gerüste in sterile 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin (PDL) Lösung. Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Gerüste 3x mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um nicht gebundene PDL zu entfernen. (30 min) </li></ol></li></ol> 2. Isolierung kortikale Neuronen der Ratte <ol><li> Sezieren Rinden vom embryonalen Tag 18 (E18) Sprague-Dawley-Ratten, wie vorher durch Pacifici und Peruzzis 27 beschrieben nach bestätigten Tier-Protokoll erhalten wird. (2 h) </li><li> Für 20 min bei 10 inkubieren 3 cortices in 5 ml 0,25% Trypsin mit 0,3% DNase I (aus Rinderpankreas)7 ° C. </li><li> Inaktivierung des Trypsins durch Zugabe von gleichen Volumen von 1 mg / ml Sojabohnen-Protein. </li><li> Man reibt den Kortex mit 10 ml Pasteurpipette durch Auf- und Abpipettieren 20 Mal, bis eine Einzelzellsuspension erzeugt wird. Seien Sie sanft und Luftblasenbildung zu vermeiden. (10 min) </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 127 xg für 5 min. </li><li> Re-suspend das Zellpellet in 10 ml Kulturmedium (Neurobasalmedium, 1x B27 ergänzen, 1x Glutamax, 1% Penicillin / Streptomycin). Zählen Sie die Zellen. Die erwartete Zellkonzentration etwa 2x10 7 / ml. (20 min) </li></ol> 3. Konstruieren Montage und Kultur <ol><li> Scaffold Impfen mit Zellen. <ol><li> Verschieben Sie die sterile Gerüsten und alle notwendigen Utensilien in einer Zellkultur Kapuze. Mit einer sterilen Pinzette legen die Gerüste in einer 96-Well-Zellkulturplatte Zuweisung eines Gerüst pro Vertiefung. (10 min) </li><li> Tauchen die Gerüste in Zellkulturmedium equilibriert diese vor der Saatgutzelleing. Inkubation für 1 h bei 37 ° C. (10 min) </li><li> Saugt den Überschuß des Mediums von den Gerüsten. </li><li> Apply 100 ul Zellsuspension / Schafott. (10 min) </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° CO / N, um die Zellanheftung zu dem Gerüst zu ermöglichen. </li><li> Am folgenden Morgen saugen die fraktionslosen Zellen und gelten 200 ul / Vertiefung frisches Kulturmedium. (10 min) </li></ol></li><li> Gerüst Einbettung mit Kollagenmatrix. (2 h) <ol><li> Zeigen 10x PBS, Wasser, 1 N NaOH und Rattenschwanz-I-Kollagen auf Eis. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Kollagen nach den Anweisungen des Herstellers. Pflegen Sie auf Eis, bis die Zellen ausgesät Konstrukte sind bereit (bis 1 h). </li><li> Entfernen Sie die Zelle ausgesät Seidenkonstrukte aus dem Inkubator und saugen Sie den Überschuß von Medium. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette übertragen Sie die Gerüste zu den leeren Brunnen auf dem Well-Platte und tauchen jedes Gerüst in 100 ul 3 mg / ml Kollagenlösung. Setzen Sie den Gewebekulturplatte zurückim Brutschrank für 30 Minuten, um die Polymerisation des Kollagens zu erlauben. </li><li> Apply 100 ul vorgewärmten Zellkulturmedium / well. Kultur die Konstrukte für eine Woche Wechsel des Mediums jeden Tag durch den Austausch nur die Hälfte des Volumens des Mediums. </li></ol></li></ol> 4. Mikroskopie Analyse <ol><li> Live / Dead-Färbung (1 Stunde) <ol><li> Bereiten Stammlösung von Propidiumiodid (PI) 1 mg / ml (1,5 mm) in destilliertem Wasser. </li><li> Bereiten Stammlösung von Fluoresceindiacetat (FDA) 2 mg / ml in Aceton. </li><li> Bereiten Sie Arbeitslösung, die 10 &amp; mgr; M PI und 0,15 uM FDA in PBS verdünnt. Vorwärmen die Lösung auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten PBS, um die Serum-Esterasen zu entfernen. Saugen Sie das PBS. </li><li> Tragen Sie die vorgewärmte Arbeitslösung auf die Zellen für 2 Minuten und waschen Sie es mit PBS. </li><li> Verwenden Epifluoreszenzmikroskop für Bild in die Zellen (PI ex λ = 490 nm, λ em = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, λ em = 514 nm). Der Fleck bleibt über 40 Minuten stabil. Längerer Färbung kann in unspezifische Anfärbung von PI-Aufnahme durch die Zellen und Co-Lokalisation von PI / FDA in Zellen, was zur Folge haben. </li></ol></li><li> Immunfärbung <ol><li> Bei dem gewünschten Zeitpunkt der Kultur zu fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT. Aufgrund der Toxizität des PFA Rauch Der Fixierschritt sollte im Abzug durchgeführt werden. </li><li> Waschen Sie Gerüste mit 3x PBS Haltepunkt:. Die PFA-Fest Konstrukte können in PBS bei 4 ° C für mehrere Tage, bevor mit weiteren Schritten fortfahren gespeichert werden. </li><li> Die Gerüste in 0,2% Triton, 0,25% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit Primärantikörper O / N Inkubieren bei 4 ° C. </li><li> Am folgenden Tag entsorgen Sie die Farblösung und waschen Sie die Gerüste 3 x 30 min mit PBS, um den ungebundenen primären Antikörper zu entfernen. </li><li> Der Proben mit einem sekundären Antikörper in 0,2% verdünnt Triton, 0,25% BSA in PBS für 2 inkubierenh bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Farblösung und waschen Sie die Gerüste 3 x 30 min mit PBS, um den ungebundenen sekundären Antikörper zu entfernen. </li><li> Bild die Gerüste mit einem konfokalen Mikroskop mit 20x-Objektiv, indem 100 &amp; mgr; z-Abschnitte der Probe mit 1 &amp; mgr; m Schritt. Um die dünne Neuriten die Bildauflösung sollte mindestens 1024 x 1024 Pixel groß sein zu visualisieren. </li></ol></li><li> RNA, DNA und Proteinisolierung Hinweis: RNA, DNA und Proteinisolierung wird mit einem handelsüblichen AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. <ol><li> Mit einer sterilen Pinzette übertragen Sie die Gerüste aus der Kulturplatte in ein 2 ml sterilen Röhrchen. Legen Sie ein Gerüst pro Röhrchen. </li><li> Gib 200 ul RLT-Puffer zu jedem Röhrchen. </li><li> Stören das Konstrukt durch Fragmentierung mit sterilen Mikroschere. </li><li> Um das Gewebe zu homogenisieren gestört, übertragen den Inhalt des Rohrs, um die Spin-Säule. Spin für 2 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge.Das Lysat wird homogenisiert, während es durch die Spinsäule passiert. </li><li> Sammeln Sie die Strömung durch und verwenden Sie es sofort an RNA, DNA und Protein nach dem Hersteller-Protokoll zu isolieren. </li><li> Quantifizierung der Ausbeute an Nukleinsäuren andere kompatible Methode (zB Nanodrop). </li><li> Quantifizierung der Proteinausbeute mit BCA-Protein-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Ergebnisse der Test unter Verwendung von Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 562 nm. Anmerkung: Die erwartete Ausbeute an Nukleinsäuren und Protein pro Konstrukt in Bezug auf die Zelldichte ist in Figur 4 dargestellt ist. </li></ol></li></ol>

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Hier haben wir die Richtlinien für die Zusammenstellung eines kompartimentierten 3D-gehirnähnlichen Gewebemodells beschrieben. Das Modell zeichnet sich durch eine dicht polarisierte Kultur von Neuronen aus, die zur Entwicklung von zwei morphologisch unterschiedlichen Kompartimenten führt: eines mit dicht gepackten Zellkörpern, das zweite mit reinen axonalen Netzwerken. Insgesamt ahmen die Gerüstarchitektur und das Wachstumsmuster das kortikale Gewebe des Gehirns einschließlich der sechs laminaren Schichten und der Trakte der weißen Substanznach 21.
Das Donut-förmige Gewebemodell auf Basis von Seidenproteinen ermöglicht die Modifikation und Abstimmung mechanischer Eigenschaften, vielseitiger Strukturformen, Hydrogel-Füllstoffe und zellulärer Komponenten. Damit stellt dieses Gewebemodell eine Basisplattform für eine Vielzahl von Studien dar. Seide ist aufgrund ihrer Biokompatibilität, ihrer wässrigen Verarbeitung und ihrer robusten mechanischen und Abbaueigenschaften ein günstiger Kandidat für Biomaterialplattformen22. Die Seidenmatrix dient auch als stabiler Anker, um die Kontraktion des Kollagengels im Laufe der Zeit in der Kultur zu reduzieren. Die Eigenschaften wie die Seidenkonzentration und die Porosität des in diesem Modell verwendeten Gerüsts wurden zuvor angepasst, um ein optimales Zellwachstum und mechanische Eigenschaften zu erreichen, die zu einer gehirnähnlichen Gewebeelastizität führen18,23,24. Wir empfehlen, diese Parameter konstant zu halten, um das erfolgreiche Ergebnis und die Reproduzierbarkeit der Experimente zu gewährleisten.
Die Bildung eines neuronalen 3D-Netzwerks wurde durch die Kombination von zwei Arten von Biomaterialien mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften erreicht: ein steifes Gerüst zur neuronalen Verankerung und eine weichere Gelmatrix, um die Axonpenetration und Konnektivität in 3D zu ermöglichen. Selektive Materialpräferenzen des Seidengerüsts und des weichen Hydrogels bilden das zugrundeliegende Prinzip für die Abschottung der Neuronen von den axonalen Verbindungen. Aufgrund der inerten Natur des Seidengerüsts ist eine Funktionalisierung mit Poly-D-Lysin für die neuronale Bindung erforderlich. Es können aber auch andere zelladhäsionsfördernde Faktoren wie RGD25 oder Fibronektin26 eingesetzt werden. Um die 3D-Netzwerkbildung zu erreichen, muss das Seidengerüst rechtzeitig mit Hydrogel gefüllt werden, sobald Neuronen an das Gerüst gebunden sind. Ebenso kann der Kollagenmatrix-Filler durch andere Hydrogele ersetzt werden, wodurch die Untersuchung des Einflusses extrazellulärer 3D-Umgebungen auf die Bildung axonaler Netzwerke als Plattform zur Bewertung neuartiger Hydrogele in Bezug auf die neuronale Kompatibilität dienen kann. Zusätzlich können neben kortikalen Neuronen der Ratte auch andere neuronale Quellen wie Hippocampus-Neuronen oder von induzierten pluripotenten Zellen (iPSc) abgeleitete Neuronen genutzt werden. Darüber hinaus kann das Gewebemodell verwendet werden, um heterozelluläre Interaktionen zu untersuchen, indem Gliazellen zusammen mit Neuronen einbezogen werden, und um komplexeres gehirnähnliches Gewebe aufzubauen.
Wie bereits gezeigt, kann unser Modell verwendet werden, um die neuronale Funktionalität in 3D-Mikroumgebungen mit einer Vielzahl von Assays wie Zellviabilität, Genexpression, LC-MS/MS und Elektrophysiologie zu bewerten, was die physiologische Relevanz des Modellsdemonstriert 18. Andere Methoden, die häufig zur Bewertung von 3D-Tissue-Engineering-Konstrukten verwendet werden, wie z. B. Immunfärbung und Mikroskopie8,9,11 , können ebenfalls verwendet werden, um die Zellverteilung und das Ausmaß der axonalen Netzwerkbildung zu beurteilen. Es ist jedoch zu beachten, dass aufgrund der hohen Dichte der Kollagenmatrix die Durchdringung von Antikörpern und die Tiefe der Bildgebung auf wenige hundert Mikrometer begrenzt ist. Darüber hinaus kann das Signal-Rausch-Verhältnis durch unspezifische Hintergrundfluoreszenz beeinflusst werden. Dies kann durch den Einsatz von lipophilen Zelltracern und genetisch exprimierten fluoreszierenden Proteinen überwunden werden, die den Bedarf an Immunfärbung verringern11. Alternativ kann die Bildgebung mit der 2-Photonen-Mikroskopie anstelle der üblichen Ein-Photonen-Technik durchgeführt werden, die den Signalverlust, das Photobleaching, reduzieren und auf mehrere hundert Mikrometer Tiefe ausgedehnt werden kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das auf Seide und Kollagen basierende gehirnähnliche Gewebe eine robuste Plattform zur Untersuchung neuronaler Netzwerke in 3D bietet und ein Ausgangspunkt für die Entwicklung fortschrittlicherer Modelle neurologischer Erkrankungen in der Zukunft ist. Unabhängig von der Art der Auswertung unterstützt die relative Einfachheit dieses Gewebemodells seinen Nutzen, Erfolg und seine Reproduzierbarkeit.

Das Zentralnervensystem (ZNS) kann durch eine Vielzahl von Erkrankungen mit vaskulärer, strukturellen, funktionellen, infektiösen oder degenerativen berührt. Schätzungsweise 6,8 Millionen Menschen sterben jedes Jahr als Folge von neurologischen Erkrankungen, die eine wachsende sozioökonomische Belastung weltweit darstellt 1. Nur einige der Erkrankungen haben jedoch verfügbaren Behandlungen. Daher gibt es einen kritischen Bedarf an innovativen therapeutischen Strategien für Patienten mit neurologischen Störungen. Leider scheitern viele ZNS-Therapeutika gezielt in klinischen Studien, zum Teil auf der Nutzung der unzureichenden präklinischen Forschung Modelle, die nicht die Beurteilung der akuten und chronischen Auswirkungen mit physiologisch-relevanten Funktionsanzeigen zulassen. Trotz erheblicher Forschungsanstrengungen in den letzten Jahrzehnten, gibt es eine große Menge nicht bekannt über die Struktur und Funktion des ZNS. Um mehr Wissen zu erlangen, sind Tiermodelle häufig unsed zu modellieren pathologischen Zuständen, wie traumatische Hirnverletzungen (TBI) oder Demenz, vor allem in präklinischen Studien. Unterscheiden sich jedoch deutlich von Tieren Menschen sowohl in der Anatomie des ZNS sowie in der Funktion, die Genexpression und Stoffwechsel 2-4. Auf der anderen Seite, sind 2D-in-vitro-Kulturen die gemeinsame Methode zur Zellbiologie untersuchen und werden routinemäßig für die Wirkstoffforschung eingesetzt. Jedoch 2D Zellkulturen fehlt die Komplexität und die physiologische Bedeutung im Vergleich zu menschlichen Gehirns 5-7. Zwar gibt es keinen Ersatz für die niedrigen Kosten und die Einfachheit der 2D-Zellkulturstudien oder die Komplexität von Tiermodellen zur Verfügung gestellt, könnte 3D-Tissue Engineering verbesserte Forschungsmodelle zu generieren, um die Lücke, die in vitro und in vivo Ansätze zwischen der 2D besteht zu schließen. 3D-Tissue Engineering bietet mehrere physiologisch relevanten durch 3D-Zell-Zell-Interaktionen und extrazelluläre Signale von den Biomaterial Gerüsten versehen ist experimentellen Bedingungen. Despite die deutlichen Anzeichen dafür, hinter dem Wert von 3D-Kulturen, gibt es derzeit nur wenige 3D-ZNS-Gewebe-Modelle wie Stammzellen abgeleiteten organoiden Kulturen 8-10, neurospheroids 11 und verteilt Hydrogel Kulturen 12,13. Erweiterte technische Methoden, einschließlich Mehrschichtlithographie 14 und 3D-Druck 15 wurden für die Untersuchung der Lunge, Leber und Nierengewebe verwendet worden. Jedoch gibt es fehlende 3D CNS Modell für compartmentalized neuronale Wachstum zu ermöglichen, wie beispielsweise Nachahmen des kortikalen Architektur und Biologie. Getrennt Wachstum von Neuriten von neuronalen Zellkörpern zuvor in 2D-Kulturen unter Verwendung von Mikrofabrikations 16,17, die die Untersuchung der Axon-Trakt Tracing Calciumeinstrom, Netzarchitektur und Aktivitäten gezeigt. Diese Idee hat uns inspiriert, um einen 3D-polarisierte Nervengewebe in dem Zellkörper und axonalen Bahnen sind in verschiedenen Fächern imitiert die Schichtenarchitektur des Gehirns 18 befindet entwickeln </sup&gt;. Unser Ansatz basiert auf der Verwendung von einzigartigen Seide Gerüst Design, hohe Dichte von Zellen beherbergt in einem begrenzten Volumen und ermöglicht Auswuchs von Axonen dichten Netzes in einem Kollagengel basiert. Hier zeigen wir die volle Montageverfahren des Gehirns artiges Gewebe einschließlich der Gerüstherstellung und neuronalen Kultur.

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500 Dialysekassetten&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieb</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Nr. 270, Nr. 35, Nr. 30</td></tr><tr><td>PTFE-Form</td><td></td><td></td><td>made in house (Bild 1) 10 cm Durchmesser, 2 cm Höhe</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze 5&#160; mm</td><td>World Präzisionsinstrument</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze 2&#160; mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Endkonzentration 10&#160; &#956; g/ml, in Wasser gelöst</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>Endkonzentration 0,3%</td></tr><tr><td>Sojaprotein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>Endkonzentration 1&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>erwärmen bis zu 37&#160; &deg; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>B27 Ergänzung 50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I, Rattenschwanz, 100&#160; mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Endkonzentration 3&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>ätzend</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-10MG</td><td>giftig</td></tr><tr><td>Fluorescein Diacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX10</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>giftig, Endkonzentration 4%</td></tr><tr><td>Rind Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta; IIITubulin-Antikörper&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>Kaninchen 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen Alexa-546</td><td>Molecular Probes</td><td>A11010</td><td>Ziege Serum 1:250</td></tr><tr><td>Ziege</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Objektiv 20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol, Reines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA Proteinassay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser Spectramax M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Absorption 562 nm</td></tr><tr><td>Mikroschere, Economy, Vannas-Typ</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

engineered 3d silk-kollagen-basierten modell von polarisiertem neural tissue

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Trotz großer Anstrengungen, die Anatomie, Zusammensetzung und Funktion des Gehirns zu entschlüsseln, bleibt es das am wenigsten verstandene Organ des menschlichen Körpers. Um ein tieferes Verständnis des neuronalen Systems zu erlangen, wollen die Wissenschaftler das Gewebe vereinfacht rekonstruieren, indem sie es in vitro aus Grundbausteinen mit Hilfe eines Tissue-Engineering-Ansatzes zusammensetzen. Unsere Gruppe entwickelte ein gewebegezüchtetes 3D-Gehirnmodell auf Seiden- und Kollagenbasis, das der weißen und grauen Substanz des Kortex ähnelt. Das Modell besteht aus einem porösen Seidenschwamm, der mit Neuronen aus dem Rattengehirn vorbesiedelt ist, die in eine weiche Kollagenmatrix eingetaucht sind. Polarisiertes neuronales Auswachsen und Netzwerkbildung wird mit separater Axon- und Zellkörperlokalisation beobachtet. Diese kompartimentelle Architektur ermöglicht die einzigartige Entwicklung von Nischen, die natives Nervengewebe nachahmen, und ermöglicht so die Erforschung der Assemblierung neuronaler Netzwerke, der axonalen Führung, der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen und der elektrischen Funktionen.

Solide Seiden Schwämmen vorgeschnitten in die Donut-Form stellen eine einzigartige und einfache Idee, eine unterteilte Architektur ähnelt Nervengewebe (2A) zu erreichen. Das hochporöse Struktur des Gerüsts mit einer Porengröße von etwa 500 um entstehen außerordentlich großer Oberfläche ermöglicht die Aussaat und das Wachstum der hohen Zelldichte in einem kleinen Volumen (2x10 7 / ml) (2B). Zusätzlich wird die hohe Porosität des Trägermaterials ermöglicht die uneingeschränkte Diffusion von Nährstoffen und Abfallstoffen, was zu überlegenen Lebensfähigkeit dichten Zellkulturen über längere Zeiträume. Nach der Aussaat der Neuronen schnell und gleichmäßig zu befestigen, um die Oberfläche der Gerüstporen. Nach Zellanheftung abgeschlossen ist und die Zellen werden auf der Seide Substrat äquilibriert wird der Schwamm-Gerüst mit dem weichen Kollagenmatrix, um eine 3D-Umgebung für axonale Netzwerkbildung (Figur 3 bereitzustellen gefüllten </strong&gt;). In Abwesenheit der Kollagenmatrix der Kompartimentierung von Axonen und Zellkörper ist nicht möglich, Neuronen wachsen Erweiterungen nur an der Oberfläche der Poren, was zu gemischten Netzen mit 2D Flächen (3B) gefunden. Im Gegensatz dazu liefert das Kollagengel eine Maschenwerk, die umfangreiche axonalen Wachstums in 3D unterstützt, während neuronalen Zellkörpern bleiben mit dem Seiden Gerüst (3C) befestigt sind. Dieses Wachstumsverhalten führt zu Kompartimentierung der Zellkörper und reinem axonalen Netze (Figur 3D), die die grauen und weißen Substanz des Kortex im Gehirn ähnelt. Abgesehen von Mikroskopie kann die Konstrukte mit einer Vielzahl von anderen Methoden 18 ausgewertet werden, abhängig von der Frage, hinter dem Experiment. Zum Beispiel kann die Isolierung von DNA, RNA und Protein aus den Konstrukten leicht unter Verwendung kommerzieller Kits (Abbildung 4). Die Ausbeute an Nukleinsäuren und Protein per Konstrukt, hängt von der Anzahl der Zellen, der ursprünglich auf die Seide Gerüste geimpft. Je mehr Zellen ausgesät desto höher ist die Ausbeute an DNA, RNA und Protein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> Abbildung 1. PTFE-Form für Seide Schwamm Gerüstherstellung verwendet Die Abmessungen:.. 10 cm Durchmesser, 2 cm Höhe <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> Abbildung 2. 3D-Gehirn-ähnliche Gewebemodell. (A) Poröse Seiden Schwamm Schafott. (B) lebend / tot-Färbung von Neuronen am Tag 1 nach der Aussaat auf Seide Gerüst vor dem Kollagen (grün-lebende Zellen, red-dead-Zellen) die Einbettung. Panels auf der rechten Seite zeigen die magnification der Bereich im roten Rahmen eingefangen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> Abbildung 3. Neuronale compartmentalized Auswuchs in der 3D-Gehirn-ähnliche Gewebemodell (A) Scaffold Fächer:. Red-Zellkörper Fach, Blau-axonalen Fach. (B) Die neuronale Wachstumsmuster am Tag 1 nach der Aussaat vor Kollagen Einbettung. (C). Neuronale Auswachsen am Tag 7 nach der Aussaat in den Zellkörper Fach. (D) Neuronale Auswuchs am 7. Tag nach der Aussaat im axonalen Kompartiment. Grün -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen</a>Abbildung. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> Abbildung 4. Erwartete Rendite aus (A) RNA und DNA, und (B) Protein pro Konstrukt in Bezug auf die Menge an Zellen ausgesät pro Gerüst (± SD, n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a>

Einblicke in die komplexen Aktionen des Gehirns erfordern fortschrittliche Forschungswerkzeuge. Hier demonstrieren wir ein neuartiges, auf Seidenkollagen basierendes 3D-Modell von neuronalem Gewebe, das einer gehirnähnlichen Architektur ähnelt. Das Modell kann verwendet werden, um die Assemblierung neuronaler Netzwerke, die axonale Führung, Zell-Zell-Interaktionen und die elektrische Aktivität zu untersuchen.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Konstruktionsprozess von 3D-geweben, die dem Gehirn ähneln, zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst poröse Gerüste aus Seidenlösung mithilfe einer Salzauslaugungstechnik hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Gerüste in ringförmige Stücke vorzuschneiden und sie durch Sterilisation sowie Beschichtung mit Poly-D-Lysin oder PDL für die Zellkultur vorzubereiten.Anschließend werden die hergestellten Gerüste mit frisch isolierten primären kortikalen Rattenneuronen besiedelt. Im letzten Schritt erfolgt die Einbettung der Gerüste in Kollagen und deren Übertragung in die Kulturschalen. Abschließend wird mittels Immunfluoreszenzmikroskopie das neuronale Wachstum und die Entwicklung neuronaler Netzwerke dargestellt.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie oder Diagnose von Erkrankungen, die das Gehirn betreffen, da diese Technik als Grundlage für die Entwicklung neuer Forschungsmodelle von Parkinson oder Alzheimer dienen kann. Bereiten Sie vor Beginn die 6%ige Seidenlösung wie im Textprotokoll beschrieben zu und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Um poröse Gerüste herzustellen, sieben Sie zunächst das granulare Natriumchlorid und sammeln Sie die Körnchen mit einem Durchmesser zwischen 500 und 600 Mikrometern.Geben Sie 30 Milliliter der Seidenlösung in die Form aus Polytetrafluorethylen oder PTFE und streuen Sie anschließend 60 Gramm gesiebtes Natriumchlorid gleichmäßig darüber. Inkubieren Sie 48 Stunden bei Raumtemperatur, um die Seide zu polymerisieren.Stellen Sie das Gerüst mit der Form eine Stunde lang in einen Ofen, der auf 60 Grad Celsius eingestellt ist, um die Vernetzung des Seidengewebes abzuschließen und jegliche verbleibende Flüssigkeit zu verdampfen. Tauchen Sie danach die Kombination aus Form und Gerüst 48 Stunden lang in einen zwei Liter fassenden Becher mit destilliertem Wasser. Um das Salz auszulaugen, wechseln Sie das Wasser zwei bis drei Mal pro Tag.Entfernen Sie das Gerüst aus der Form und schneiden Sie es in kleine Stücke. Zuerst mit einer Biopsiezange mit einem Durchmesser von fünf Millimetern. Dann schneiden Sie das Gerüst auf eine Höhe von zwei Millimetern zu und entfernen Sie die Mitte jedes Stücks mit einer Biopsiezange mit einem Durchmesser von zwei Millimetern.Autoklavieren Sie die Scaffolds im Nasszyklus für 20 Minuten. Stellen Sie innerhalb einer Zellkulturhaube ein Paar sterilisierter Pinzetten, Zellkulturmedien und die autoklavierten Scaffolds bereit. Entfernen Sie eine 96-Well-Platte von ihrer Verpackung und stellen Sie sie hinein, um die Scaffolds zu besiedeln.Platzieren Sie zunächst einen sterilen Träger pro Vertiefung. Geben Sie in die 96-Loch-Platte Zellkulturmedium, um die Träger zu bedecken, und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator, um sie zu equilibrieren. Nach der Inkubation saugen Sie das überschüssige Medium von den Trägern ab.Fügen Sie dann zwei mal 10 hoch 6 ratkortikale neuronale Zellen in 100 µL Neurobasal-Medium pro Scaffold hinzu. Stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht stehen, damit die Zellen am Scaffold anheften können. Am folgenden Morgen.Die nicht angehefteten Zellen vorsichtig abpipettieren und durch 200 Mikroliter frisches Zellkulturmedium ersetzen. Für einen kurzen Zeitraum bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend das Medium aus den Mulden mit sterilen Pinzetten abpipettieren.Überführen Sie die Gerüste mit Zellen in leere Vertiefungen der 96-Loch-Platte und geben Sie dann je 100 Mikroliter frisch verdünnte, eiskalte Ratten-Schwanz-Kollagen-Lösung mit einer Konzentration von drei Milligramm pro Milliliter zu jedem Gerüst hinzu. Stellen Sie die Zellen für 30 Minuten in den 37 °C-Inkubator, um die Polymerisation des Kollagens zu ermöglichen.Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und geben Sie 100 µL vorgewärmtes Zellkulturmedium pro Brunnen zurück. Stellen Sie die Platte für den gewünschten Zeitraum des Zellwachstums in den Inkubator und ersetzen Sie täglich die Hälfte des Mediums in jedem Brunnen durch frisches Medium, und zwar bis zu einer Woche lang.In diesen hochporösen Gerüsten können neuronale Zellen in hoher Dichte kultiviert werden, wie hier gezeigt. Hier sind die Ergebnisse zur Zellviabilität. Ein Tag nach der Aussaat erscheinen fluoreszierend mit Diacetat markierte lebende Zellen grün sowie Propidiumiodid und Seidengerüst.In Rot ist der hohe Prozentsatz an lebenden Zellen unter geringer Vergr&ouml;&szlig;erung zu erkennen. Diese Abbildung zeigt die r&auml;umliche Trennung von neuronalen Zellk&ouml;rpern und axonalen Forts&auml;tzen innerhalb des ringf&ouml;rmigen Scaffolds. Die neuronalen Zellk&ouml;rper verbleiben an dem Seidenscaffold angeheftet, wie hier einen Tag nach der Aussaat gezeigt; die Zellen wurden immunhistochemisch gegen Beta-Drei-Tubulin gef&auml;rbt und erscheinen gr&uuml;n.Wie erwartet, hatten die Zellen das Gerüst bis zum siebten Kulturtag dicht besiedelt. Im Gegensatz dazu bietet die Kollagenmatrix im zentralen Hohlraum des Gerüsts Unterstützung für umfangreiches axonales Wachstum. Dargestellt ist hier das axonale Netzwerk.Sieben Tage nach der Aussaat. Dieses Video zeigt einen konfokalen Z-Scan des zentralen Kollagenfensters des Gerüsts, das die neuronalen Netzwerkzellen enthält, die durch Färbung für Beta-Tubulin-3 markiert wurden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 3D-Gehirn-ähnliche Gewebekonstrukte aufbaut.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video zeigt die Erstellung eines 3D-polarisierten neuronalen Gewebemodells unter Verwendung von Seiden-Kollagen-Gerüsten. Es beschreibt den Prozess der Aussaat neuronaler Zellen auf porösen Seidengerüsten, der Inkubation für die Zellanhaftung, der Einbettung des Gerüsts mit Kollagen und unterstreicht die Bedeutung der unterstützenden Kollagenmatrix bei der Bildung eines 3D-polarisierten Nervengewebemodells.

Entwicklung eines auf Seidenkollagen basierenden 3D-Modells von polarisiertem Nervengewebe

Quelle: Struzyna, L. A. et. al., Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Entwicklung von neuronalen Netzwerken aus Mikrogewebe unter Verwendung einer Hydrogel-Mikrosäule mit einem extrazellulären Matrixkern. Ausgesäte neuronale Aggregate haften an, erweitern Projektionen und bilden strukturierte neuronale Netzwerke, die zu Fortschritten in der...

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