Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein In-vitro-Modell der glatten Muskelkontraktionsfunktion zu entwickeln, das zur Untersuchung der Mechanismen vaskulärer Funktionsstörungen wie zerebraler Vasospasmen über krankheitsrelevante Zeitskalen verwendet werden kann. Dies wird mithilfe langzeitstabiler vaskulärer muskulärer Dünnschichten erreicht, indem zunächst Elastomersubstrate hergestellt werden, indem Deckgläser nacheinander mit einem Streifen Piam und anschließend mit PDMS beschichtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, mithilfe einer mikrofluidischen Applikationsvorrichtung nacheinander Genin und Fibronectin auf die Oberfläche aufzutragen.

Um Leitstrukturen für die Gewebeselbstorganisation auf vaskulären, muskulären Dünnfilmen bereitzustellen, besteht der letzte Schritt darin, einen Kontraktilitätsassay durchzuführen, bei dem vaskuläre, muskuläre Dünnfilme zur Kontraktion angeregt und anschließend wieder entspannt werden, während die Probe abgebildet wird. Letztendlich ergibt dieser Ansatz Gewebe, die strukturelle Integrität und funktionelle Kontraktilität bis zu zwei Wochen lang in Kultur beibehalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie mikrokontaktgedruckten muskulären Dünnfilmen liegt darin, dass Gewebestabilität und funktionelle Kontraktilität über Wochen hinweg aufrechterhalten werden, während mit früheren Methoden hergestellte Gewebe bereits nach drei bis vier Tagen zu degradieren beginnen.

In der Kultur bietet diese Methode eine Plattform zur Untersuchung zentraler Fragen bei Gefäßerkrankungen, beispielsweise wie sich die funktionellen Mechaniken von Arterien während des chronischen Krankheitsverlaufs verändern. Hier untersuchen wir die Gefäßmechanik, doch diese Methode kann auch auf andere modellhafte Organsysteme angewendet werden, wie beispielsweise Organchip-Technologien zur Rekapitulation der Herz- oder Skelettmuskelfunktion. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir das Ziel verfolgten, langsam verlaufende vaskuläre Dysfunktionen zu untersuchen, und feststellten, dass aktuelle Methoden entweder nicht zur Quantifizierung der Funktion vaskulärer glatter Muskelzellen geeignet waren oder die Integrität nicht ausreichend lange aufrechterhalten konnten.

Die Jin-Mikrofluidische Deposition bietet eine Vorlage für die Selbstorganisation von Zellen, ähnlich wie das Mikrokontaktdruckverfahren, ermöglicht jedoch auch, dass gemusterte Gewebe ihre Struktur und Integrität über Zeitskalen hinweg beibehalten, die für die Untersuchung der Gefäßumgestaltung geeignet sind. Beginnen Sie damit, eine Charge von Deckgläsern mit 25 mm Durchmesser gemäß dem begleitenden Textprotokoll zu reinigen, und decken Sie die Ränder der gereinigten Deckgläser ab, indem Sie Klebeband an ihren Seiten anbringen, wobei ein freiliegender Glasstreifen in der Mitte verbleibt. Schneiden Sie danach die Deckgläser einzeln aus der Schale heraus und legen Sie sie nacheinander auf eine spinbeschichtete Spannvorrichtung.

Unter Verwendung einer Pinzette 150 Mikroliter einer 10%igen Lösung von Poly-N-Isopropylacrylamid, auch Polyacrylamid oder Piam genannt, in 1-Butanol hinzufügen. Sicherstellen, dass der freiliegende Bereich des Deckgläschens vollständig bedeckt ist.

Schalten Sie dann den Spin-Coter ein und erhöhen Sie die Drehzahl 10 Sekunden lang auf 3000 U/min. Warten Sie fünf Sekunden und erhöhen Sie dann innerhalb von 10 Sekunden auf 6.000 U/min. Halten Sie eine Minute lang bei 6.000 U/min an und senken Sie die Drehzahl anschließend über einen Zeitraum von 10 Sekunden wieder auf 3000 U/min ab.

Halten Sie es fünf Sekunden lang an dieser Stelle, bevor Sie den Spin-Beschichtungszyklus beenden. Entfernen Sie nach dem Trocknen vorsichtig das Klebeband von allen Deckgläsern, sodass das gesamte Deckglas freiliegt und eine dünne Schicht der Piam-Beschichtung in der Mitte des Glasdeckglases verbleibt. Als Nächstes wird eine Schicht entgaste PDMS auf jedes Deckglas spin-beschichtet.

Schieben Sie sie in einen Ofen und härten Sie sie bei 90 Grad Celsius für mindestens 1,5 Stunden. Entwerfen Sie eine Gewebemikrofluidik-Fotomaske und bereiten Sie dann wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben einen strukturierten Siliziumwafer vor. Nach der Strukturierung ätzen Sie den Wafer mit Standardverfahren und legen Sie ihn mit der strukturierten Seite nach oben in eine Petrischale.

Mischen Sie anschließend 100 Gramm PDMS mit einem Basisverdichter im Verhältnis 10 zu 1, ziehen Sie das PDMS vollständig und gleichmäßig in die Schale, sodass der strukturierte Wafer vollständig bedeckt ist. Stellen Sie die Schale etwa 30 Minuten lang in einen Vakuum-Exsikkator, bis alle Luftblasen entfernt sind. Anschließend härten Sie das PDMS in der Schale bei 90 Grad Celsius mindestens 1,5 Stunden lang aus.

Nach der Aushärtung überschüssiges PDMS abschneiden und das verbleibende strukturierte PDMS langsam von der Musterseite des Wafers ablösen. Das überschüssige PDMS rund um die Muster mit einem Rasiermesser abschneiden und die Geräte rechteckig formen, um die Entfernung des Geräts in späteren Schritten zu erleichtern. Anschließend mit einer ein Millimeter großen chirurgischen Biopsiepunch die Einlass- und Auslassöffnungen ausstechen.

Sonizieren Sie mikrofluidische Vorrichtungen in 70 % Ethanol für mindestens 30 Minuten vor jedem Gebrauch. Legen Sie bis zu 10 Deckgläser mit vaskulärem muskulärem Dünnschicht-Substrat in einen UV-Ozon-Reiniger für acht Minuten. Bereiten Sie anschließend eine Lösung mit fünf Milligramm pro Milliliter Genin vor, indem Sie ein Milliliter sterile, doppelt destillierte Wasser zu einem Behälter mit fünf Milligramm lyophilisiertem Genin hinzufügen.

Mischen Sie die Lösung mit einem Vortex-Mischer und stellen Sie das Gefäß mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur beiseite. Legen Sie die gereinigten mikrofluidischen Geräte mit der Funktionsseite nach unten auf jede Abdeckung. Führen Sie sie einzeln ein.

Drücken Sie die Geräte fest auf, um eine dichte Abdichtung an die mit PDMS beschichteten Deckgläser zu gewährleisten. Geben Sie umgehend einen Tropfen 70 %igen Ethanol am Eingang jedes Geräts zur Vorbefüllung des Geräts auf. Nach fünf bis zehn Minuten saugen Sie vorsichtig das überschüssige Ethanol am Eingang ab und ersetzen es unmittelbar durch etwa 100 Mikroliter PBS.

Verwenden Sie ein Vakuum, um PBS durch die Geräte bis zum Auslass zu ziehen, um den Ethanol zu entfernen. Stoppen Sie, wenn nur noch eine geringe Menge PBS am Eingang verbleibt. Geben Sie dann jeweils 60 Mikroliter der fünf Milligramm pro Milliliter Genin-Lösung an jeden Eingang und ziehen Sie die Genin-Lösung durch die Geräte, wobei Sie eine Vakuumabsaugspitze am Auslass platzieren.

Stoppen Sie die Absaugung, wenn nur noch eine kleine Menge Lösung am Einlass verbleibt. Geben Sie anschließend Tropfen von PBS sowohl am Einlass als auch am Auslass auf, um ein Austrocknen der Lösung zu verhindern. Während der Inkubation bringen Sie die Schale mit den Geräten in einen befeuchteten Ofen oder Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und inkubieren Sie vier Stunden lang.

Während der Inkubation Fibronectin in steriler, doppelt destillierter Wasser auf eine Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter resuspendieren und nach der Inkubation mit Jin mindestens 30 Minuten auf Eis stellen. Durch den Zulauf minimal PBS ziehen. Danach 100 Mikroliter einer Fibronectin-Lösung mit einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter einsetzen.

An jedem Inlet die Lösung mithilfe einer Vakuumsaugpipettenspitze durch die Geräte ziehen. Am Outlet die abgedeckte Schale mit den Geräten in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Ofen oder Inkubator bringen und 24 Stunden inkubieren. Nach der Inkubation die Geräte vorsichtig von den Deckgläsern lösen, indem man langsam eine Ecke des Geräts ablöst, während man mit der anderen Hand leicht das Deckglas festhält, und anschließend die Deckgläser in sterile Sechs-Well-Platten legen.

Geben Sie mindestens fünf Milliliter Penicillin-Streptomycin-Lösung in jede Vertiefung und stellen Sie die Schalen anschließend mindestens 30 Minuten lang in einen sterilen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Sterilisation saugen Sie die Penicillin-Streptomycin-Lösung ab und besiedeln die Deckgläser mit kultivierten humanen vaskulären glatten Muskelzellen der Nabelschnurarterie in einer Konzentration von 80.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Inkubieren Sie die Zellen vor der Analyse mindestens 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um mit der Untersuchung zu beginnen, geben Sie eine Gewebeprobe in eine 100-Millimeter-Schale. Fügen Sie sterile, vorgewärmte Tyro-Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu, um die Probe zu bedecken. Führen Sie mithilfe eines Rasiermessers mehrere parallele Schnitte durch das Zellblatt senkrecht zur Kanten des Pipettenarms aus.

Erstellen Sie Schnitte, die Gewebeschnitte von etwa zwei Millimetern Dicke ergeben. Dabei entstehen abwechselnd vaskuläre muskuläre Dünnschichten und dünne Streifen, die später entfernt werden. Drehen Sie dann die Schale um 90 Grad und führen Sie zwei gerade parallele Schnitte in der Mitte des Gewebes parallel zum Pia-Streifen durch.

Entfernen Sie die dünnen Streifen zwischen den vaskulären, muskulären, dünnen Filmen, um zu verhindern, dass benachbarte Filme in Kontakt kommen. Stellen Sie anschließend die Schale auf eine temperaturgesteuerte Plattform am Stereomikroskopständer und beginnen Sie, Zeitrafferaufnahmen, Durchlicht- und Fluoreszenzbilder in gewünschten Intervallen während des Behandlungsassays aufzuzeichnen. Behandeln Sie die vaskulären, muskulären, dünnen Filme nacheinander mit 50 Nanomolar Endothelin für 20 Minuten, um Kontraktionen auszulösen, gefolgt von 100 Mikromolar HA 1077 für 30 Minuten, um bei Abkühlung unter 32 Grad Celsius eine Relaxation zu induzieren.

Piam löst sich auf und setzt die dünnen vaskulären Muskelfilme frei. Die Messung der Projektionslänge kann in einen Krümmungsradius umgewandelt werden, der zur Berechnung der durchschnittlichen Spannung in der Zellschicht auf dem Film verwendet wird, wie hier anhand der sequenziellen Durchlichtbilder eines repräsentativen Kontraktilitätsassays gezeigt. Diese Bilder können in Spannungswerte umgerechnet werden, aus denen der basale Tonus und die induzierte Kontraktilität berechnet werden.

In diesem Video ist eine repräsentative Zeitrafferaufnahme eines vollständigen Kontraktilitätsassays zu sehen. Muskuläre dünne Filme erreichen ein kontraktiles Gleichgewicht und kontrahieren sich anschließend stärker nach Zugabe von 50 nmol Endothelin. Ein Film entspannt sich nach Zugabe von 100 µmol HA 1077.

Der leichte Rückgang des basalen Tons und der Gewebekontraktilität am Ende des Assays ist wahrscheinlich eine direkte Folge der verringerten Anzahl an Zellen, aus denen das Gewebe besteht. Da sich unter Serumverarmung befindliche vaskuläre glatte Muskelzellen nicht vermehren, sind hier Phasenkontrastaufnahmen glatter Muskelzellen auf Genin-modifizierten Oberflächen zu sehen, die zu verschiedenen Zeitpunkten zwischen einem Tag und zwei Wochen nach der Entnahme angefertigt wurden. Mithilfe der Immunhistochemie wurde hier die Konfluenz und die zelluläre Ausrichtung der Gewebe hervorgehoben, indem die F-Aktin-Filamente nach ein, vier und sieben Tagen Serumverarmung grün angefärbt wurden.

Die quantitative Beurteilung der Gewebekonfluenz über diesen Zeitraum zeigte eine minimale Verschlechterung auf diesen Oberflächen. Die Ausrichtung der F-Aktin-Filamente wurde quantifiziert, und es wurde bestätigt, dass die Ausrichtung über die zwei Wochen hinweg erhalten blieb. In der Kultur kann, einmal beherrscht, diese Technik zur Herstellung von Gewebe in vitro innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die mikrofluidische Deposition einen Tag vor der geplanten Zellseeding zu beginnen und während der Dünnfilmmessungen eine konstante physiologische Temperatur aufrechtzuerhalten. Nach diesem Verfahren können traditionelle biochemische Methoden wie Western Blotting und PCR durchgeführt werden, um Veränderungen in der Protein- und Genexpression zu untersuchen und den Zellphänotyp mit dem funktionellen Verhalten zu korrelieren. Diese Technik eröffnet Forschern die Möglichkeit, das Fortschreiten langsam auftretender vaskulärer Dysfunktionen wie zerebrale Vasospasmen, Hypertonie und Atherosklerose sowie In-vitro-Modelle der menschlichen Arterienwand zu erforschen.