Name: Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die mikrofluidische Genipin-Abscheidung für die Langzeitkultur vaskulärer muskulärer Dünnschichten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung glatter Muskelkontraktilität über Krankheitszeiträume.

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Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch den American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) und das University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). Wir würdigen auch die Mikrofabrikationsressourcen des Minnesota Nano Center (MNC) und die Bildverarbeitungsressourcen der University Imaging Centers (UIC), beide an der University of Minnesota. Teile dieser Arbeit wurden in der Characterization Facility der University of Minnesota durchgeführt, die teilweise von der NSF im Rahmen des MRS-Programms unterstützt wird.

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<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das auf zuvor entwickelten vMTF Technologie aufbaut, so dass die erweiterte Experiment mal typisch für chronische Gefäßerkrankungen Wege 1,23,24. Um dies zu erreichen, wir Mikro Genipin, die zuvor gezeigt wurde, daß langfristige Funktionalisierung von PDMS Substrate 11 bereitzustellen, unter Verwendung einer Mikrofluid-Abscheidungstechnik Engineered arteriellen Lamellen mit verbesserten vaskulären Gewebelebensfähigkeit zur Verwendung in MTF Kontraktilität Experi...

Gefäßerkrankungen, wie zerebraler Vasospasmus 1,2, Bluthochdruck 3 und Atherosklerose 4 langsam entwickeln, sind in der Regel in der Natur chronischer und beinhalten dysfunktionalen Kraft Generation von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs). Unser Ziel ist es, diese langsam fortschreitenden Gefäßstörungen unter Verwendung von in vitro-Methoden mit feinere Kontrolle der Versuchsbedingungen als in in vivo Modellen zu studieren. Wir haben früher entwickelten Gefäßmuskel Dünnschichten (vMTFs) zum Messen funktionellen Kontraktilität in vitro konstruiert kardiovaskulären Geweben 5, jedoch hat diese Methode auf relativ kurzen Zeitstudien wurde. Hier stellen wir ein Substrat Modifikationstechnik, die unsere früheren vMTF Technik zur langfristigen Messungen ausdehnt. Während das Endothel ist auch in der Gesamtkreislauf-Funktion kritisch, entwickelt arteriellen Lamellen eine nützliche Modellsystem für die Beurteilung von Veränderungen in der GefäßKontraktilität während Fortschreiten der Krankheit. Um einen Funktionskreislauf-Erkrankungen Gewebemodell, sowohl die Struktur und Funktion des arteriellen Lamellen Ingenieur, die Grundkontraktionseinheit des Schiffes, muss mit hoher Wiedergabetreue rekapituliert werden. Arterielle Lamellen sind konzentrisch, in Umfangsrichtung ausgerichteten Blätter kontraktiler VSMCs durch Platten aus Elastin 6 getrennt. Mikrokontaktdrucken von extrazellulärer Matrix (ECM) Proteine ​​auf Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrate bereits verwendet wurde, um Führungssignale für die Gewebeorganisation bereitzustellen auszurichtenden kardiovaskuläres Gewebe 5,7-10 nachahmen. Allerdings gemusterte Gewebe mit Mikrokontaktdruck kann die Integrität nach 3-4 Tagen in Kultur zu verlieren, was ihre Anwendbarkeit in der chronischen Toxizität. Dieses Protokoll stellt eine Lösung für dieses Problem durch den Austausch vorherigen Mikrokontaktdruckverfahren mit einer neuen Mikrofluid-Abscheidungstechnik. Genchi et al. Modifizierten PDMS Substraten mit Genipin und found verlängerte Lebensfähigkeit Muskelzellen bis zu einem Monat in der Kultur 11. Hier verwenden wir einen ähnlichen Ansatz zur Kultur von strukturierten glatten Gefäßmuskelzellen auf PDMS zu verlängern. Genipin, ein natürliches hydrolytische Derivat der Früchte Gardenie, ist ein wünschenswerter Kandidat für Substratmodifikation aufgrund seiner relativ geringen Toxizität gegenüber vergleichbaren Vernetzungsmittel und ihre zunehmende Verwendung als Biomaterial in den Gebieten der Gewebereparatur 12,13 und ECM-Modifikation 14, 15. In diesem Protokoll wird Fibronectin als Zellsignalstoff verwendet wird, wie in den vorangegangenen Mikrokontaktdruckverfahren; jedoch Genipin auf PDMS Substrate vor Fibronektin Strukturieren aufgebracht. Somit wird, wie Zellen verschlechtern die gemusterte Matrix neu synthetisierten ECM von angeschlossenen VSMCs können zur Genipin PDMS beschichteten Substrat zu binden. Dieses Protokoll verwendet eine Mikrofluid-Abgabevorrichtung zur zweistufigen Genipin und ECM-Ablagerung. Das Design der mikrofluidischen Vorrichtung ahmt MicroCONTACT Druckmuster für hochentwickelte arteriellen Lamellen in früheren Studien 16 verwendet. Daher erwarten wir, dass dieses Protokoll, um arterielle Lamellen imitiert, die erfolgreich rekapitulieren die in vivo-Struktur und die Kontraktionsfähigkeit der arteriellen Lamellen hochausgerichtet zu erhalten. Wir evaluieren auch Gewebekontraktionsfähigkeit zu bestätigen, dass Genipin ist ein geeignetes Substrat Modifikationsverbindung für langfristige In-vitro-Kreislauf-Erkrankungen Modelle.

<table><tbody><tr><td>Deckglas-Färbegestell</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>Deckglas für Mikroskope - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poly(N-iso-propylacrylamid) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Mikrokügelchen</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>Siliziumwafer</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Fotolack&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Kontaktmasken-Aligner</td><td>Süss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Entwickler</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-trichlorsilan</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>Chirurgische Biopsie-Stanze</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Corning, Inc.</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Glatte Muskelzellen der Halsarterie</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Lösungskomponenten von Tyrode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>verschiedene</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>Temperaturgesteuerte Plattform</td><td>Warner Instruments</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a>641659</td><td>; 640352; 641922</td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

mikrofluidischen genipin abscheidetechnik für extended kultur von mikrostrukturierten vascular muscular thin films

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

Die chronische Natur des Fortschreitens von Gefäßerkrankungen erfordert die Entwicklung experimenteller Techniken, die physiologisches und pathologisches Gefäßverhalten auf krankheitsrelevanten Zeitskalen simulieren. Früher wurde der Mikrokontaktdruck verwendet, um zweidimensionale funktionelle arterielle Nachahmungen durch Strukturierung von extrazellulären Matrixproteinen als Richtschnur für die Gewebeorganisation herzustellen. Vaskuläre muskuläre dünne Filme nutzten diese Nachahmungen, um die funktionelle Kontraktilität zu beurteilen. Die verwendete Mikrokontaktdruck-Herstellungstechnik enthält jedoch typischerweise hydrophobe PDMS-Substrate. Wenn das Gewebe die darunter liegende extrazelluläre Matrix umdreht, müssen neue Proteine eine Konformationsänderung oder Denaturierung durchlaufen, um hydrophobe Aminosäurereste zur Bindung an die hydrophoben PDMS-Oberflächen freizulegen, was zu einer veränderten Bioaktivität des Matrixproteins, einer Delamination und dem Tod des Gewebes führt.
Hier präsentieren wir eine mikrofluidische Abscheidungstechnik zur Strukturierung der Vernetzerverbindung Genipin. Genipin dient als Vermittler zwischen strukturierten Geweben und PDMS-Substraten und ermöglicht es den Zellen, neu synthetisiertes extrazelluläres Matrixprotein auf einer hydrophileren Oberfläche abzulagern und an die PDMS-Substrate gebunden zu bleiben. Wir zeigen auch, dass extrazelluläre Matrixproteine direkt auf abgelagertes Genipin aufgesetzt werden können, was das Diktat der manipulierten Gewebestruktur ermöglicht. Gewebe, die mit dieser Technik hergestellt wurden, zeigen eine hohe Genauigkeit sowohl in der strukturellen Ausrichtung als auch in der kontraktilen Funktion des glatten Gefäßmuskelgewebes in einem vaskulären muskulären Dünnfilmmodell. Diese Technik kann mit anderen Zelltypen erweitert werden und bildet den Rahmen für zukünftige Studien der chronischen Funktionalität auf Gewebe- und Organebene.

Das primäre Ziel dieser Arbeit war es, die Überlebensfähigkeit der mikro VSMCs auf hydrophoben PDMS Substrate erstrecken. Dies wurde durch Einbringen eines Mikrofluidabgabesystem, um gemusterte Genipin und Fibronektin auf PDMS (Abbildung 1) abzuscheiden bewerkstelligt. Ablagerung von ECM Proteinen unter Verwendung von Mikrofluid-Liefer ergab High Fidelity Übertragung des Kanalmuster mit bloßen PDMS zwischen Zeilen Genipin und Fibronektin (1D). Die anhaftenden Zellen (1E) form</s...

Wir stellen eine Methode zur mikrofluidischen Abscheidung von gemustertem Genipin und Fibronektin auf PDMS-Substraten vor, die eine erweiterte Lebensfähigkeit von Geweben mit vaskulären glatten Muskelzellen ermöglicht. Diese Gewebeherstellungsmethode wird mit der bisherigen vaskulären muskulären Dünnschichttechnologie kombiniert, um die Gefäßkontraktilität über krankheitsrelevante Zeitverläufe zu messen.

Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein In-vitro-Modell der glatten Muskelkontraktionsfunktion zu entwickeln, das zur Untersuchung der Mechanismen vaskulärer Funktionsstörungen wie zerebraler Vasospasmen über krankheitsrelevante Zeitskalen verwendet werden kann. Dies wird mithilfe langzeitstabiler vaskulärer muskulärer Dünnschichten erreicht, indem zunächst Elastomersubstrate hergestellt werden, indem Deckgläser nacheinander mit einem Streifen Piam und anschließend mit PDMS beschichtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, mithilfe einer mikrofluidischen Applikationsvorrichtung nacheinander Genin und Fibronectin auf die Oberfläche aufzutragen.Um Leitstrukturen für die Gewebeselbstorganisation auf vaskulären, muskulären Dünnfilmen bereitzustellen, besteht der letzte Schritt darin, einen Kontraktilitätsassay durchzuführen, bei dem vaskuläre, muskuläre Dünnfilme zur Kontraktion angeregt und anschließend wieder entspannt werden, während die Probe abgebildet wird. Letztendlich ergibt dieser Ansatz Gewebe, die strukturelle Integrität und funktionelle Kontraktilität bis zu zwei Wochen lang in Kultur beibehalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie mikrokontaktgedruckten muskulären Dünnfilmen liegt darin, dass Gewebestabilität und funktionelle Kontraktilität über Wochen hinweg aufrechterhalten werden, während mit früheren Methoden hergestellte Gewebe bereits nach drei bis vier Tagen zu degradieren beginnen.In der Kultur bietet diese Methode eine Plattform zur Untersuchung zentraler Fragen bei Gefäßerkrankungen, beispielsweise wie sich die funktionellen Mechaniken von Arterien während des chronischen Krankheitsverlaufs verändern. Hier untersuchen wir die Gefäßmechanik, doch diese Methode kann auch auf andere modellhafte Organsysteme angewendet werden, wie beispielsweise Organchip-Technologien zur Rekapitulation der Herz- oder Skelettmuskelfunktion. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir das Ziel verfolgten, langsam verlaufende vaskuläre Dysfunktionen zu untersuchen, und feststellten, dass aktuelle Methoden entweder nicht zur Quantifizierung der Funktion vaskulärer glatter Muskelzellen geeignet waren oder die Integrität nicht ausreichend lange aufrechterhalten konnten.Die Jin-Mikrofluidische Deposition bietet eine Vorlage für die Selbstorganisation von Zellen, ähnlich wie das Mikrokontaktdruckverfahren, ermöglicht jedoch auch, dass gemusterte Gewebe ihre Struktur und Integrität über Zeitskalen hinweg beibehalten, die für die Untersuchung der Gefäßumgestaltung geeignet sind. Beginnen Sie damit, eine Charge von Deckgläsern mit 25 mm Durchmesser gemäß dem begleitenden Textprotokoll zu reinigen, und decken Sie die Ränder der gereinigten Deckgläser ab, indem Sie Klebeband an ihren Seiten anbringen, wobei ein freiliegender Glasstreifen in der Mitte verbleibt. Schneiden Sie danach die Deckgläser einzeln aus der Schale heraus und legen Sie sie nacheinander auf eine spinbeschichtete Spannvorrichtung.Unter Verwendung einer Pinzette 150 Mikroliter einer 10%igen Lösung von Poly-N-Isopropylacrylamid, auch Polyacrylamid oder Piam genannt, in 1-Butanol hinzufügen. Sicherstellen, dass der freiliegende Bereich des Deckgläschens vollständig bedeckt ist.Schalten Sie dann den Spin-Coter ein und erhöhen Sie die Drehzahl 10 Sekunden lang auf 3000 U/min. Warten Sie fünf Sekunden und erhöhen Sie dann innerhalb von 10 Sekunden auf 6.000 U/min. Halten Sie eine Minute lang bei 6.000 U/min an und senken Sie die Drehzahl anschließend über einen Zeitraum von 10 Sekunden wieder auf 3000 U/min ab.Halten Sie es fünf Sekunden lang an dieser Stelle, bevor Sie den Spin-Beschichtungszyklus beenden. Entfernen Sie nach dem Trocknen vorsichtig das Klebeband von allen Deckgläsern, sodass das gesamte Deckglas freiliegt und eine dünne Schicht der Piam-Beschichtung in der Mitte des Glasdeckglases verbleibt. Als Nächstes wird eine Schicht entgaste PDMS auf jedes Deckglas spin-beschichtet.Schieben Sie sie in einen Ofen und härten Sie sie bei 90 Grad Celsius für mindestens 1,5 Stunden. Entwerfen Sie eine Gewebemikrofluidik-Fotomaske und bereiten Sie dann wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben einen strukturierten Siliziumwafer vor. Nach der Strukturierung ätzen Sie den Wafer mit Standardverfahren und legen Sie ihn mit der strukturierten Seite nach oben in eine Petrischale.Mischen Sie anschließend 100 Gramm PDMS mit einem Basisverdichter im Verhältnis 10 zu 1, ziehen Sie das PDMS vollständig und gleichmäßig in die Schale, sodass der strukturierte Wafer vollständig bedeckt ist. Stellen Sie die Schale etwa 30 Minuten lang in einen Vakuum-Exsikkator, bis alle Luftblasen entfernt sind. Anschließend härten Sie das PDMS in der Schale bei 90 Grad Celsius mindestens 1,5 Stunden lang aus.Nach der Aushärtung überschüssiges PDMS abschneiden und das verbleibende strukturierte PDMS langsam von der Musterseite des Wafers ablösen. Das überschüssige PDMS rund um die Muster mit einem Rasiermesser abschneiden und die Geräte rechteckig formen, um die Entfernung des Geräts in späteren Schritten zu erleichtern. Anschließend mit einer ein Millimeter großen chirurgischen Biopsiepunch die Einlass- und Auslassöffnungen ausstechen.Sonizieren Sie mikrofluidische Vorrichtungen in 70 % Ethanol für mindestens 30 Minuten vor jedem Gebrauch. Legen Sie bis zu 10 Deckgläser mit vaskulärem muskulärem Dünnschicht-Substrat in einen UV-Ozon-Reiniger für acht Minuten. Bereiten Sie anschließend eine Lösung mit fünf Milligramm pro Milliliter Genin vor, indem Sie ein Milliliter sterile, doppelt destillierte Wasser zu einem Behälter mit fünf Milligramm lyophilisiertem Genin hinzufügen.Mischen Sie die Lösung mit einem Vortex-Mischer und stellen Sie das Gefäß mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur beiseite. Legen Sie die gereinigten mikrofluidischen Geräte mit der Funktionsseite nach unten auf jede Abdeckung. Führen Sie sie einzeln ein.Drücken Sie die Geräte fest auf, um eine dichte Abdichtung an die mit PDMS beschichteten Deckgläser zu gewährleisten. Geben Sie umgehend einen Tropfen 70 %igen Ethanol am Eingang jedes Geräts zur Vorbefüllung des Geräts auf. Nach fünf bis zehn Minuten saugen Sie vorsichtig das überschüssige Ethanol am Eingang ab und ersetzen es unmittelbar durch etwa 100 Mikroliter PBS.Verwenden Sie ein Vakuum, um PBS durch die Geräte bis zum Auslass zu ziehen, um den Ethanol zu entfernen. Stoppen Sie, wenn nur noch eine geringe Menge PBS am Eingang verbleibt. Geben Sie dann jeweils 60 Mikroliter der fünf Milligramm pro Milliliter Genin-Lösung an jeden Eingang und ziehen Sie die Genin-Lösung durch die Geräte, wobei Sie eine Vakuumabsaugspitze am Auslass platzieren.Stoppen Sie die Absaugung, wenn nur noch eine kleine Menge Lösung am Einlass verbleibt. Geben Sie anschließend Tropfen von PBS sowohl am Einlass als auch am Auslass auf, um ein Austrocknen der Lösung zu verhindern. Während der Inkubation bringen Sie die Schale mit den Geräten in einen befeuchteten Ofen oder Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und inkubieren Sie vier Stunden lang.Während der Inkubation Fibronectin in steriler, doppelt destillierter Wasser auf eine Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter resuspendieren und nach der Inkubation mit Jin mindestens 30 Minuten auf Eis stellen. Durch den Zulauf minimal PBS ziehen. Danach 100 Mikroliter einer Fibronectin-Lösung mit einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter einsetzen.An jedem Inlet die Lösung mithilfe einer Vakuumsaugpipettenspitze durch die Geräte ziehen. Am Outlet die abgedeckte Schale mit den Geräten in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Ofen oder Inkubator bringen und 24 Stunden inkubieren. Nach der Inkubation die Geräte vorsichtig von den Deckgläsern lösen, indem man langsam eine Ecke des Geräts ablöst, während man mit der anderen Hand leicht das Deckglas festhält, und anschließend die Deckgläser in sterile Sechs-Well-Platten legen.Geben Sie mindestens fünf Milliliter Penicillin-Streptomycin-Lösung in jede Vertiefung und stellen Sie die Schalen anschließend mindestens 30 Minuten lang in einen sterilen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Sterilisation saugen Sie die Penicillin-Streptomycin-Lösung ab und besiedeln die Deckgläser mit kultivierten humanen vaskulären glatten Muskelzellen der Nabelschnurarterie in einer Konzentration von 80.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Inkubieren Sie die Zellen vor der Analyse mindestens 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Um mit der Untersuchung zu beginnen, geben Sie eine Gewebeprobe in eine 100-Millimeter-Schale. Fügen Sie sterile, vorgewärmte Tyro-Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu, um die Probe zu bedecken. Führen Sie mithilfe eines Rasiermessers mehrere parallele Schnitte durch das Zellblatt senkrecht zur Kanten des Pipettenarms aus.Erstellen Sie Schnitte, die Gewebeschnitte von etwa zwei Millimetern Dicke ergeben. Dabei entstehen abwechselnd vaskuläre muskuläre Dünnschichten und dünne Streifen, die später entfernt werden. Drehen Sie dann die Schale um 90 Grad und führen Sie zwei gerade parallele Schnitte in der Mitte des Gewebes parallel zum Pia-Streifen durch.Entfernen Sie die dünnen Streifen zwischen den vaskulären, muskulären, dünnen Filmen, um zu verhindern, dass benachbarte Filme in Kontakt kommen. Stellen Sie anschließend die Schale auf eine temperaturgesteuerte Plattform am Stereomikroskopständer und beginnen Sie, Zeitrafferaufnahmen, Durchlicht- und Fluoreszenzbilder in gewünschten Intervallen während des Behandlungsassays aufzuzeichnen. Behandeln Sie die vaskulären, muskulären, dünnen Filme nacheinander mit 50 Nanomolar Endothelin für 20 Minuten, um Kontraktionen auszulösen, gefolgt von 100 Mikromolar HA 1077 für 30 Minuten, um bei Abkühlung unter 32 Grad Celsius eine Relaxation zu induzieren.Piam löst sich auf und setzt die dünnen vaskulären Muskelfilme frei. Die Messung der Projektionslänge kann in einen Krümmungsradius umgewandelt werden, der zur Berechnung der durchschnittlichen Spannung in der Zellschicht auf dem Film verwendet wird, wie hier anhand der sequenziellen Durchlichtbilder eines repräsentativen Kontraktilitätsassays gezeigt. Diese Bilder können in Spannungswerte umgerechnet werden, aus denen der basale Tonus und die induzierte Kontraktilität berechnet werden.In diesem Video ist eine repräsentative Zeitrafferaufnahme eines vollständigen Kontraktilitätsassays zu sehen. Muskuläre dünne Filme erreichen ein kontraktiles Gleichgewicht und kontrahieren sich anschließend stärker nach Zugabe von 50 nmol Endothelin. Ein Film entspannt sich nach Zugabe von 100 µmol HA 1077.Der leichte Rückgang des basalen Tons und der Gewebekontraktilität am Ende des Assays ist wahrscheinlich eine direkte Folge der verringerten Anzahl an Zellen, aus denen das Gewebe besteht. Da sich unter Serumverarmung befindliche vaskuläre glatte Muskelzellen nicht vermehren, sind hier Phasenkontrastaufnahmen glatter Muskelzellen auf Genin-modifizierten Oberflächen zu sehen, die zu verschiedenen Zeitpunkten zwischen einem Tag und zwei Wochen nach der Entnahme angefertigt wurden. Mithilfe der Immunhistochemie wurde hier die Konfluenz und die zelluläre Ausrichtung der Gewebe hervorgehoben, indem die F-Aktin-Filamente nach ein, vier und sieben Tagen Serumverarmung grün angefärbt wurden.Die quantitative Beurteilung der Gewebekonfluenz über diesen Zeitraum zeigte eine minimale Verschlechterung auf diesen Oberflächen. Die Ausrichtung der F-Aktin-Filamente wurde quantifiziert, und es wurde bestätigt, dass die Ausrichtung über die zwei Wochen hinweg erhalten blieb. In der Kultur kann, einmal beherrscht, diese Technik zur Herstellung von Gewebe in vitro innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die mikrofluidische Deposition einen Tag vor der geplanten Zellseeding zu beginnen und während der Dünnfilmmessungen eine konstante physiologische Temperatur aufrechtzuerhalten. Nach diesem Verfahren können traditionelle biochemische Methoden wie Western Blotting und PCR durchgeführt werden, um Veränderungen in der Protein- und Genexpression zu untersuchen und den Zellphänotyp mit dem funktionellen Verhalten zu korrelieren. Diese Technik eröffnet Forschern die Möglichkeit, das Fortschreiten langsam auftretender vaskulärer Dysfunktionen wie zerebrale Vasospasmen, Hypertonie und Atherosklerose sowie In-vitro-Modelle der menschlichen Arterienwand zu erforschen.

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (&lt;30 um) beschrieben.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Die Erzeugung von funktionellen Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten erfordert die Stabilisierung von Zellphänotypen durch Anpassung traditioneller Zellkulturtechniken an die begrenzten räumlichen Dimensionen in Mikrogeräten. Die Modifikation von Kollagen ermöglicht die schichtweise Abscheidung ultradünner Kollagenanordnungen, die Primärzellen wie Hepatozyten als mikrofluidische Gewebemodelle stabilisieren können.

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Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung einer bildgeführten, laserbasierten Hydrogeldegradation zur Herstellung von vaskulär abgeleiteten, biomimetischen mikrofluidischen Netzwerken, die in Poly(ethylenglykol)-diacrylat (PEGDA) Hydrogele eingebettet sind. Diese biomimetischen mikrofluidischen Systeme können für Tissue-Engineering-Anwendungen, die Generierung von In-vitro-Krankheitsmodellen und die Herstellung fortschrittlicher "On-a-Chip"-Geräte nützlich sein.

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

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Das Protokoll beschreibt, wie ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid zu konstruieren. Das Sphäroid umliegenden Mikroumgebung ist entworfen, um induzieren Angiogenese und der Sphäroid an die Mikrokanäle in einem mikrofluidischen Gerät anschließen. Die Methode erlaubt die Perfusion der Sphäroid, das eine lang ersehnte Technik in dreidimensionale Kulturen ist.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein dreidimensionales vereinfachtes und undifferenziertes Hautmodell unter Verwendung einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform zu generieren. Ein paralleler Strömungsansatz ermöglicht die In-situ-Ablagerung eines Hautkompartiments für die Aussaat von Epithelzellen auf der Oberseite, die alle von Spritzenpumpen gesteuert werden.

Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

Lernen Sie die mikrofluidische Genipin-Abscheidung für die Langzeitkultur vaskulärer muskulärer Dünnschichten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung glatter Muskelkontraktilität über Krankheitszeiträume.

Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

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