Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

Das übergeordnete Ziel des Augenreizungstests ist es, Stoffe und Gemische nach ihrem Augenreizungspotenzial zu klassifizieren und zu kennzeichnen. Bei diesem Verfahren wird ein dreidimensional rekonstruiertes, hornhautähnliches Gewebemodell verwendet. Nach der Ankunft wird das Testkit über Nacht im Testmedium vorinkubiert, am folgenden Tag wird das Gewebe hydratisiert, gefolgt von der topischen Anwendung der Positiv- und Negativkontrollen und der interessierenden Testchemikalien auf die Oberflächen des Gewebes in doppelter Ausführung.

Nach einer festgelegten Expositionsphase werden die Chemikalien durch Waschen entfernt. Die Gewebe werden in frischem Assay-Medium nachinkubiert und die Toxizität der Chemikalien wird dann durch einen MTT-Assay bewertet. Letztlich kann das reizende Potential der Prüflinge beurteilt werden, indem die relative Lebensfähigkeit des mit dem Prüfling behandelten Gewebes mit dem der Negativkontrolle behandelten Gewebe verglichen wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie z.B. Schnellspurenreizungstests besteht darin, dass keine Labortiere beteiligt sind. Es verwendet in vitro ein dekonstruiertes hornhautähnliches Gewebemodell, das aus normalen menschlichen Zellen besteht. Es ist auf alle Arten von Substanzen und Gemischen anwendbar und kann zwischen Chemikalien unterscheiden, die Augenreizungen oder schwere Augenschäden durch Materialien hervorrufen.

Nicht reizend, die nicht klassifiziert und gekennzeichnet werden müssen. Die rekonstruierte menschliche Hornhaut wie Epithelgewebe oder epi. Das Okular wird in Einsätzen mit einer porösen Membran vorbereitet, durch die die Nährstoffe zu den Zellen gelangen.

Rekonstruiertes Gewebe bildet ein nicht keratinisiertes Epithel, das das Hornhautepithel mit progressiv geschichteten, aber nicht verhornten Zellen modelliert. Nach Erhalt des humanen hornhautähnlichen Epithel-Kits äquilibrieren Sie das Gewebe im 24-Well-Versandbehälter auf Raumtemperatur. Öffnen Sie nach 15 Minuten den Beutel mit der 24-Well-Gewebeplatte unter sterilen Bedingungen und untersuchen Sie alle Gewebe auf Luftblasen zwischen dem Agros-Gel und den Einsätzen. Schneiden. Öffnen Sie das Klebeband.

Entfernen Sie die Abdeckung mit einer sterilen Gaze und inspizieren Sie die Gewebeoberfläche. Als nächstes aliquotiert ein Milliliter des 37 Grad Celsius Kit-Assay-Mediums in die Vertiefungen der vormarkierten Sechs-Well-Platten. Tupfen Sie dann das Gewebe mit den Einsätzen vorsichtig auf steriler Gaze ab, um alle verbleibenden Transportmittel zu entfernen, und legen Sie sie in die einzelnen Vertiefungen der sechs Vertiefungsplatten.

Ersetzen Sie das Medium nach einer Stunde durch einen Milliliter frisches 37 Grad Celsius heißes Testmedium und inkubieren Sie das Gewebe über Nacht unter Standardkulturbedingungen. Am nächsten Tag streichle ich 20 Mikroliter kalzium- und magnesiumfreies DPBS auf die apikale Oberfläche jedes Gewebes. Wenn sich das DPBS nicht über das Gewebe verteilt, halten Sie den Einsatz vorsichtig mit einer Pinzette fest und klopfen Sie auf die Platte, um sicherzustellen, dass die Kochsalzlösung die gesamte Gewebeoberfläche benetzt.

Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang. Um das Gewebe dann mit flüssigen Testartikeln zu behandeln, geben Sie 50 Mikroliter der Negativkontrolle, der Positivkontrolle und der entsprechenden Testartikel in zweifacher Ausfertigung gemäß dem Zeitplan. Achten Sie darauf, dass die Behandlungen die gesamten Gewebeoberflächen abdecken und inkubieren Sie dann die Einsätze 30 Minuten lang, um das Gewebe mit festen Testobjekten zu behandeln.

Übertragen Sie zunächst die Einsätze auf eine sterile Oberfläche. Halten Sie die Platte abgedeckt, um eine Kontamination mit festen Partikeln in der Luft zu vermeiden. Tragen Sie dann mit einem nivellierten Löffel 50 Milligramm des Testobjekts gemäß dem Zeitplan auf das doppelte Gewebe auf und achten Sie darauf, dass die Behandlung die gesamte Gewebeoberfläche abdeckt.

Alternativ können Sie eine vorgefüllte Ein-Milliliter-Spritze verwenden, bei der der Kopf abgeschnitten ist. Um die Pulver direkt auf die Kultur zu geben. Drücken Sie den Kolben, um das Pulver sofort nach dem Auftragen der festen Testartikel aufzutragen, setzen Sie die Einsätze wieder auf ihre Sechs-Well-Platten ein und inkubieren Sie die Gewebe sechs Stunden lang, um die Gewebe zu spülen.

Nach der Behandlung werden am Ende der Expositionsinkubation 3 150-Milliliter-Becher pro Prüfling mit 100 Millilitern DPBS befüllt. Fassen Sie die obere Kante der Einsätze mit einer gebogenen Pinzette, um sie aus den Vertiefungen zu entfernen. Nehmen Sie dann mit einer Pinzette zwei Einsätze aus der gleichen Behandlung an ihren oberen Kanten auf und dekantieren Sie die Behandlungen auf ein sauberes, saugfähiges Material.

Tauchen Sie dann die Einsätze in den ersten Becher von DPBS und waschen Sie die Taschentücher zwei Sekunden lang mit kreisenden Drehbewegungen. Heben Sie dann die Einsätze so an, dass sie größtenteils mit DPBS gefüllt sind und füllen Sie die Flüssigkeit zurück in das Becherglas. Wiederholen Sie den Waschgang zweimal im ersten Becherglas.

Spülen Sie dann die Einsätze im zweiten und dritten Becherglas von DPB S3 nach der letzten Wäsche jeweils mal auf die gleiche Weise aus. Drehen Sie jeden Einsatz in einem Winkel von ca. 45 Grad, wobei das offene Ende nach unten zeigt, und berühren Sie mit der Oberlippe das saugfähige Material, um das verbleibende DPBS zu dekantieren. Tauchen Sie das Gewebe dann sofort in fünf Milliliter Testmedium bei Raumtemperatur.

Am Ende der Immersionsphase nach dem Einweichen wird das Assay-Medium in einer vorbeschrifteten 12-Well-Platte dekantiert und die Einsätze auf ein absorbierendes Material getupft. Übertragen Sie dann die Einsätze in eine neue Sechs-Well-Platte, die einen Milliliter warmes Assay-Medium pro Well enthält, und legen Sie die Platten in den Inkubator, um den MTT-Viabilitätsassay zu starten. Übertragen Sie die Einsätze in eine 24-Well-Platte mit 0,3 Millilitern frisch zubereiteter MTT-Lösung.

Tupfen Sie die Einsätze vor dem Transfer auf das saugfähige Material. Lassen Sie alle Luftblasen los, die unter den Einsätzen eingeschlossen sind, und geben Sie das Gewebe nach drei Stunden wieder in den Inkubator. Geben Sie die Böden der Einsätze auf das saugfähige Material. Tauchen Sie dann für die Unterwasserextraktion von flüssigen Testartikeln ohne Farbstoffe die Einsätze in eine vorbeschriftete 24-Well-Platte, die zwei Milliliter der entsprechenden Extraktionslösung pro Well für eine nicht getauchte Extraktion von festen oder flüssigen Farbstoffen enthält.

Übertragen Sie die Einsätze in eine vorbeschriftete Platte mit sechs Vertiefungen, die einen Milliliter Extraktionslösung pro Vertiefung enthält. Versiegeln Sie dann die Platten mit einem Heißsiegelgerät oder Paraform, um die Verdunstung zu hemmen, und extrahieren Sie sie zwei bis drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler mit leichtem Schütteln am Ende der eingetauchten Extraktion. Durchstechen Sie die Taschentücher und dekantieren Sie dann die Flüssigkeit in jedem Einsatz zurück in das, dann entsorgen Sie die Einsätze mit den Taschentüchern.

Mischen Sie die Extraktlösung in jeder Vertiefung und überführen Sie zwei 200-Mikroliter-Aliquots jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen einer vormarkierten 96-Well-Platte, wie im Schema am Ende der nicht getauchten Extraktion dargestellt. Entsorgen Sie die Einsätze und Taschentücher ohne Durchstechen und fügen Sie jeweils einen Milliliter Extraktionslösung hinzu. Mischen Sie die Extraktionslösung in den Vertiefungen und überführen Sie zwei 200-Mikroliter-Aliquote aus jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen einer vormarkierten 96-Well-Platte, wie gerade gezeigt.

Abschließend lesen Sie die optische Dichte der Proben in einem 96-Well-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern ohne Verwendung eines Referenzfilters ab und geben die Ergebnisse in eine Tabelle ein, um die jeweiligen Gewebeverbindlichkeiten zu berechnen. Unter Berücksichtigung von Korrekturen aufgrund chemischer Interferenzen, wie hier im Textprotokoll angegeben, werden in diesem Versuch repräsentative Testergebnisse für Augenreizungen gezeigt, die mit 10 Prüflingen sowie Negativ- und Positivkontrollen durchgeführt wurden. Bei der Negativkontrolle wurde eine mittlere optische Dichte von 1,31 beobachtet, was einer Gewebeviabilität von 100 % entspricht, bei einer relativen Gewebeviabilität von 31,2 %. Bei den Positivkontrolltests wiesen die Artikel 1, 2, 4, 7 und acht Gewebevariabilitäten von mehr als 60 % auf, was diese Artikel als nicht reizend einstufte Testartikel 3, 5, 6, 9 und 10.

Auf der anderen Seite wiesen Gewebevariabilitäten von weniger als oder gleich 60 % auf, was zu ihrer Einstufung als Reizstoffe führte. Der Unterschied in der Lebensfähigkeit des Gewebes zwischen doppelten Geweben in diesem Experiment betrug bei allen getesteten Artikeln weniger als 20 %, mit Ausnahme des zweiten Versuchsartikels. Daher wurden die Ergebnisse für alle Prüfartikel mit Ausnahme des zweiten Prüflings als qualifiziert angesehen, da sie alle Akzeptanzkriterien für den Augenreizungstest erfüllten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der DICATION-Test durchgeführt werden sollte, wobei in vitro rekonstruktive menschliche Hornhaut wie das Gewebemodell vier verwendet wird, die Gefahrenkennzeichnung von Chemikalien. Dieses Verfahren wurde in den EOC D-Testrichtlinien als Teil der Tier-Testing-Strategie implementiert.