Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen In-vitro- Modell der Atemwegswand

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein dreidimensionales phasisches Gerüst elektrospinnt zu betreiben, das die Kokultivierung vollständig differenzierter adulter menschlicher Zellen ermöglicht, um die natürliche extrazelluläre Matrix, auf die diese Zellen in C zwei treffen, zu replizieren. Dies wird durch das erste Elektrospinnen erreicht, ein zufällig ausgerichtetes Mikrofasergerüst. Der zweite Schritt besteht darin, ein biphasisches Gerüst zu bilden, indem eine zufällig ausgerichtete Nanofaserschicht direkt auf das Mikrofasergerüst elektrogesponnen wird.

Als nächstes wird ein separates, ausgerichtetes Nanofasergerüst mit Elektrosen gesponnen. Der letzte Schritt besteht darin, jedes Gerüst mit seinem jeweiligen Zelltyp zu besäen und die Gerüste in einem stark genutzten Bioreaktorsystem als ein einziges Konstrukt zu co-kultivieren. Letztendlich können multizelluläre Wechselwirkungen durch Messung der Mediatorfreisetzung und Immunfärbung analysiert werden.

Das Konstrukt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie 2D-transformierten Membranen besteht darin, dass elektrische Gerüste eine 3D-Faserumgebung bieten, die angepasst werden kann, um eine physiologisch relevante Morphologie bereitzustellen. Es handelt sich um eine porösere Struktur, die die Kernkultur mehrerer Zelltypen ermöglicht.

Diese Methode bietet eine stabile Plattform, bei der entweder kohortierte, erkrankte oder gesunde menschliche Zellen als In-vitro-Modell verwendet werden. Dies wird dazu beitragen, unsere Abhängigkeit von Tiermodellen zu verringern, die in ihrer Relevanz für menschliche Krankheiten begrenzt sind, und die Anzahl der in Versuchen verwendeten Tiere zu verringern. Obwohl diese Methode Einblicke in Krankheiten wie Asthma und COPD geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. für die Untersuchung von entzündlichen Erkrankungen des Darms oder für die Entwicklung eines Hautmodells für chemische Tests.

Bereiten Sie zunächst drei verschiedene 10-Milliliter-PET-Lösungen vor, indem Sie 8 %, 10 % und 30 % PET in Eins-zu-Eins-Mischungen aus Chlormethan und Trichloressigsäure auflösen. Rühren Sie die Lösungen über Nacht bei Raumtemperatur auf, um das PET am nächsten Tag aufzulösen. Füllen Sie die PET-Lösungen in Spritzen um und befestigen Sie eine 23-Gauge-Nadel an der Spritze mit der 8%-Mischung und 18-Gauge-Nadeln an den beiden anderen Spritzen mit der 10%- und 30%igen PET-Lösung.

Bereiten Sie das Mikrofasergerüst vor. Laden Sie zunächst die Spritze mit der 30%igen PET-Lösung mit der Nadelspitze nach unten in die Spritzenpumpe. Positionieren Sie das Manl 15 Zentimeter von der Nadelspitze entfernt und stellen Sie sicher, dass die Nadel in der Mitte der Trommel zeigt.

Befestigen Sie die positive elektrische Zuleitung mit einer metallischen Krokodilklemme an der Nadelspitze und erden Sie die Manl, indem Sie die Erdungsleitung mit der Bananenbuchse verbinden. Schalten Sie den Motor ein und stellen Sie die Drehzahl auf 60 U/min ein. Schalten Sie die Spritzenpumpe ein, um eine Durchflussmenge von 2,0 Millilitern pro Stunde zu erreichen.

Bei der Herstellung der Mikrofasergerüste. Lassen Sie die Pumpe laufen, bis die Lösung aus der Nadelspitze extrudiert ist, um das System zu entlüften, indem Sie jegliche Luft aus der Nadel entfernen. Stoppen Sie dann die Pumpe an der Spritzenpumpe.

Stellen Sie das Gesamtvolumen der auszustoßenden Lösung auf zwei Milliliter ein und starten Sie die Pumpe. Legen Sie dann ein Potential von 14 Kilovolt zwischen der Nadel und dem Dorn an, drehen Sie sich eine Stunde lang, bis zwei Milliliter der 30%igen PET-Lösung mit dem Mikrofasergerüst noch auf dem Dorn elektrogeschleudert wurden, um das Spannungspotential auszuschalten. Entfernen Sie die Krokodilklammer und ersetzen Sie die Spritze mit der 30%igen PET-Lösung durch die Spritze mit der 8%igen PET-Lösung.

Verbinden Sie dann die Krokodilklammer wieder mit der 23-Gauge-Nadel. Ändern Sie die Durchflussmenge der Spritzenpumpe auf 0,5 Milliliter pro Stunde und entleeren Sie die Nadel, indem Sie die Spritzenpumpe laufen lassen, bis die Lösung aus der Spitze fließt. Während sich der Dorn weiterhin mit 60 U/min dreht, legen Sie das 14-Kilovolt-Potential zwischen der Nadelspitze und dem Dorn an und stellen Sie das von der Spritzenpumpe zu extrudierende Gesamtvolumen auf zwei Milliliter ein.

Vier Stunden lang elektrisch schleudern, bis zwei Milliliter der 8%igen PET-Lösung elektrisch geschleudert wurden. Wenn das Elektrospinnen abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und schalten Sie den Motor aus, um den Dorn zu drehen. Schneiden Sie das zweiphasige Gerüst mit einer Klinge entlang der Breite des Dorns, um eine 2D-Gerüstplatte in der Größe der Dornoberfläche herzustellen.

Um ausgerichtete PET-Gerüste vorzubereiten, laden Sie die Spritze mit 10%iger PET-Lösung mit der Nadelspitze nach unten in die Spritzenpumpe. Verbinde dann die Krokodilklammer mit der Nadel. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,5 Milliliter pro Stunde ein und grundieren Sie die Nadel mit PET-Lösung.

Schalten Sie dann den Motor ein und stellen Sie die Dorndrehzahl auf 2000 U/min ein. Schalten Sie anschließend die Spritzenpumpe ein. Stellen Sie die Spannungsversorgung auf 14 Kilovolt ein und schalten Sie die Stromversorgung für vier Stunden ein, bis zwei Milliliter Lösung elektrisch geschleudert wurden.

Wenn das Elektrodrehen abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung und den Motor aus. Schneiden Sie das Gerüst mit einer Klinge entlang der Breite des Dorns, um ein ausgerichtetes 2D-Gerüstblatt zu erzeugen. Bewahren Sie die elektrogesponnenen Gerüste in Alufolie auf, um die elektrostatische Aufladung zu reduzieren.

Verwenden Sie einen Biopsiestift mit einem Durchmesser von 0,8 Millimetern, um Scheiben aus zweiphasigen oder ausgerichteten Gerüsten aus den SPU-Blättern auszustanzen. Anschließend kleben Sie die zweiphasige Gerüstscheibe mit ungiftigem Aquarienkleber auf eine Dichtung. Legen Sie die Dichtungen und Gerüste in eine 12-Well-Gewebekulturplatte.

Sterilisieren Sie die Dichtungen und Gerüste mit ultravioletter I-Strahlung für 30 Minuten auf jeder Seite der Gerüste. Dann am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius in einer 20%igen antibiotischen Antimykotikum einweichen. Waschen Sie Gerüste mit PP S3 mal und lagern Sie die Gerüste in PBS bei vier Grad Celsius, bis sie verwendet werden.

Übertragen Sie die biphasischen Gerüste aus dem PBS in eine frische 12-Well-Platte und erwärmen Sie sie in DMEM-Medien, ergänzt mit 10%FCS, für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das mit DMEM ergänzte Medium und legen Sie die Mikrofaserphase des Gerüsts mit dem Saatgut von 15.000 MRC, fünf Fibroblastenzellen in 30 Mikrolitern DMEM-supplementiertem Medium auf jedes Gerüst, um den Fibroblasten zu helfen, in das Gerüst einzudringen. Stellen Sie die Platte auf einen Schwinger und bewegen Sie die Gerüste zwei Stunden lang bei 100 U/min.

Geben Sie dann zwei Milliliter DMEM-ergänztes Medium auf jedes Gerüst und inkubieren Sie die Gerüste über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium aus den Vertiefungen und drehen Sie die Gerüste um, so dass die Nanofaserphase der Gerüste apikal zeigt. Dann säen 30.000 Cali drei Epithelzellen in 30 Mikrolitern D-M-E-M-F 12 Medien ergänzt mit 10% FCS auf die Nanofaserphase des Gerüsts.

Inkubieren Sie das Gerüst zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die Gerüste in eine 70 30 Mischung aus D-M-E-M-F, 12 und DMEM getaucht und mit der statischen Inkubation für weitere 12 Stunden fortfahren, um die Atemwege zu kultivieren. Glatte Muskelzellen übertragen zunächst die ausgerichteten Gerüste aus dem PBS in eine frische 12-Well-Platte und erwärmen sie und DMEM-supplementierte Medien eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das mit DMEM ergänzte Medium und geben Sie 25.000 glatte Muskelzellen der Atemwege in 30 Mikrolitern DMEM-supplementierten Medien zu jedem Gerüst und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Tauchen Sie die Gerüste nach dem Anbringen in DMEM-ergänzte Medien. Stellen Sie sie wieder in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht stehen, bevor Sie eine Trikultur im Bioreaktor einrichten. Setzen Sie am nächsten Tag das zweiphasige Saatgutgerüst mit der Epithelphase nach oben in die Kammer des Bioreaktors ein.

Platzieren Sie dann das ausgerichtete Gerüst so unter dem zweiphasigen Gerüst, dass es an die Mikrofaserphase des zweiphasigen Gerüsts angrenzt. Verriegeln Sie die beiden Kammern des Bioreaktors. Montieren Sie dann zwei Perfusionsflusskreisläufe in einem Inkubator, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, und pumpen Sie das Medium nach einer Woche mit einer Peristaltikpumpe mit etwa 0,1 Millilitern pro Minute um die beiden Kreisläufe.

Entfernen Sie das Medium aus der apikalen Kammer und der Kultur. Die Epithelzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für eine weitere Woche, bevor sie nach zwei Wochen im Bioreaktor analysiert wurden, wurde das hier gezeigte Tri-Kultur-Gerüst fixiert und geschnitten, um Zellkerne zu zeigen, die über alle drei Schichten des Konstrukts verteilt waren, Zellkerne wurden mit DPI gefärbt und erscheinen blau, wo das Gerüstmaterial grau erscheint. Hier sind Rasterelektronenmikroskopische Bilder der elektrogesponnenen Nanofaser-Mikrofaser und ausgerichteten Gerüste, die für die Aussaat von Epithelzellen, Fibroblasten bzw. glatten Muskelzellen vorbereitet wurden.

Alle drei Zelltypen zeigten eine Zunahme der Lebensfähigkeit, wenn sie über einen Zeitraum von zwei Wochen auf ihren individuellen Gerüsten kultiviert wurden. Sie exprimierten auch nach der zweiwöchigen Kulturperiode weiterhin zelltypspezifische Proteine. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die native extrazelluläre Matrix zu erforschen, die Sie mit den Elektrofasern nachbilden möchten.

Eine Zelle verhält sich unterschiedlich, wenn sie sich an verschiedene 3D-Topographien anheftet. So bilden Epithelzellen nur dann eine funktionelle Barriere, wenn sie auf Nanofasern kultiviert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein mehrschichtiges Co-Kultursystem aufbaut, das für die Untersuchung interzellulärer Interaktionen in einer dynamischen Kulturumgebung verwendet werden kann.

Vergessen Sie nicht, dass es wichtig ist, Ihre Elektrospinnparameter wie Durchflussrate und Spannung an das Polymer- und Lösungsmittelsystem anzupassen, das Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens verwenden möchten. Dies ist entscheidend für die Erzeugung der gewünschten Fasern. Denken Sie außerdem daran, eine belüftete Dunstabzugshaube oder einen Schrank zu drehen, damit die Lösungsmittel ordnungsgemäß abgesaugt werden können.