Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Elektrospinnen ein dreidimensionales phasengetrenntes Gerüst herzustellen, das die gleichzeitige Kultivierung vollständig differenzierter erwachsener menschlicher Zellen ermöglicht, um die natürliche extrazelluläre Matrix nachzubilden, der diese Zellen in C zwei begegnen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein zufällig ausgerichtetes Mikrofasergerüst elektrogesponnen wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein zweiphasiges Gerüst zu bilden, indem eine zufällig ausgerichtete Nanofaser-Schicht direkt auf das Mikrofasergerüst elektrogesponnen wird.

Anschließend wird ein separater ausgerichteter Nanofaser-Scaffold elektrogesponnen. Der letzte Schritt besteht darin, jeden Scaffold mit dem jeweiligen Zelltyp zu besiedeln und die Scaffold in einem perfundierten Bioreaktorsystem als einzelnen Verbund zu kultivieren. Letztlich können multizelluläre Interaktionen durch die Messung der Freisetzung von Mediatoren und Immunfärbungen analysiert werden.

Der Konstrukt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie 2D-transformierten Membranen besteht darin, dass elektrische Gerüste eine 3D-faserige Umgebung bereitstellen, die angepasst werden kann, um eine physiologisch relevante Morphologie zu erzeugen. Es handelt sich um eine porösere Struktur, die die gleichzeitige Kultivierung mehrerer Zelltypen im Kern ermöglicht.

Diese Methode bietet eine stabile Plattform, die entweder kohortierte, kranke oder gesunde menschliche Zellen als in-vitro-Modell verwendet. Dies trägt dazu bei, unsere Abhängigkeit von Tierversuchen zu verringern, die in ihrer Relevanz für menschliche Erkrankungen begrenzt sind, und reduziert die Anzahl der Tiere, die in Experimenten eingesetzt werden. Obwohl diese Methode Einblicke in Erkrankungen wie Asthma und COPD ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise zur Untersuchung entzündlicher Darmerkrankungen oder zur Entwicklung eines Hautmodells für chemische Tests.

Bereiten Sie zunächst drei verschiedene 10-Milliliter-Lösungen von PET vor, indem Sie 8 %, 10 % und 30 % PET in jeweils ein- zu ein-Mischungen aus Chloromethan und Trichloressigsäure auflösen. Rühren Sie die Lösungen über Nacht bei Raumtemperatur, um das PET am nächsten Tag vollständig aufzulösen. Überführen Sie die PET-Lösungen in Spritzen und befestigen Sie eine 23-Gauge-Nadel an der Spritze mit der 8 %-Mischung sowie 18-Gauge-Nadeln an den beiden anderen Spritzen mit den 10 %- und 30 %-PET-Lösungen.

Bereiten Sie das Mikrofasergeflecht vor. Laden Sie zunächst die Spritze, die die 30 %ige PET-Lösung enthält, in die Spritzenpumpe, wobei die Nadelspitze nach unten zeigt. Positionieren Sie die Trommel 15 Zentimeter von der Nadelspitze entfernt und stellen Sie sicher, dass die Nadel auf die Mitte der Trommel gerichtet ist.

Verbinden Sie die positive elektrische Zuleitung mit der Nadelspitze mithilfe eines metallischen Krokodilklemms und erden Sie den Manl, indem Sie die Erdungsleitung mit der Bananenbuchse verbinden. Schalten Sie den Motor ein und stellen Sie die Drehzahl des Manl auf 60 U/min ein. Schalten Sie die Spritzenpumpe ein, um eine Flussrate von 2,0 Milliliter pro Stunde bereitzustellen.

Während der Herstellung der Mikrofaserscaffolds. Lassen Sie die Pumpe laufen, bis Lösung aus der Nadelöffnung austritt, um das System zu entlüften und etwaige Luft in der Nadel zu entfernen. Stoppen Sie dann die Pumpe des Spritzenpumpsystems.

Stellen Sie das Gesamtvolumen der auszupresenden Lösung auf zwei Milliliter ein und starten Sie die Pumpe. Anschließend wird eine Spannung von 14 Kilovolt zwischen der Nadel und dem Mandrel angelegt, um eine Elektrospinnung für eine Stunde durchzuführen, bis zwei Milliliter der 30 %igen PET-Lösung elektrogesponnen wurden. Solange das Mikrofaserscaffold noch auf dem Mandrel befindlich ist, wird die elektrische Spannung abgeschaltet. Entfernen Sie die Krokodilklemme und ersetzen Sie die Spritze mit der 30 %igen PET-Lösung durch die Spritze mit der 8 %igen PET-Lösung.

Verbinden Sie dann die Krokodilklemme erneut mit der Nadel mit 23 Gauge. Ändern Sie die Flussrate der Spritzenpumpe auf 0,5 Milliliter pro Stunde und spülen Sie die Nadel vor, indem Sie die Spritzenpumpe so lange laufen lassen, bis die Lösung aus der Spitze austritt. Während der Dorn weiterhin mit 60 U/min rotiert, legen Sie eine elektrische Spannung von 14 Kilovolt zwischen die Nadelspitze und den Dorn an und stellen Sie das Gesamtvolumen, das von der Spritzenpumpe ausgestoßen werden soll, auf zwei Milliliter ein.

Elektrospinnen Sie vier Stunden lang, bis zwei Milliliter der 8 %igen PET-Lösung elektrogesponnen wurden. Sobald das Elektrospinnen abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung und den Motor, der den Mandrel dreht, aus. Schneiden Sie das biphasische Gerüst mit einer Klinge entlang der Breite des Mandrels auf, um ein zweidimensionales Gerüstblatt in der Größe der Oberfläche des Mandrels zu erhalten.

Um ausgerichtete PET-Gerüste herzustellen, füllen Sie die Spritze mit 10 %iger PET-Lösung in die Spritzenpumpe ein, wobei die Nadelspitze unten ist. Anschließend verbinden Sie die Krokodilklemme mit der Nadel. Stellen Sie die Flussrate auf 0,5 Milliliter pro Stunde ein und befüllen Sie die Nadel mit der PET-Lösung.

Schalten Sie dann den Motor ein und stellen Sie die Spindeldrehzahl auf 2000 U/min ein. Schalten Sie als Nächstes die Spritzenpumpe ein. Stellen Sie die Spannungsversorgung auf 14 Kilovolt ein und schalten Sie die Hochspannungsversorgung für vier Stunden ein, bis zwei Milliliter der Lösung elektrogesponnen wurden.

Wenn das Elektrospinnen abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung und den Motor aus. Schneiden Sie das Gerüst mit einer Klinge entlang der Breite des Mandrels, um ein ausgerichtetes zweidimensionales Blatt des Gerüsts zu erhalten. Lagern Sie die elektrogesponnenen Gerüste in Aluminiumfolie, um die elektrostatische Aufladung zu verringern.

Verwenden Sie einen Biopsiestift mit einem Durchmesser von 0,8 Millimetern, um Scheiben aus biphasischen oder ausgerichteten Gerüsten aus den SPU-Blättern auszustanzen. Kleben Sie dann die Scheibe des biphasischen Gerüsts mit ungiftigem Aquariumkleber auf eine Dichtung. Platzieren Sie die Dichtungen und Gerüste in eine 12-Loch-Gewebekulturplatte.

Die Dichtungen und Gerüste mithilfe von UV-Strahlung der Klasse I je 30 Minuten auf jeder Seite sterilisieren. Anschließend am nächsten Tag über Nacht in einer 20%igen Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung bei vier Grad Celsius einweichen. Die Gerüste dreimal mit PBS waschen und anschließend in PBS bei vier Grad Celsius lagern, bis sie verwendet werden.

Überführen Sie die zweiphasigen Scaffolds von der PBS in eine neue 12-Loch-Platte und erwärmen Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in DMEM-Medien, die mit 10 % FCS ergänzt wurden. Entfernen Sie die ergänzten DMEM-Medien und geben Sie auf die Mikrofaserphase der Scaffolds jeweils 15.000 MRC-5-Fibroblastenzellen in 30 Mikrolitern ergänzten DMEM-Medien, um das Eindringen der Fibroblasten in den Scaffold zu unterstützen. Stellen Sie die Platte auf einen Rüttelapparat und schütteln Sie die Scaffolds zwei Stunden lang bei 100 U/min.

Gegeben Sie dann zwei Milliliter DMEM-Ergänzungsmedium zu jedem Scaffold und inkubieren Sie die Scaffolds über Nacht bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium aus den Mulden und drehen die Scaffolds um, sodass die Nanofaserphase der Scaffolds apikal zeigt. Impfen Sie dann 30.000 Cali-3-Epithelzellen in 30 Mikrolitern D-MEM-F12-Medium, ergänzt mit 10 % FCS, auf die Nanofaserphase des Scaffolds an.

Die Gerüste zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, bevor die Gerüste in ein 70-30-Gemisch aus D-M-E-M-F 12 und DMEM ergänztem Medium getaucht und anschließend für weitere 12 Stunden statisch inkubiert werden, um die Atemwegs-Smooth-Muskelzellen zu kultivieren. Zunächst die ausgerichteten Gerüste aus dem PBS in eine frische 12-Loch-Platte überführen und diese zusammen mit dem DMEM ergänzten Medium eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius erwärmen. Das DMEM ergänzte Medium entfernen und je 25.000 Atemwegs-Smooth-Muskelzellen in 30 Mikrolitern DMEM ergänztem Medium auf jedes Gerüst geben, anschließend zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Bringen Sie die Scaffolds nach der Befestigung in mit Medium ergänztem DMEM unter und stellen Sie sie über Nacht in den Inkubator, bevor Sie eine Tri-Kultur im Bioreaktor aufbauen. Am nächsten Tag platzieren Sie den biphasischen Seeding-Scaffold mit der epithelialen Phase nach oben gerichtet in die Kammer des Bioreaktors.

Platzieren Sie dann das ausgerichtete Gerüst unterhalb des biphasischen Gerüsts, sodass es an die Mikrofaserphase des biphasischen Gerüsts angrenzt. Verriegeln Sie die beiden Kammern des Bioreaktors miteinander. Bauen Sie anschließend zwei Perfusionsflusskreisläufe wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben in einem Inkubator zusammen und pumpen Sie nach einer Woche mit einer peristaltischen Pumpe das Medium durch die beiden Kreisläufe mit etwa 0,1 Milliliter pro Minute.

Entfernen Sie das Medium aus der apikalen Kammer und kultivieren Sie die epithelialen Zellen eine zusätzliche Woche lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, bevor die Analyse erfolgt. Nach zwei Wochen im Bioreaktor wurde das hier gezeigte Dreikultur-Gerüst fixiert und geschnitten, um die Kerne der Zellen darzustellen, die in allen drei Schichten des Konstrukts verteilt sind. Die Zellkerne wurden mit DPI gefärbt und erscheinen blau, während das Gerüstmaterial grau erscheint. Hier sind Aufnahmen aus dem Rasterelektronenmikroskop der elektrogesponnenen Nanofaser-Mikrofaser- und ausgerichteten Gerüste, die zur Aussaat von epithelialen Zellen, Fibroblasten bzw. glatten Muskelzellen vorbereitet wurden.

Alle drei Zelltypen zeigten über einen Zeitraum von zwei Wochen hinweg eine erhöhte Vitalität, wenn sie auf ihren jeweiligen Gerüsten kultiviert wurden. Zudem behielten sie nach der zweiwöchigen Kultivierungsphase die Expression zelltypspezifischer Proteine bei. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die native extrazelluläre Matrix zu erforschen, die Sie mit den Elektrospinnfasern nachbilden möchten.

Zellen verhalten sich unterschiedlich, wenn sie an verschiedene 3D-Topographien anhaften. Beispielsweise bilden epitheliale Zellen nur dann eine funktionelle Barriere aus, wenn sie auf Nanofasern kultiviert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie ein mehrschichtiges Ko-Kultursystem aufgebaut wird, das zur Untersuchung zellulärer Interaktionen in einem dynamischen Kulturmilieu verwendet werden kann.

Vergessen Sie nicht, dass es wichtig ist, die Parameter des Elektrospinnens, wie Durchflussrate und Spannung, an das jeweilige Polymer- und Lösungsmittelsystem anzupassen, das Sie bei diesem Verfahren verwenden möchten. Dies ist entscheidend, um die gewünschten Fasern zu erzeugen. Außerdem sollten Sie das Elektrospinnen stets in einem belüfteten Abzug oder Schrank durchführen, um eine ordnungsgemäße Absaugung der Lösungsmittel zu gewährleisten.